JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
العربية

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neuroscience

في الجسم الحي التصوير المزمن ثنائي الفوتون للخلايا الدبقية الصغيرة في قرن آمون الفأر

Published: July 06, 2022
doi:
10.3791/64104
, , ,
1Department of Cellular Neurobiology, Graduate School of Medicine,The University of Tokyo

Summary

تصف هذه الورقة طريقة للمراقبة المزمنة في الجسم الحي للخلايا الدبقية الصغيرة أثناء الراحة في الحصين CA1 للفأر باستخدام الجراحة التي يتم التحكم فيها بدقة والفحص المجهري ثنائي الفوتون.

Abstract

تشارك الخلايا الدبقية الصغيرة ، وهي الخلايا المناعية الوحيدة المقيمة في الدماغ ، بنشاط في صيانة الدوائر العصبية عن طريق تعديل نقاط الاشتباك العصبي واستثارة الخلايا العصبية. كشفت الدراسات الحديثة عن التعبير الجيني التفاضلي وعدم التجانس الوظيفي للخلايا الدبقية الصغيرة في مناطق مختلفة من الدماغ. قد تترافق الوظائف الفريدة للشبكة العصبية الحصين في التعلم والذاكرة مع الأدوار النشطة للخلايا الدبقية الصغيرة في إعادة تشكيل المشبك. ومع ذلك ، فإن الاستجابات الالتهابية التي تسببها العمليات الجراحية كانت مشكلة في التحليل المجهري ثنائي الفوتون للخلايا الدبقية الصغيرة الحصينية. هنا ، يتم تقديم طريقة تمكن من المراقبة المزمنة للخلايا الدبقية الصغيرة في جميع طبقات الحصين CA1 من خلال نافذة التصوير. تسمح هذه الطريقة بتحليل التغيرات المورفولوجية في العمليات الدبقية الصغيرة لأكثر من 1 شهر. يتطلب التصوير طويل المدى وعالي الدقة للخلايا الدبقية الصغيرة أثناء الراحة إجراءات جراحية طفيفة التوغل ، واختيار العدسة الموضوعية المناسبة ، وتقنيات التصوير المحسنة. قد تمنع الاستجابة الالتهابية العابرة للخلايا الدبقية الصغيرة الحصين التصوير مباشرة بعد الجراحة ، لكن الخلايا الدبقية الصغيرة تستعيد مورفولوجيتها الهادئة في غضون أسابيع قليلة. علاوة على ذلك ، يسمح لنا تصوير الخلايا العصبية في وقت واحد مع الخلايا الدبقية الصغيرة بتحليل تفاعلات أنواع الخلايا المتعددة في الحصين. قد توفر هذه التقنية معلومات أساسية حول وظيفة الخلايا الدبقية الصغيرة في الحصين.

Introduction

الخلايا الدبقية الصغيرة هي الخلايا المناعية الوحيدة والبلاعم النسيجية المقيمة في الدماغ. بالإضافة إلى وظائفها كخلايا مناعية ، مثل الاستجابة السريعة للالتهابات ، فقد ثبت أنها تلعب مجموعة متنوعة من الأدوار الفسيولوجية في صيانة وإعادة تشكيل الدوائر العصبية ، مثل التقليم المشبكي ، وتنظيم اللدونة المشبكية ، والتحكم في النشاط العصبي1،2،3،4،5. التفاعلات الفسيولوجية بين الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا العصبية ذات أهمية متزايدة في كل من تطوير الدوائر العصبية وعلم الأعصاب المرضي. يتطلب تحليل فسيولوجيا الخلايا الدبقية الصغيرة في الجسم الحي طرقا لمراقبة الخلايا الدبقية الصغيرة دون تلف الأنسجة والاستجابات الالتهابية. ومع ذلك ، فإن الخلايا الدبقية الصغيرة حساسة للالتهابات وتغير أشكالها ووظائفها بشكل كبير استجابة لتلف الأنسجة 6,7.

يعد التصوير ثنائي الفوتون في الجسم الحي أداة مثالية لالتقاط الديناميات الفسيولوجية للخلايا الدبقية الصغيرة8. كشفت التطبيقات الأولية للتصوير ثنائي الفوتون في الجسم الحي عن الحركة الديناميكية لعمليات الخلايا الدبقية الصغيرة للمراقبة البيئية في قشرة الفئران البالغة 9,10. وسعت دراسات التصوير ثنائية الفوتون التالية المراقبة في الجسم الحي للخلايا الدبقية الصغيرة لتحليل التفاعلات الوظيفية والهيكلية مع الخلايا العصبية5،11،12،13،14. ومع ذلك ، فقد اقتصر عمق التصوير للفحص المجهري التقليدي ثنائي الفوتون على أقل من 1 مم من سطح الدماغ15,16. يفسر هذا القيد ندرة الدراسات السابقة التي أبلغت عن سلوك الخلايا الدبقية الصغيرة في مناطق الدماغ العميقة ، مثل الحصين.

كشفت دراسات تسلسل الحمض النووي الريبي الحديثة عن عدم تجانس إقليمي كبير للخلايا الدبقية الصغيرة ، مما يزيد من إمكانية وجود أدوار وظيفية متميزة17،18،19،20،21. لذلك ، من الضروري تسجيل التفاعلات الدبقية الصغيرة مع الخلايا العصبية في مناطق مختلفة من الدماغ ، لكن الصعوبات التقنية أعاقت مثل هذه الدراسات. على وجه الخصوص ، تم الإبلاغ عن المشاركة النشطة للخلايا الدبقية الصغيرة في إعادة تشكيل المشبك العصبي لتكون حاسمة في تطوير الشبكة العصبية الحصين ووظائفها المتعلقة بالذاكرة22,23. ومع ذلك ، لم تكن الطرق الفعالة لمراقبة الخلايا الدبقية الصغيرة الحصينية دون منازع في الجسم الحي متاحة.

يشرح هذا البروتوكول إجراءات المراقبة المزمنة في الجسم الحي للخلايا الدبقية الصغيرة أثناء الراحة في CA1 من الحصين الظهري باستخدام تقنيات جراحية يتم التحكم فيها بدقة. مكن التصوير ثنائي الفوتون لمنطقة CA1 في الفئران CX3CR1-GFP (CX3CR1 + / GFP) ، والتي تعبر عن GFP في الخلايا الدبقية الصغيرة24 ، من مراقبة الخلايا الدبقية الصغيرة المتشعبة في جميع طبقات CA1 بدقة كافية. يتضمن البروتوكول عدة نصائح لزرع نافذة المراقبة بنجاح وظروف التصوير المناسبة. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تقديم التصور المتزامن للخلايا العصبية الهرمية والخلايا الدبقية الصغيرة في CA1 كمثال تطبيقي. كما تتم مناقشة مزايا وقيود وإمكانات هذه التقنية.

