インビボ マウス海馬におけるミクログリアの慢性二光子イメージング

すべての動物実験は、東京大学動物倫理委員会および遺伝子組換え実験安全委員会の方針に従って承認され、実施されました。生後2〜4ヶ月の雄および雌両方のCX3CR1−GFPマウスを実験に使用した。実験者の安全と無菌状態の維持のために、すべての手順は白衣、マスク、および滅菌手袋で行われました。すべての器具は使用前に滅菌されました。 1.器具や動物の準備 ガラス底の金属管を組み立てます(図1A)。カスタムメイドのステンレスチューブ(外径3.0mm、内径2.8mm、高さ1.7mm)の一端にUV硬化型光学用接着剤を少量塗布します。チューブの円形の端に接着剤を均一に広げます。注意: チューブの端全体を覆うのに十分な量の接着剤を使用する必要があります。 円形のガラスカバースリップ(直径3.0 mm、厚さ0.15 ± 0.02 mm)を金属管の接着剤で覆われた端に置き、チューブとガラスの間の隙間が接着剤で満たされるようにカバーガラスをチューブに軽く押し付けます。次に、金属管の外縁内に収まるようにガラスの位置を調整します。 接着剤を硬化させるのに十分な時間、ガラスにUV光を照射します。注意: ガラスとチューブが完全に取り付けられていることを確認してください。接着が不十分な場合、手術後にガラスが剥がれ、画像化の失敗や脳脊髄液(CSF)の漏出を引き起こす可能性があります。 組み立てたガラス底金属管を70%エタノールで消毒し、滅菌生理食塩水で洗浄して破片を取り除きます。 乾熱滅菌器ですべての手術器具を滅菌します。 窓植え替えの手術のためにマウスを準備します。注:マウスは適切な年齢である必要があります。CA1および歯状回(DG)において蛍光タンパク質を発現するように遺伝子操作されていることが好ましい。これらの点については、「ディスカッション」セクションで詳しく説明します。 2.麻酔と頭の固定 ケタミン-キシラジン(100 mg / kgケタミンおよび10 mg / kgキシラジン)の腹腔内注射によってマウスを麻酔します。.術前鎮痛のためにメロキシカム(2 mg / kg)を皮下注射で投与します。.適切な麻酔深度を確保するために、尾をつまむなどの痛みを伴う刺激に対する反応の消失を確認します。手術中に麻酔が切れるたびに、通常は最初の投与から1時間後、その後30分ごとに、ケタミン-キシラジンの半分の用量を追加します。.体の下に加熱パッドを使用して熱サポートを提供し、眼科用軟膏を目に塗布して麻酔下での乾燥を防ぎます。注:手術のための麻酔の選択は不可欠です。この点については、「ディスカッション」セクションで詳しく説明します。 頭皮から髪を取り除くために脱毛クリームを適用します。ポビドンヨードスクラブとそれに続くアルコールで頭皮を円を描くように数回消毒します。滅菌防水パッドで準備された手術プラットフォームにマウスを置き、滅菌ドレープを適用して手術部位を固定します。その後、頭頂骨と後頭骨が手術側で完全に露出するようにメスで頭皮を円形に切断して除去します。 皮下結合組織を綿棒でこすりながら、滅菌生理食塩水を塗布して出血を取り除きます。丸い先端のミニチュアナイフで頭蓋表面をそっとこすり、骨膜を取り除き、セメントと骨の間の接着を強化するのに役立ちます(ステップ2.6を参照)。 歯科用エッチング材料を全面に塗布し、数十秒間待ってから、十分な滅菌生理食塩水ですすいでください。 防水インクを使用して、除去する骨の領域(直径3.0 mmの円形の領域、ブレグマの後方約2.5 mm、横方向2.5 mmを中心に)をマークします。マーキング後、頭蓋骨の表面を完全に乾かします。注:開頭術の位置は海馬のサイズに依存し、さまざまな年齢に合わせて最適化する必要があります。開頭術の位置に関する有用な指標を以下に示します(ステップ3.4.5、注を参照)。 