Protocol

تمت الموافقة على جميع التجارب على الحيوانات وتنفيذها وفقا لسياسات لجنة أخلاقيات الحيوان ولجنة سلامة التجارب الوراثية المؤتلفة في جامعة طوكيو. تم استخدام كل من ذكور وإناث الفئران CX3CR1-GFP ، الذين تتراوح أعمارهم بين 2-4 أشهر ، في التجارب. من أجل سلامة المجربين والحفاظ على الظروف المعقمة ، تم تنفيذ جميع الإجراءات باستخدام المعاطف البيضاء والأقنعة والقفازات المعقمة. تم تعقيم جميع الأدوات قبل الاستخدام. 1. إعداد الأدوات والحيوانات قم بتجميع أنبوب معدني ذو قاع زجاجي (الشكل 1 أ).ضع قطرة صغيرة من المادة اللاصقة البصرية المعالجة بالأشعة فوق البنفسجية على أحد طرفي أنبوب غير قابل للصدأ مصنوع خصيصا (القطر الخارجي 3.0 مم ، القطر الداخلي 2.8 مم ، الارتفاع 1.7 مم). انشر الغراء على الحافة الدائرية للأنبوب بشكل موحد.ملاحظة: يجب استخدام كمية كافية من المادة اللاصقة لتغطية حافة الأنبوب بالكامل. ضع غطاء زجاجي دائري (قطر 3.0 مم ، سمك 0.15 ± 0.02 مم) على الطرف المغطى بالغراء للأنبوب المعدني ، واضغط برفق على غطاء الغطاء مقابل الأنبوب بحيث تمتلئ الفجوة بين الأنبوب والزجاج بالغراء. بعد ذلك ، اضبط موضع الزجاج ليتناسب مع الحافة الخارجية للأنبوب المعدني. قم بإشعاع الزجاج بضوء الأشعة فوق البنفسجية لفترة كافية لعلاج المادة اللاصقة.ملاحظة: تأكد من توصيل الزجاج والأنبوب بالكامل. إذا كان الالتصاق غير كاف ، فقد ينفصل الزجاج بعد الجراحة ، مما يؤدي إلى تصوير غير ناجح أو تسرب السائل النخاعي (CSF). قم بتطهير الأنبوب المعدني ذو القاع الزجاجي المجمع بنسبة 70٪ من الإيثانول واغسله بمحلول ملحي معقم لإزالة الحطام. تعقيم جميع الأدوات الجراحية مع معقم الحرارة الجافة. تحضير الفئران لجراحة زرع النوافذ.ملاحظة: يجب أن تكون الفئران في سن مناسب. من الأفضل أن يتم هندستها وراثيا للتعبير عن البروتينات الفلورية في CA1 والتلفيف المسنن (DG). يتم شرح هذه النقاط بمزيد من التفصيل في قسم المناقشة. 2. التخدير وتثبيت الرأس تخدير فأر عن طريق الحقن داخل الصفاق للكيتامين-زيلازين (100 مغ/كغ من الكيتامين و10 ملغ/كغ من الزيلازين). يجب تطبيق ميلوكسيكام (2 ملغ/ كغ) عن طريق الحقن تحت الجلد للكشف عن التسكين قبل الجراحة. تأكد من اختفاء الاستجابة للمنبهات المؤلمة ، مثل قرص الذيل لضمان عمق التخدير الكافي. أضف نصف جرعة من الكيتامين-زيلازين في كل مرة يزول فيها التخدير أثناء الجراحة ، عادة بعد 1 ساعة من الإعطاء الأولي وكل 30 دقيقة بعد ذلك. استخدم وسادة تدفئة تحت الجسم لتوفير الدعم الحراري وتطبيق مرهم العيون على العينين لمنع الجفاف تحت التخدير.ملاحظة: اختيار التخدير للجراحة أمر ضروري. تتم مناقشة هذه النقطة بالتفصيل في قسم المناقشة. ضع كريم مزيل الشعر لإزالة الشعر من فروة الرأس. تطهير فروة الرأس عدة مرات في حركة دائرية مع فرك البوفيدون اليود تليها الكحول. ضع الماوس على المنصة الجراحية المحضرة بوسادة معقمة مقاومة للماء وقم بتطبيق ستائر معقمة لتأمين موقع الجراحة. بعد ذلك ، قم بقص وإزالة فروة الرأس بشكل دائري باستخدام مشرط بحيث يتم كشف العظام الجدارية والقذالية بالكامل على الجانب الجراحي. قم بإزالة النسيج الضام تحت الجلد عن طريق فركه بقطعة قطن أثناء وضع محلول ملحي معقم لإزالة النزيف. كشط سطح الجمجمة برفق بسكين مصغر مستدير لإزالة السمحاق ، مما يساعد على تقوية الالتصاق بين الأسمنت والعظم (انظر الخطوة 2.6). ضع مادة حفر الأسنان على السطح بالكامل ، وانتظر عشرات الثواني ، واشطفها بمحلول ملحي معقم كاف. باستخدام حبر مقاوم للماء ، حدد منطقة العظم المراد إزالتها (منطقة دائرية بقطر 3.0 مم ، تتمركز حوالي 2.5 مم خلفيا و 2.5 مم جانبيا للبريجما). بعد وضع العلامات ، جفف سطح الجمجمة جيدا.ملاحظة: يعتمد موضع حج القحف على حجم الحصين ويجب تحسينه لمختلف الأعمار. سيتم عرض مؤشرات مفيدة لموضع حج القحف أدناه (انظر الخطوة 3.4.5 ، ملاحظة). قم بتوصيل صفيحة الألمنيوم المستطيلة بسمك 1.0 مم وبفتحة قطرها 5.0 مم في المركز بالجمجمة باستخدام أسمنت راتنج الأسنان وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.قم بمحاذاة الفتحة الموجودة في وسط اللوحة بعناية مع المنطقة الدائرية المميزة بقلم (انظر الخطوة 2.5) بحيث تكون لوحة الألمنيوم موازية للسطح المحدد للجمجمة (الشكل 1 ب). تأكد من أن الأسمنت يسد بإحكام جميع الفجوات بين اللوحة والعظم. انتظر حوالي 5 دقائق حتى يصلب الأسمنت بدرجة كافية. ضع الماوس على جهاز تثبيت الرأس مع أدوات ضبط الزاوية عبر اللوحة المرفقة. 3. زرع نافذة المراقبة ملاحظة: يجب إجراء العمليات الجراحية التالية تحت المجهر المجسم. اصنع أخدودا دائريا على الجمجمة باستخدام لكمة جلدية بقطر 3.0 مم. قم بمحاذاة الأخدود الدائري والمنطقة المحددة بقلم في الخطوة 2.5. تحريف لكمة الجلد مع ضغط لطيف بحيث يزيد عمق الأخدود تدريجيا. تحقق بشكل متكرر من أن عمق الأخدود ثابت على المحيط بأكمله. عندما تصل اللكمة الجلدية إلى الطبقة الأعمق من الجمجمة ، قبل لمس الجافية الأساسية ، ارفع الجزيرة العظمية المركزية برفق باستخدام إبرة 30 جرام.ملاحظة: يشير تسرب السائل الطفيف من أسفل الأخدود إلى أن الأخدود قريب من الجافية. قم بإزالة الجافية باستخدام منتقي الجافية.ملاحظة: الإزالة الكاملة للجافية داخل نافذة الجمجمة ضرورية وستتطلب استئصالا دقيقا للجافية المتبقية في المحيط باستخدام ملقط دقيق. قم بشفط الأنسجة برفق لفضح الحويصلات الهوائية في الحصين بواسطة 23 جم أو 25 جم من الإبر الحادة المتصلة بالشافطة.ملاحظة: هذه الخطوة هي الأكثر أهمية للتصوير الناجح. يتم وصف النقاط الفنية الرئيسية لشفط الأنسجة بالتفصيل في قسم المناقشة.نضح الحنون والأوعية pial. نضح الأنسجة القشرية من السطح. حافظ على عمق سطح الأنسجة المكشوف متجانسا على نافذة الجمجمة بأكملها. تعميق الطموح تدريجيا حتى تتعرض ألياف الكبسولة الخارجية. ضع طرف الشفط بعناية على الكبسولة الخارجية بالقرب من البطين الجانبي (LV) الموجود في الطرف الوردي الجانبي لنافذة الجمجمة. قم بإزالة الطبقة السطحية للكبسولة الخارجية التي تعمل في الاتجاه الذيلي إلى الاتجاه الوردي الجانبي ، ثم الطبقة الداخلية التي تعمل في الاتجاه المتوسط الجانبي.