厚さ1.0mm、中央に直径5.0mmの穴が開いた長方形のアルミ板を、製造元の指示に従って歯科用レジンセメントを使用して頭蓋骨に取り付けます。プレートの中央にある穴をペンでマークされた円形の領域に注意深く合わせ(手順2.5を参照)、アルミニウムプレートが頭蓋骨のマークされた表面と平行になるようにします(図1B)。セメントがプレートと骨の間のすべての隙間をしっかりと密閉していることを確認してください。セメントが十分に硬化するまで約5分間待ちます。 付属のプレートを介して、角度調整器付きのヘッド保持装置 に マウスを置きます。 3.観察窓の埋め込み 注:以下の外科的処置は、実体顕微鏡下で実行する必要があります。 直径3.0 mmの真皮パンチを使用して頭蓋骨に円形の溝を作ります。円形の溝と手順2.5でペンでマークされた領域を揃えます。溝の深さが徐々に増加するように、穏やかな圧力でダーマルパンチをひねります。溝の深さが全周にわたって一定であることを頻繁に確認してください。 真皮パンチが頭蓋骨の最内層に到達したら、下にある硬膜に触れる前に、30 Gの針を使用して中央の骨島をそっと持ち上げます。注意: 溝の底からのわずかな液体の漏れは、溝がデュラに近いことを示しています。 硬膜ピッカーを使用して硬膜を取り除きます。注:頭蓋窓内の硬膜を完全に除去する必要があり、細かい鉗子を使用して末梢の残留硬膜を慎重に切除する必要があります。 組織を穏やかに吸引して、吸引器に接続された23 Gまたは25 Gの鈍い針で海馬の肺胞を露出させます。注意: この手順は、イメージングを成功させるために最も重要です。組織吸引のための重要な技術的ポイントは、ディスカッションセクションで詳細に説明されています。ピアとピアル血管を吸引します。 皮質組織を表面から吸引します。露出した組織表面の深さを頭蓋窓全体で均一に保ちます。外部カプセルの繊維が露出するまで、吸引を徐々に深めます。 吸引チップを、頭蓋窓の吻側端にある側脳室(LV)近くの外部カプセルに慎重に配置します。尾側から吻側方向に走る外嚢の表層を取り除き、次に中外側方向に走る内層を取り除きます。注:LV近くの外部カプセルは、下にある構造から簡単に取り外すことができます。 肺胞の表面と背側海馬交連(DHC)の完全な露出をチェックして、外部カプセル全体の除去を確認します。注意: DHCはCA1の尾側部分をカバーしています。肺胞とDHCは、繊維配向によって外部カプセルと区別できます。すなわち、肺胞およびDHC内の繊維は、吻内側から尾側方向に走り、外部カプセル内の線維と区別することができる。肺胞とDHCはCA1にしっかりと取り付けられており、損傷してはなりません。残っている破片はガラスカバーガラスが肺胞に直接接触するのを妨げるので、外部カプセルのすべての破片は取り除かれるべきです。 出血が完全に止まったことを確認し、頭蓋骨表面の高さまで滅菌生理食塩水で穴を埋めます。注意: ここでの視野は、穴がマウスの特定の年齢に適した位置にあるかどうかを判断するのに役立ちます。理想的には、肺胞とその基盤となるCA1が中央領域の大部分を占める必要があります。DHCの一部は尾状領域に見えます。LVの開口部は吻側端で検出可能です(図3A)。 ガラス底部が肺胞を軽く押して下にあるCA1を部分的に平らになるまで、管の側面から溢れる余分な水を吸引しながら、ガラス底の金属管(手順1.1を参照)を穴に垂直に挿入します。注意: この圧力は適切に調整する必要があります。強すぎると、CA1が損傷します。弱すぎると、CA1の曲率による球面収差により、深部構造物の撮像分解能が低下します。 歯科用レジンセメントを使用して、挿入したチューブの壁を周囲の頭蓋骨に固定します(図1C)。全周がしっかりと密閉されており、空気やCSFの漏れがないことを確認してください。セメントが固まるまで約5分待ちます。