ملاحظة: يمكن إزالة الكبسولة الخارجية بالقرب من الجهد المنخفض بسهولة من الهيكل الأساسي. تأكد من إزالة الكبسولة الخارجية بأكملها عن طريق التحقق من التعرض الكامل لسطح الحويصلات الهوائية والحصين الظهري (DHC).ملاحظة: يغطي DHC الجزء الذيلي من CA1. يمكن تمييز الحويصلات الهوائية و DHC عن الكبسولة الخارجية من خلال توجهاتها الليفية. وهي الألياف الموجودة داخل الحويصلات الهوائية و DHC تعمل في الاتجاه الوردي إلى الاتجاه الذيلي الجانبي ، ويمكن تمييزها عن الألياف الموجودة في الكبسولة الخارجية. ترتبط الحويصلات الهوائية و DHC بإحكام ب CA1 ويجب ألا تتلف. يجب إزالة جميع شظايا الكبسولة الخارجية ، لأن أي شظايا متبقية ستمنع الاتصال المباشر للغطاء الزجاجي بالحنويصلات الهوائية. تأكد من أن النزيف قد توقف تماما واملأ الحفرة بمحلول ملحي معقم إلى مستوى سطح الجمجمة.ملاحظة: يساعد مجال الرؤية هنا في الحكم على ما إذا كان الثقب في الموضع المناسب للعمر المحدد للماوس. من الناحية المثالية ، يجب أن تشغل الحويصلات الهوائية و CA1 الأساسية معظم المنطقة الوسطى. يمكن رؤية جزء من DHC في المنطقة الذيلية. يمكن اكتشاف فتحة LV عند الحافة الوردية الجانبية (الشكل 3 أ). أدخل الأنبوب المعدني ذو القاع الزجاجي (انظر الخطوة 1.1) عموديا في الفتحة أثناء شفط الماء الزائد الذي يفيض من جوانب الأنبوب حتى يضغط الجزء السفلي الزجاجي برفق على الحويصلات الهوائية ويسوي جزئيا CA1 الأساسي.ملاحظة: يجب ضبط هذا الضغط بشكل مناسب. إذا كان قويا جدا ، فسوف يتلف CA1. إذا كان ضعيفا جدا ، فإن الانحراف الكروي الناتج عن انحناء CA1 سيضعف دقة التصوير في الهياكل العميقة. باستخدام أسمنت راتنج الأسنان ، ثبت جدار الأنبوب المدرج في الجمجمة المحيطة (الشكل 1C). تأكد من أن المحيط بأكمله مغلق بإحكام وأنه لا يوجد تسرب للهواء أو السائل الدماغي النخاعي. انتظر لمدة 5 دقائق حتى يتصلب الأسمنت.ملاحظة: إذا تم وضع الأسمنت عندما تكون لزوجته منخفضة ، فقد يتسرب إلى حمة الدماغ من خلال الفجوة بين الأنبوب والجمجمة ويتلف الدماغ. لذلك ، يجب تطبيق الأسمنت بعد بدء البلمرة ، مما يزيد من اللزوجة ويقلل من التسرب عبر الفجوة. اغسل اللوحة بأكملها والجمجمة وداخل الأنبوب بمحلول ملحي معقم لإزالة الحطام. 4. الفحص المجهري ثنائي الفوتون مباشرة بعد الجراحة لفحص جودة الجراحة اضبط الماوس في جهاز إمساك الرأس تحت العدسة الشيئية للمجهر ثنائي الفوتون وعلى مرحلة المسح الضوئي XY الآلية. استخدم وسادة تدفئة للدعم الحراري. راقب واضبط عمق التخدير كما هو موضح في الخطوة 2.1 ، حيث قد يستغرق فحص الجودة هذا ما يصل إلى 30 دقيقة.ملاحظة: يوصى باستخدام العدسة الموضوعية للغمر بالماء ذات مسافة العمل (WD) الأطول من 3 مم وفتحة العدسة العددية العالية (NA). يمكن لطوق التصحيح للعدسة الشيئية تحسين الدقة عن طريق تعويض عدم تطابق معامل الانكسار بين الزجاج والمواد الحيوية. املأ الفراغ بين الزجاج والعدسة الشيئية بالماء ، مع الحرص بشكل خاص على تجنب فقاعات الهواء. إذا لزم الأمر ، قم بتوسيع مساحة اللوحة المعدنية باستخدام فيلم بلاستيكي ، يحتوي على المزيد من الماء ، لتغطية العدسة الأمامية الكاملة للهدف. قم بتشغيل ليزر نابض فيمتو ثانية بطول موجي 920 نانومتر لإثارة مجسات الفلورسنت المعبر عنها في الدماغ وابدأ برنامج الحصول على الصور. اضبط التركيز البؤري على CA1 باستخدام المرحلة الآلية ونظام التركيز البؤري الآلي. ضع الهيكل المستهدف بتوجيه من التألق المنبعث من حمة الدماغ والضوء المنعكس من حافة الأنبوب المعدني تحت الإضاءة المستمرة بواسطة الليزر النبضي. قم بقياس أعماق حمة الدماغ التي تلامس القاع الزجاجي عن طريق ضبط التركيز باستخدام نظام التركيز الآلي. قارن الأعماق في مواقع أفقية مختلفة للحكم على محاذاة القاع الزجاجي ومستوى التصوير.اضبط زاوية رأس الماوس عن طريق إمالة جهاز تثبيت الرأس حتى يتم ضبط الجزء السفلي الزجاجي ليكون موازيا لمستوى التصوير. اضبط طوق التصحيح للهدف لتحقيق أعلى دقة عند عمق الهيكل المستهدف في CA1. تأكد من أن الخلايا الفلورية في الطبقة الجزيئية (ML) للشفرة العلوية DG على عمق 500 ميكرومتر من القاع الزجاجي يمكن تصويرها في مجال الرؤية بأكمله.ملاحظة: هذه الخطوة مهمة في الحكم على جودة الجراحة. في حالة تلف CA1 ، تمنع وذمة الدماغ البؤرية اكتشاف التألق على عمق يزيد عن 200 ميكرومتر من السطح. فقط عندما لا يكون هناك ضرر ل CA1 ، ويتم تسطيح انحناء طبقات CA1 بشكل صحيح بواسطة غطاء الغطاء العلوي ، يمكن اكتشاف إشارات DG مباشرة بعد الجراحة (الشكل 2A-D). يوفر قسم النتائج التمثيلية طريقة بسيطة لتحديد الحدود بين CA1 و DG. 5. رعاية ما بعد الجراحة قم بشفط الماء داخل الأنبوب وقم بتغطيته بختم بلاستيكي لمنع دخول الحطام. حافظ على دفء الماوس وانتظر الشفاء من التخدير. تطبيق ميلوكسيكام (2 ملغ/كغ) تحت الجلد كل 24 ساعة طالما أن الفأر يظهر سلوكا مرتبطا بالألم. رفع الماوس بعد العملية الجراحية في السكن الفردي لعدة أسابيع. 6. التصوير المزمن ثنائي الفوتون في الجسم الحي للخلايا الدبقية الصغيرة باستخدام الفئران CX3CR1-GFP بعد تحريض التخدير ، اغسل الجزء الداخلي من الأنبوب المعدني بمحلول ملحي معقم لإزالة الحطام. تأكد من أن الحويصلات الهوائية البيضاء للحصين مرئية من خلال الزجاج (الشكل 3 أ) ولا توجد مضاعفات مثل النزيف بعد العملية الجراحية. اضبط الماوس تحت المجهر ثنائي الفوتون باتباع الخطوات من 4.1 إلى 4.6. تحقق من جودة وشدة الصور التي تم الحصول عليها عن طريق إثارة الفوتون للحصين (الشكل 3 ب). تأكد من أن الصور الملتقطة بعد الحد من الوذمة بعد الجراحة قابلة للمقارنة أو أفضل من تلك التي تم التقاطها في يوم الجراحة (الشكل 2 أ ، انظر الخطوة 4.5).ملاحظة: يشير تدهور الصورة إلى وجود تلف في الأنسجة داخل الدماغ. تأكد من أن الخلايا الدبقية الصغيرة قد استعادت بالفعل مورفولوجيتها المتشعبة (الشكل 3C).ملاحظة: تشير بيانات تصوير الخلايا الدبقية الصغيرة إلى أن هناك حاجة إلى 3-4 أسابيع على الأقل حتى تعود الخلايا الدبقية الصغيرة إلى حالتها القاعدية. قم بإجراء التصوير في الجسم الحي في أي طبقات من CA1 لغرض معين من التجربة.