注:粘度が低いときにセメントを配置すると、チューブと頭蓋骨の間の隙間から脳実質に漏れ、脳に損傷を与える可能性があります。したがって、セメントは重合開始後に塗布する必要があり、これにより粘度が上昇し、隙間からの漏れが減少します。 プレート全体、頭蓋骨、およびチューブの内側を滅菌生理食塩水で洗浄して、破片を取り除きます。 4. 手術の質チェックのための手術直後の二光子顕微鏡 マウスを2光子顕微鏡の対物レンズの下にあるヘッド保持装置と電動XYスキャンステージにセットします。熱サポートには加熱パッドを使用してください。この品質チェックには最大30分かかる場合があるため、ステップ2.1で説明されているように麻酔の深さを監視および調整します。注:作動距離(WD)が3mmより長く、開口数(NA)が高い水浸対物レンズをお勧めします。対物レンズの補正環は、ガラスと生体材料との間の屈折率の不一致を補正することによって解像度を向上させることができる。 ガラスと対物レンズの間のスペースを水で満たし、気泡が入らないように特別な注意を払ってください。必要に応じて、より多くの水を保持するプラスチックフィルムを使用して金属板の領域を拡大し、対物レンズのフロントレンズ全体を覆います。 脳内で発現する蛍光プローブの励起のために波長920nmのフェムト秒パルスレーザーをオンにし、画像取得ソフトウェアを起動します。 電動ステージと電動フォーカスシステムを使用して、CA1にフォーカスを調整します。パルスレーザーによる連続照明下で、脳実質から放出される蛍光と金属管の端からの反射光のガイダンスでターゲット構造を配置します。 電動フォーカスシステムで焦点を調整することにより、ガラス底に触れる脳実質の深さを測定します。異なる水平位置の深さを比較して、ガラス底面と撮像面の位置合わせを判断します。ガラス底部が撮像面と平行になるようにヘッド保持装置を傾けて、マウスヘッドの角度を調整します。 対物レンズの補正環を調整して、CA1のターゲット構造の深さで最高の解像度を達成します。 ガラス底面から500μmの深さにあるDG上羽根の分子層(ML)中の蛍光細胞が全視野で撮像できることを確認します。注:このステップは、手術の質を判断する上で重要です。CA1が損傷している場合、限局性脳浮腫は表面から200μm以上の深さで蛍光検出を妨げます。CA1に損傷がなく、CA1層の湾曲が上にあるカバーガラスによって適切に平坦化されている場合にのみ、DG信号を手術直後に検出できます(図2A-D)。代表結果セクションでは、CA1 と DG の境界を簡単に判別できます。 5.術後ケア チューブ内の水を吸引し、破片が入らないようにプラスチックシールで覆います。 マウスを暖かく保ち、麻酔からの回復を待ちます。 マウスが痛みに関連する行動を示す限り、24時間ごとにメロキシカム(2 mg / kg)を皮下投与します。. 術後マウスを個々の住居で数週間飼育します。 6. CX3CR1-GFPマウスを用いたミクログリアのin vivo 慢性二光子イメージング 麻酔導入後、金属管内を滅菌生理食塩水で洗浄し、ゴミを取り除きます。海馬の白い肺胞がガラスを通して見え(図3A)、術後出血などの合併症がないことを確認してください。 手順4.1から4.6に従って、マウスを2光子顕微鏡の下に置きます。 海馬の2光子励起によって得られた画像の品質と強度を確認します(図3B)。術後浮腫の減少後に撮影された画像が、手術当日に撮影されたものと同等またはそれ以上であることを確認してください(図2A、ステップ4.5を参照)。注:画像の劣化は、脳内の組織損傷の存在を示します。 ミクログリアがすでに分岐形態を回復していることを確認してください(図3C)。注:ミクログリアのイメージングデータは、ミクログリアが基底状態に戻るには少なくとも3〜4週間かかることを示しています。 実験の特定の目的のためにCA1の任意の層で in vivo イメージングを実行します。