Representative Results

باستخدام هذه التقنية ، يمكن ملاحظة الخلايا الدبقية الصغيرة المتشعبة والهادئة بشكل مزمن داخل جميع طبقات CA1 الظهرية ، بما في ذلك الطبقة oriens (SO) ، والطبقة الهرمية (SP) ، والطبقة الشعاعية (SR) ، والطبقة الثغورية الجزيئية (SLM) ، خاصة بعد 3-4 أسابيع من الجراحة عندما ينحسر الالتهاب. إذا تم إجراء الجراحة بشكل مناسب ، يمكن إجراء التصوير لمدة تصل إلى عدة أشهر بعد الجراحة. يحتوي هذا القسم على ثلاثة مواضيع مفيدة لتقييم التصوير داخل الجسم. أولا ، يتم توفير عينات من الصور مباشرة بعد الجراحة وفي المرحلة المزمنة كمراجع للإجراءات الجراحية والتصويرية المناسبة. ثانيا ، يتم وصف التشكل المميز للخلايا الدبقية الصغيرة ، وشدتها الفلورية ، وتوزيع الأوعية الدموية في طبقات حصين معينة لمساعدة القراء على تقدير عمق التصوير الذي يتراوح من الحويصلات الهوائية إلى DG. ثالثا ، يتم توفير مثال تطبيقي يوضح التصوير المتزامن للخلايا العصبية والخلايا الدبقية الصغيرة. يوضح الشكل 2 الصور التمثيلية للخلايا الدبقية الصغيرة في الفئران CX3CR1-GFP بعد الجراحة مباشرة. إذا لم يكن هناك ضرر واضح ل CA1 وتم تسطيح انحناء طبقات CA1 بشكل صحيح بواسطة الغطاء العلوي ، فإن أعماق التصوير ثنائي الفوتون للخلايا الدبقية الصغيرة تتجاوز طبقات CA1 بأكملها وتصل إلى 500 ميكرومتر من سطح الجراحة ، حيث يوجد ML أو طبقة الخلايا الحبيبية (GCL) من DG (الشكل 2A ؛ انظر الخطوة 4.7 والشكل 4E). الخلايا الدبقية الصغيرة أقل تشعبا قليلا ، خاصة في الطبقة القريبة من السطح الجراحي مقارنة بتلك الموجودة في الحصين السليم. ومع ذلك ، فإنها لا تظهر أي تنشيط بارز ، مما يشير إلى الإجراءات الجراحية المناسبة (الشكل 2 ب). من ناحية أخرى ، فإن الوذمة في CA1 الناتجة عن تلف الأنسجة ستحد من عمق التصوير إلى 200 ميكرومتر (الشكل 2C). يؤدي تلف الأنسجة أيضا إلى تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة غير الطبيعية ، مثل تراكم عمليات الانتفاخ نحو سطح الأنسجة الحرة (الشكل 2D ؛ قارن بالصورة العلوية للشكل 2B). هذه علامات على جراحة غير مناسبة. تظهر الصور التمثيلية للخلايا الدبقية الصغيرة في المرحلة المزمنة بعد أكثر من 3 أسابيع من الجراحة في الشكل 3. يمكن تصوير الخلايا الدبقية الصغيرة مرة أخرى خارج CA1 إلى الطبقات العميقة من DG بكثافة ودقة فلورية أعلى وتوزيع أكثر تجانسا (انظر الخطوة 6.3 ، الشكل 3B). جودة التصوير أفضل من ذلك مباشرة بعد الجراحة (الشكل 2 أ). يمكن تفسير هذا الاختلاف عن طريق انخفاض الوذمة والالتهابات. استعادت الخلايا الدبقية الصغيرة في جميع الطبقات بالفعل مورفولوجيتها المتشعبة (الشكل 3 ج) ، مختلفة عن مظهرها بعد الجراحة (الشكل 2 ب). يكشف التصوير بفاصل زمني للخلايا الدبقية الصغيرة في CA1 عن أجسام الخلايا غير المتحركة والعمليات عالية الحركة للمراقبة (الفيديو 1-2). يشبه سلوكهم المتحرك التقرير السابق لديناميكيات العملية الدبقية الصغيرة في القشرة9. من السهل تحديد طبقات الحصين المصورة بناء على توزيع وعمق أجسام الخلايا العصبية ، باستخدام الفئران التي تعبر عن مجسات الفلورسنت في الخلايا العصبية الحصينية25،26،27. بدون مساعدة المعلومات الموضعية حول أجسام الخلايا العصبية ، توفر الإشارات من الخلايا الدبقية الصغيرة الفلورية وحدها بعض الأدلة لتحديد طبقات الحصين (الشكل 3 ب). تحتوي الخلايا الدبقية الصغيرة في الحويصلات الهوائية على أجسام وعمليات خلوية ممدودة تميل إلى الامتداد على طول المسالك المحورية (الشكل 4 أ). يمكن تمييز الخلايا الدبقية الصغيرة في الطبقات الأخرى من خلال أجسام الخلايا المستديرة والعمليات التي تشع بدون اتجاهات مفضلة. الخلايا الدبقية الصغيرة في SP هي من بين الخلايا العصبية الهرمية المعبأة بكثافة ويمكن تمييزها بكثافة أقل من العمليات الدبقية الصغيرة. يتم تحديد الطبقات أعلى وأسفل SP على أنها SO و SR ، على التوالي (الشكل 4B). ومن المستحيل التمييز بين الإدارة المستدامة للأراضي والآلية المستدامة للأراضي استنادا إلى الخواص الدبقية الصغيرة وحدها. يتم التعرف على الحدود بين CA1 و DG بواسطة الأوعية الدموية السميكة التي تمتد على طول الحدود (الشكل 4C). يمكن التعرف على هذه الأوعية بشكل أفضل من خلال وضع علامات على الأوعية ذات الأصباغ مثل sulforhodamine 101 (SR101 ؛ 5 mM ، 4 μL / g من وزن الجسم) المحقونة داخل الصفاق (الشكل 4D). تنخفض إشارة التألق من الخلايا الدبقية الصغيرة بشكل حاد في DG مقارنة ب CA1 المغطي ، ربما بسبب الاختلاف في معامل الانكسار لهذه الهياكل. قد تساعد هذه الفجوة في شدة التألق أيضا في تحديد الحد بين DG و CA1. كمثال تطبيقي ، يتم عرض التصوير المتزامن للخلايا الدبقية الصغيرة الإيجابية ل GFP والخلايا العصبية الهرمية التي تحمل علامة tdtomato (الشكل 4E). في هذه التجربة ، تلقت الفئران CX3CR1-GFP حقنة من الفيروس المرتبط بالغدي (AAV) للتعبير عن tdTomato في الخلايا العصبية الهرمية الحصينية. سيساعد وضع العلامات العصبية على فهم هياكل الطبقة الدقيقة ل CA1. الشكل 1: رسومات تخطيطية لزرع نافذة المراقبة . (أ) منظر مقطعي للأنبوب المعدني ذو القاع الزجاجي المجمع. يلتصق غطاء زجاجي دائري بأحد طرفي الأنبوب الأسطواني المقاوم للصدأ. (ب) منظر مقطعي عرضي للوحة الألومنيوم المتصلة بالجمجمة. يجب أن تكون اللوحة موازية للسطح المحدد للجمجمة حتى لا تتداخل مع العدسة الموضوعية ، الموضوعة بالقرب من اللوحة للتركيز. ج: عرض مقطعي للأنبوب المزروع. يجب ربط القاع الزجاجي بشكل وثيق بالحويصلات الهوائية في الحصين للضغط برفق على سطح CA1 وتسطيحه. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 2: التصوير في الجسم الحي للخلايا الدبقية الصغيرة في الفئران CX3CR1-GFP مباشرة بعد الجراحة. (أ) إعادة بناء ثلاثية الأبعاد تمثيلية من التصوير CA1 في الجسم الحي لماوس CX3CR1-GFP في يوم ما بعد الجراحة (POD) 0 (العرض: 511 ميكرومتر ، الارتفاع: 511 ميكرومتر ، العمق: 550 ميكرومتر). يمكن تصوير الخلايا الدبقية الصغيرة الفلورية في ML من DG على عمق 500 ميكرومتر من قاع الزجاج من خلال CA1 بأكمله. (ب) تظهر الخلايا الدبقية الصغيرة النموذجية المملوءة ب GFP التي تم الحصول عليها في (A) كإسقاطات الكثافة القصوى (MIPs) لمكدسات الصور بسمك 20 ميكرومتر على أعماق 100 و 300 و 520 ميكرومتر من قاع الزجاج. يمكن اكتشاف مورفولوجيا الخلايا الدبقية الصغيرة من CA1 السطحي إلى ML من DG ، على الرغم من تدهور الصورة الواضح في DG. الخلايا الدبقية الصغيرة خاصة في الطبقة القريبة من سطح الجراحة أقل تشعبا ولكنها لا تظهر أي تنشيط واضح. قضبان مقياس ، 50 ميكرومتر. (C) إعادة بناء صورة 3D التمثيلية ل CA1 التالف جراحيا. تم الحصول على البيانات من ماوس CX3CR1-GFP على POD 0 (العرض: 399 ميكرومتر ، الارتفاع: 399 ميكرومتر ، العمق: 450 ميكرومتر). لا يمكن اكتشاف مضان الخلايا الدبقية الصغيرة إلا حتى عمق 200 ميكرومتر ، على عكس CA1 (A) غير التالف مع الخلايا الدبقية الصغيرة الفلورية المكتشفة على عمق 500 ميكرومتر. (د) الصورة النموذجية للخلايا الدبقية الصغيرة المنشطة بشكل غير طبيعي في (C). تظهر مكدسات صور MIP ل GFP بسمك 20 ميكرومتر على عمق 60 ميكرومتر عمليات انتفاخ الخلايا الدبقية الصغيرة الممتدة نحو سطح الأنسجة المكشوف جراحيا. يختلف مورفولوجيا الخلايا الدبقية الصغيرة الكلية عن الصورة الموضحة في (ب). شريط مقياس ، 100 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 3: التصوير في الجسم الحي للخلايا الدبقية الصغيرة في الفئران CX3CR1-GFP في المرحلة المزمنة. (أ) المظهر التمثيلي للنافذة المزروعة على CA1 الظهري الأيمن في المرحلة المزمنة. من خلال القاع الزجاجي ، يتم ملاحظة الألياف البيضاء للحويصلات الهوائية بوضوح دون نزيف ما بعد الجراحة. يمكن رؤية DHC و LV جزئيا في المنطقة الذيلية وفي الحافة الوردية الجانبية ، على التوالي. شريط المقياس ، 1 مم. (B) إعادة بناء ثلاثية الأبعاد تمثيلية من تصوير CA1 المزمن في الجسم الحي لماوس CX3CR1-GFP على POD 24 (العرض: 511 ميكرومتر ، الارتفاع: 511 ميكرومتر ، العمق: 670 ميكرومتر). بالمقارنة مع الصور مباشرة بعد الجراحة (الشكل 2A) ، تظهر الخلايا الدبقية الصغيرة توزيعا أكثر تجانسا ويمكن ملاحظتها بشكل أكثر وضوحا في الطبقات العميقة من DG بسبب تقليل الوذمة والالتهاب. (ج) يتم عرض الصور النموذجية للخلايا الدبقية الصغيرة من (B) مع مورفولوجيا متشعبة مستعادة بالكامل على أنها MIPs لمكدسات صور GFP بسمك 20 ميكرومتر على أعماق 100 و 280 و 500 ميكرومتر من سطح الجراحة. قضبان المقياس ، 50 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل. الشكل 4: أدلة لتحديد كل طبقة من الحصين أثناء التصوير في الجسم الحي ومثال تطبيقي لهذه الطريقة. (أ) الصورة النموذجية للخلايا الدبقية الصغيرة في الحويصلات الهوائية للفئران CX3CR1-GFP في المرحلة المزمنة. يتم عرض أجسام الخلايا الدبقية الصغيرة والعمليات الممتدة على طول المسالك المحورية في MIP لمكدسات صور GFP بسمك 10 ميكرومتر على عمق 15 ميكرومتر. شريط المقياس ، 50 ميكرومتر. (B) صور تمثيلية للخلايا الدبقية الصغيرة في SO، SP، وSR في المرحلة المزمنة موضحة على أنها MIP لمكدسات صور GFP بسمك 5 ميكرومتر. الكثافة المحلية للعمليات الدبقية الصغيرة أقل في SP منها في SO أو SR المحيطة بسبب الخلايا العصبية الهرمية المعبأة بكثافة في SP. قضبان المقياس ، 100 ميكرومتر. (ج) لا يمكن التعرف على الأوعية الدموية السميكة التي تمتد على طول الحدود بين CA1 و DG إلا من خلال مضان الخلايا الدبقية الصغيرة. يظهر متوسط كثافة الإسقاط لمكدسات صور GFP المتجانبة بسمك 90 ميكرومتر في المرحلة المزمنة على عمق حوالي 500 ميكرومتر. يتوافق فراغ إشارة GFP مع الأوعية السميكة. شريط المقياس ، 500 ميكرومتر. (D) (العلوي) صورة نفس مجال الرؤية مثل C بعد الحقن داخل الصفاق من SR101. شريط مقياس ، 500 ميكرومتر (أقل) إعادة بناء ثلاثية الأبعاد لصور التجانب بعد حقن SR101 (العرض: 2.60 مم ، الارتفاع: 1.73 مم ، العمق: 0.69 مم). يمكن التعرف بسهولة على الأوعية السميكة التي تمتد على طول الحدود بين CA1 و DG من خلال مضان SR101 داخل الأوعية الدموية. (E) (يسار) إعادة بناء ثلاثية الأبعاد ل CA1 و DG (العرض: 255 ميكرومتر ، الارتفاع: 255 ميكرومتر ، العمق: 730 ميكرومتر) و (يمين) MIP ل GFP و tdTomato fluorescence في SP مصنوعة من مكدسات الصور بسمك 20 ميكرومتر. في أسبوع واحد قبل الجراحة ، تم حقن 1.5 ميكرولتر من خليط من AAV1-CAG-FLEX-tdTomato (5.0 × 10 12 vg / mL) و AAV1-hSyn-Cre (1.0 ×10 9 vg / mL) في الحصين لماوس CX3CR1-GFP لتسمية الخلايا العصبية بشكل ضئيل. تم إجراء التصوير على POD 0. يتم التعرف بسهولة على SP و GCL من خلال موضع أجسام الخلايا العصبية. شريط مقياس ، 50 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل. فيديو 1: تصوير الفاصل الزمني للخلايا الدبقية الصغيرة SO في المرحلة المزمنة. مكدسات صور MIP ل GFP بسمك 20 ميكرومتر في تصوير الفاصل الزمني للخلايا الدبقية الصغيرة SO ، متحركة بحيث يتم تشغيل 28 دقيقة في 1 ثانية. شريط مقياس ، 50 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الفيديو. فيديو 2: تصوير الفاصل الزمني للخلايا الدبقية الصغيرة SR في المرحلة المزمنة. مكدسات صور MIP ل GFP بسمك 20 ميكرومتر في تصوير الفاصل الزمني للخلايا الدبقية الصغيرة SR ، متحركة بحيث يتم تشغيل 28 دقيقة في 1 ثانية. شريط مقياس ، 50 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الفيديو.

Discussion

تحتوي هذه الطريقة على إجراءات جراحية متقنة ، ولكنها يمكن أن توفر صورا عالية الدقة على مدار CA1 بالكامل لفترة طويلة إذا تم إعدادها بشكل صحيح. أكدت التجارب التي أجريت على العديد من الفئران أن جودة الصورة في مرحلة ما بعد الجراحة المزمنة أفضل من جودة التصوير الحاد بعد العملية الجراحية. تم الحفاظ على جودة صورة أفضل لأكثر من 2 أشهر. السبب الأكثر شيوعا للفشل هو الضرر غير المقصود ل CA1 أثناء الجراحة ، والذي تم تحديده في فحص الجودة بعد العملية الجراحية (انظر الخطوة 4). يمكن أن يكون هذا بسبب الإصابة المباشرة عن طريق الشفط أو تجفيف الدماغ أو الضغط المفرط بواسطة الزجاج أو السمية من الأسمنت السني في الخطوة النهائية. سبب آخر للفشل هو نزيف ما بعد الجراحة ، والذي يمكن تأكيده من خلال النافذة الزجاجية السفلية في غضون أسبوع واحد بعد الجراحة (انظر الخطوة 6.1). اقرأ البروتوكول بعناية واتخذ جميع الاحتياطات لتجنب مثل هذه المشاكل.

حتى مع الإعداد الحالي للمجهر ثنائي الفوتون مع كاشفات GaAsP في المختبر ، فإن محاولة تصوير CA1 الظهري من خلال القشرة تؤدي إلى فقدان كبير للدقة بسبب تشتت الضوء الذي لا يستهان به. لذلك ، للحصول على دقة كافية لمراقبة حركة العمليات الدبقية الصغيرة أو تشكيل العمود الفقري التغصني للخلايا العصبية في CA1 ، فإن إزالة جزء من القشرة العلوية أمر لا مفر منه ، كما هو الحال في الطريقة الحالية. الطريقة البديلة الوحيدة لتقليل مدى إزالة القشرة مع الحفاظ على دقة صورة عالية هي تضمين عدسة ترحيل ، مثل عدسة معامل الانكسار المتدرج (GRIN). في هذا النهج ، تم وضع عدسة GRIN داخل أنبوب توجيه مزروع مباشرة فوق CA1 لتصوير CA1 المزمن28,29. كان القطر الخارجي لأنبوب التوجيه 1.8 مم ، وهو أصغر من 3.0 مم للجهاز في هذه الورقة ، بينما ينتج دقة عالية (NA ؛ 0.82) مماثلة للنظام هنا (NA فعال ؛ 0.88). ومع ذلك ، فإن النهج باستخدام عدسة GRIN له مجال رؤية ضيق للمراقبة عالية الدقة وعمق تصوير قصير محدود بواسطة WD لعدسة GRIN. لذلك ، فإن تصوير جميع طبقات الحصين في مجال رؤية واسع بدقة عالية هو ميزة محددة للطريقة في هذه الورقة.

أحد قيود هذا الإجراء هو أن الإزالة الجزئية للقشرة والالتهاب قد يكون لها بعض الآثار الضارة على الحصين. ومع ذلك ، نظرا لأن القشرة التي تمت إزالتها ليس لها مدخلات مباشرة إلى الحصين ، فإن القشرة المخية الداخلية غير تالفة ، والحصين نفسه غير مصاب بشكل مباشر ، فإن التقييم العام هو أن الضعف الوظيفي للحصين ليس كبيرا. أكدت العديد من الدراسات السابقة أن وظائف الحصين ، بما في ذلك التعلم والذاكرة ، يتم الحفاظ عليها بعد زرع نافذة الحصين25،26،27،30،31،32،33،34. لذلك ، من المتوقع أن يقوم نهج التصوير الموصوف هنا بالإبلاغ بأمانة عن وظائف الحصين بعد فترة كافية بعد الجراحة.

قد تشمل الاتجاهات المستقبلية لموضوعات البحث بناء على تقنية التصوير هذه التقليم المشبكي المكتشف عن طريق التصوير المتزامن للخلايا الدبقية الصغيرةوالخلايا العصبية 5 ، والتفاعل الدبقي الصغير المرتبط بالتعلم مع نقاط الاشتباك العصبي35 ، والحركة الدبقية الصغيرة التي ينظمها النشاط العصبي الحصين36 ، والاستجابات الدبقية الصغيرة للالتهاب المحيطي أو تلف الأنسجة7. ستساعد هذه الطريقة أيضا في توضيح تطور الأمراض التنكسية العصبية. على سبيل المثال ، في مرض الزهايمر (AD) ، تتراكم β الأميلويد وبروتينات تاو بالتوازي مع وفيات الخلايا العصبية وضمور الحصين ، مما يؤدي إلى خلل وظيفي إدراكي. تم الإبلاغ عن مشاركة الخلايا الدبقية الصغيرة في هذه العملية37,38. سيمكننا التصوير المزمن في الجسم الحي للخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا العصبية باستخدام نماذج فأر AD من مراقبة العلاقة بين وظائف الخلايا الدبقية الصغيرة وعلم الأمراض العصبية في الحصين لنماذج الفئران AD.

تركز هذه الورقة على التصوير الدبقي الصغير ، ولكن نفس إجراء التصوير ينطبق على أنواع الخلايا العصبية والدبقية الأخرى في CA1. بالإضافة إلى ذلك ، يقتصر البروتوكول على تصوير الفئران المخدرة ، ولكن يمكن أيضا توسيع هذه التقنية لمراقبة الخلايا الدبقية الصغيرة الحصين في الفئران المستيقظة. قد توجد القطع الأثرية الحركية الناتجة عن التنفس ونبضات القلب وحركات الجسم ، خاصة في طبقات الحصين العميقة بعيدا عن النافذة الزجاجية ، في تجارب على الفئران المستيقظة. لذلك ، قد تكون هناك حاجة إلى نظام مناسب لتصحيح الحركة لالتقاط مورفولوجيا وديناميات الخلايا الدبقية الصغيرة.

المناقشة المتعلقة بالبروتوكول
من المستحسن اختيار الفئران ذات العمر المناسب والتعديلات الجينية للتعبير عن مجسات الفلورسنت ذات الخصوصية الزمانية والمكانية (انظر الخطوة 1.3). يمكن استخدام الفئران في عمر 1 شهر لإجراء التجارب ، ولكن الفئران التي يزيد عمرها عن 2 أشهر أسهل في التعامل معها ، مع حجم جسمها الأكبر ومقاومتها للإجهاد الجراحي. بالإضافة إلى ذلك ، يصعب فصل الكبسولة الخارجية والحويصلات الهوائية في الحصين في الفئران الأصغر سنا. لذلك ، تتطلب إزالة الكبسولة الخارجية في الفئران الصغيرة مهارات جراحية (انظر الخطوات 3.4.3-4). سيكون تقييم الجراحة والتصوير اللاحق أكثر وضوحا مع الفئران التي تعبر عن بروتينات الفلورسنت بشكل متكرر وموحد في CA1 و DG (انظر الخطوة 4.7). ومن ثم ، في التجارب الأولية للجراحة ، ينصح باستخدام الفئران المعدلة وراثيا مع الخلايا العصبية ذات العلامات القليلة ، مثل الفئران Thy1-YFP أو Thy1-GFP39 ، أو الفئران ذات الخلايا الدبقية الصغيرة المسماة ، مثل الفئران CX3CR1-GFP24.

لإجراء جراحة ناجحة ، يعد اختيار التخدير أمرا مهما (انظر الخطوة 2.1). يمكن أن تسبب أنواع التخدير المختلفة درجات مختلفة من وذمة الدماغ أثناء العملية ، مما يؤثر على صعوبة الجراحة ، والموضع النسبي للأنبوب المعدني المزروع ، ومدى ضغط الدماغ بواسطة النافذة الزجاجية. قد تؤثر هذه العوامل أيضا على بقاء الخلايا العصبية الحصينية بعد الجراحة.

في عملية الشفط لفضح الحصين (انظر الخطوة 3.4) ، يجب ملاحظة النقاط التالية لتقليل الضرر الذي يلحق بالدماغ وضمان التصوير الناجح. قم باستمرار بتوفير محلول ملحي معقم على سطح الأنسجة عن طريق وضع منفذ على جانب نافذة الجمجمة. منع سطح الأنسجة من التعرض للهواء أثناء الشفط. المبدأ الأساسي لشفط الأنسجة هو إزالة سطح الأنسجة عن طريق تدفق السائل إلى طرف الشفط. يجب تجنب الاتصال المباشر لطرف الشفط بالأنسجة. اضبط الضغط السلبي المطبق على أنبوب الشفط ليكون الحد الأدنى. نضح الأنسجة خطوة بخطوة وتأكد من التحكم في النزيف في كل خطوة. عندما يطول النزيف ، انتظر حتى يتوقف النزيف تلقائيا. الحفاظ على الطموح من مسافة قصيرة من بقعة النزيف مع تدفق مستمر من المياه المالحة المعقمة. قم بشفط الأنسجة لإنشاء مساحة أسطوانية مع تركيب حجمها مع الأنبوب المعدني ذي القاع الزجاجي (انظر الخطوة 1.1). اختر 23 جم من الإبر لشفط الأوعية السميكة أو شظايا الأنسجة الكبيرة و 25 جم من الإبر لامتصاص بقايا الأنسجة الصغيرة.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

نود أن نشكر M. Kondo و M. Matsuzaki على إعارتنا العدسة الموضوعية XLPLN25XSVMP. تم دعم هذا العمل ماليا من الجمعية اليابانية لتعزيز العلوم (JSPS) من قبل منحة المعونة لزميل أبحاث JSPS (18J21331 إلى RK) والمنح في المعونة للبحث العلمي (20H00481 ، 20A301 ، 20H05894 ، 20H05895 إلى SO) ، من الوكالة اليابانية للبحث والتطوير الطبي (JP19gm1310003 و JP17gm5010003 إلى S.O.) ، ومن وكالة العلوم والتكنولوجيا اليابانية بواسطة Moonshot R &D (JPMJMS2024 إلى H.M.).

Materials

23 G blunt needles NIPRO 02-166 Suction tips for aspiration.
25 G blunt needles NIPRO 02-167 Suction tips for aspiration.
3 mm dermal punches (DermaPunch) Maruho 213001610 Tools for craniotomy.
30 G needles Dentronics Disposable needle No. 30 Tools for craniotomy.
A femtosecond pulsed laser Spectra-Physics MaiTai Deep See A Ti:Sapphire laser used at 920 nm wavelength.
A two-photon microscope Nikon A1R MP+ Microscope for the CA1 imaging.
AAV1-CAG-FLEX-tdTomato Penn Vector Core AAV for neuronal labeling.
AAV1-hSyn-Cre Penn Vector Core AAV for neuronal labeling.
An objective lens for two-photon imaging Olympus XLPLN25XSVMP 25× objective with a long working distance, a high numerical aperture, and a correction collar
Aspirators Shin-ei Industries KS-500 Tools for aspiration.
Aluminum plates Narishige CP-1 Plates made of alminum for head fixation.
Chemical depilatory cream YANAGIYA Cream for hair removal around the surgical site.
Circular glass coverslips Matsunami Glass 3φ No.1 Coverslips bonded to stainless steel tubes.
CX3CR1-GFP mice The Jackson Laboratory 008451 Transgenic mice for microglial imaging.
Cylindrical stainless steel tubes MORISHITA Custom-made Metal tubes to be implanted. Outer diameter 3.0 mm, inner diameter 2.8 mm, height 1.7 mm.
Dental etching material Sun Medical 204610461 Used to etch the skull bones.
Dental resin cement (Super-Bond C&B) Sun Medical 204610555 Dental cement.
Dura pickers (Micro Points) Fine Science Tools 10063-15 Tools for dura removal.
Fine forceps (Dumont #5) Fine Science Tools 11252-20 Surgical tools.
Forceps Bio Research Center PRI13-3374 Used to disinfect the surgical site.
Head holding device Narishige MAG-2 The head holding device of mice with angle adjusters
Heating pad Bio Research Center BWT-100A and HB-10 Tools to provide thermal support for the mouse during surgery.
Heating pad ALA Scientific HEATINGPAD-1 and Hot-1 Tools to provide thermal support for the mouse on the head holding device.
Ketamine (Ketalar) Daiichi Sankyo Company S9-001665 Anesthesia during surgery.
Meloxicam Tokyo Chemical Industry M1959 Analgesia during surgery.
Ophthalmic ointment Sato Pharmaceutical Used to prevent eye dryness during surgery.
Povidone-iodine scrub solution Meiji Seika Pharma 2612701Q1137 Used to disinfect the surgical site.
Round-tipped miniature knives Surgistar 4769 Surgical tools.
Scalpel MURANAKA MEDICAL INSTRUMENTS 450-098-67 Disposable surgical tool.
Stereo microscopes Leica Microsystems S8 APO Microscopes for surgery.
Sterile saline Otsuka Pharmaceutical Factory 3311401A2026 Washing solution during surgery.
Sterile waterproof pad AS ONE 8-5945-01 Surgical platform.
Sulforhodamine 101 Sigma-Aldrich S7635 A dye for in vivo vessel imaging.
Surgical drape Medline Industries MP-0606F6T Perforated drape for surgery.
UV light Toshiba GL15 Used to cure the adhesives.
UV-curing optical adhesives Thorlabs NOA81 Adhesives for bonding coverslips to stainless steel tubes.
Xylazine (Celactal 2%) Bayer Anesthesia during surgery.
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wolf, S. A., Boddeke, H. W. G. M., Kettenmann, H. Microglia in physiology and disease. Annual Review of Physiology. 79, 619-643 (2017).
  2. Wake, H., Moorhouse, A. J., Miyamoto, A., Nabekura, J. Microglia: actively surveying and shaping neuronal circuit structure and function. Trends in Neurosciences. 36 (4), 209-217 (2012).
  3. Wu, Y., Dissing-Olesen, L., MacVicar, B. A., Stevens, B. Microglia: dynamic mediators of synapse development and plasticity. Trends in Immunology. 36 (10), 605-613 (2015).
  4. Nakayama, H., et al. Microglia permit climbing fiber elimination by promoting GABAergic inhibition in the developing cerebellum. Nature Communications. 9 (1), 2830 (2018).
  5. Iida, T., Tanaka, S., Okabe, S. Spatial impact of microglial distribution on dynamics of dendritic spines. The European Journal of Neuroscience. 49 (11), 1400-1417 (2019).
  6. Kettenmann, H., Hanisch, U., Noda, M., Verkhratsky, A. Physiology of microglia. Physiological Reviews. 91 (2), 461-553 (2011).
  7. Kondo, S., Kohsaka, S., Okabe, S. Long-term changes of spine dynamics and microglia after transient peripheral immune response triggered by LPS in vivo. Molecular Brain. 4 (1), 27 (2011).
  8. Benninger, R. K. P., Piston, D. W. Two-photon excitation microscopy for the study of living cells and tissues. Current Protocols in Cell Biology. 59 (1), 4-11 (2013).
  9. Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo. Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).
  10. Davalos, D., et al. ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo. Nature Neuroscience. 8 (6), 752-758 (2005).
  11. Tremblay, M., Lowery, R. L., Majewska, A. K. Microglial interactions with synapses are modulated by visual experience. PLoS Biology. 8 (11), 1000527 (2010).
  12. Miyamoto, A., et al. Microglia contact induces synapse formation in developing somatosensory cortex. Nature Communications. 7, 12540 (2016).
  13. Akiyoshi, R., et al. Microglia enhance synapse activity to promote local network synchronization. eNeuro. 5 (5), 0088 (2018).
  14. Favuzzi, E., et al. GABA-receptive microglia selectively sculpt developing inhibitory circuits. Cell. 184 (15), 4048-4063 (2021).
  15. Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50 (6), 823-839 (2006).
  16. Isshiki, M., Okabe, S. Evaluation of cranial window types for in vivo two-photon imaging of brain microstructures. Microscopy. 63 (1), 53-63 (2014).
  17. Grabert, K., et al. Microglial brain region-dependent diversity and selective regional sensitivities to aging. Nature Neuroscience. 19 (3), 504-516 (2016).
  18. De Biase, L. M., et al. Local cues establish and maintain region-specific phenotypes of basal ganglia microglia. Neuron. 95 (2), 341-356 (2017).
  19. Ayata, P., et al. Epigenetic regulation of brain region-specific microglia clearance activity. Nature Neuroscience. 21 (8), 1049-1060 (2018).
  20. Böttcher, C., et al. Human microglia regional heterogeneity and phenotypes determined by multiplexed single-cell mass cytometry. Nature Neuroscience. 22 (1), 78-90 (2019).
  21. Masuda, T., et al. Spatial and temporal heterogeneity of mouse and human microglia at single-cell resolution. Nature. 566 (7744), 388-392 (2019).
  22. Paolicelli, R. C., et al. Synaptic pruning by microglia is necessary for normal brain development. Science. 333 (6048), 1456-1458 (2011).
  23. Wang, C., et al. Microglia mediate forgetting via complement-dependent synaptic elimination. Science. 367 (6478), 688-694 (2020).
  24. Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptor CX3CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Molecular and Cellular Biology. 20 (11), 4106-4114 (2000).
  25. Gu, L., et al. Long-term in vivo imaging of dendritic spines in the hippocampus reveals structural plasticity. The Journal of Neuroscience. 34 (42), 13948-13953 (2014).
  26. Dombeck, D. A., Harvey, C. D., Tian, L., Looger, L. L., Tank, D. W. Functional imaging of hippocampal place cells at cellular resolution during virtual navigation. Nature Neuroscience. 13 (11), 1433-1440 (2010).
  27. Schmid, L. C., et al. Dysfunction of somatostatin-positive interneurons associated with memory deficits in an Alzheimer’s disease model. Neuron. 92 (1), 114-125 (2016).
  28. Barretto, R. P., Messerschmidt, B., Schnitzer, M. J. In vivo fluorescence imaging with high-resolution microlenses. Nature Methods. 6 (7), 511-512 (2009).
  29. Attardo, A., Fitzgerald, J. E., Schnitzer, M. J. Impermanence of dendritic spines in live adult CA1 hippocampus. Nature. 523 (7562), 592-596 (2015).
  30. Sheffield, M. E. J., Dombeck, D. A. Calcium transient prevalence across the dendritic arbour predicts place field properties. Nature. 517 (7533), 200-204 (2015).
  31. Attardo, A., et al. Long-term consolidation of ensemble neural plasticity patterns in hippocampal area CA1. Cell Reports. 25 (3), 640-650 (2018).
  32. Kaifosh, P., Lovett-Barron, M., Turi, G. F., Reardon, T. R., Losonczy, A. Septo-hippocampal GABAergic signaling across multiple modalities in awake mice. Nature Neuroscience. 16 (9), 1182-1184 (2013).
  33. Lovett-Barron, M., et al. Dendritic inhibition in the hippocampus supports fear learning. Science. 343 (6173), 857-863 (2014).
  34. Hainmueller, T., Bartos, M. Parallel emergence of stable and dynamic memory engrams in the hippocampus. Nature. 558 (7709), 292-296 (2018).
  35. Parkhurst, C., et al. Microglia promote learning-dependent synapse formation through brain-derived neurotrophic factor. Cell. 155 (7), 1596-1609 (2013).
  36. Merlini, M., et al. Microglial Gi-dependent dynamics regulate brain network hyperexcitability. Nature Neuroscience. 24 (1), 19-23 (2021).
  37. Sarlus, H., Heneka, M. T. Microglia in Alzheimer’s disease. Journal of Clinical Investigation. 127 (9), 3240-3249 (2017).
  38. Hansen, D. V., Hanson, J. E., Sheng, M. Microglia in Alzheimer’s disease. Journal of Cell Biology. 217 (2), 459-472 (2018).
  39. Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).

Tags

MicrogliaHippocampusIn VivoTwo-photon ImagingNeuronsCranial WindowExternal CapsuleAlveusCA1Two-photon Microscope

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Kamei, R., Urata, S., Maruoka, H., Okabe, S. In Vivo Chronic Two-Photon Imaging of Microglia in the Mouse Hippocampus. J. Vis. Exp. (185), e64104, doi:10.3791/64104 (2022).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image