Метод пилинга:метод крио-ЭМ-пробоподготовки для отделения отдельных слоев от многослойных или концентрированных биологических образцов
Summary
Метод пилинга-пятнистости представляет собой метод крио-ЭМ-подготовки сетки, который позволяет разделять многослойные и концентрированные биологические образцы на отдельные слои для уменьшения толщины, увеличения концентрации образца и облегчения обработки изображений.
Abstract
Метод подготовки крио-ЭМ-сетки с пилингом представляет собой значительно модифицированный метод обратной инъекции с целью достижения уменьшения слоев многослойных образцов. Это удаление слоев перед погружением замораживания может помочь уменьшить толщину образца до уровня, подходящего для сбора крио-ЭМ данных, улучшить плоскостность образца и облегчить обработку изображений. Метод пилинга-блоттинга позволяет разделить многоламеллярные мембраны на отдельные слои, слоистые 2D-кристаллы на отдельные кристаллы и уложенные листообразные структуры растворимых белков также быть разделенными на отдельные слои. Высокая толщина образцов этих типов образцов часто создает непреодолимые проблемы для сбора крио-ЭМ данных и крио-ЭМ обработки изображений, особенно когда ступень микроскопа должна быть наклонена для сбора данных. Кроме того, сетки с высокими концентрациями любого из этих образцов могут быть подготовлены для эффективного сбора данных, поскольку концентрация образца до подготовки сетки может быть увеличена, а метод шелушения-пятна скорректирован таким образом, чтобы привести к плотному распределению однослойного образца.
Introduction
Метод пилинга-блоттинга был разработан для того, чтобы разделить сложенные двумерные кристаллы мембранных белков на отдельные слои для получения достаточно тонких образцов для сбора крио-ЭМ 2D и 3D данных и облегчения обработки изображений1. Протокол также подходит для других типов многоламерных образцов, а также для достижения высоких концентраций образцов любого типа образца на сетке без увеличения толщины в Z.
Уменьшение слоев образца до одного слоя достигается путем применения комбинации капиллярного давления и сил сдвига в протоколе, который существенно расширяет и модифицирует метод обратной инъекции2. Первая стадия промокшивания приводит к плотному сэндвичингу и сцеплению с углеродной пленкой и сетчатой полосой по обе стороны многослойного образца во время промокания на субмикроне, а не к размеру пор фильтровальной бумаги 20-25 мкм в методе обратного впрыска. Разделение или отслаивание отдельного слоя происходит при принудительном разделении зажатых слоев после того, как сетка прижимается вертикально к трегалозной капле, выталкивая углеродную пленку от стержня сетки (рисунок 1). Перемещение углеродной пленки в сторону от исходной точки контакта с стержнем сетки происходит на следующем этапе, когда сетка снова смачивается на субмикронной фильтровальной бумаге. Количество итераций этих шагов может быть оптимизировано для конкретных образцов. Кроме того, протокол может быть использован для увеличения концентраций образцов, избегая при этом агрегации в Z. Из-за зависимости от сцепления с сетчатого стержня и углеродной пленки, а также принудительного разделения, этот подход может не подходить для очень хрупких молекул, таких как определенные деликатные и/или нестабильные белки и белковые комплексы.
Техника пилинга не требует ни специализированного оборудования, ни дорогостоящих расходных материалов. Однако применимость к конкретным образцам потребует тщательного рассмотрения биологических параметров. Решение проще для 2D-кристаллов, поскольку для обеспечения плоскостности требуется углеродная пленка, но манипуляции с помощью метода пилинга могут повлиять на биологическую целостность образца или кристаллический порядок. Пригодность метода пилинга-блоттинга к одиночным частицам ограничена и может быть проверена на те, которые требуют углеродной пленки и устойчивы к манипуляциям. Образцы с критическими биологическими взаимодействиями между слоями могут не подходить для характеристики с помощью метода пилинга-блоттинга из-за нарушения таких взаимодействий.
Метод пилинга-блоттинга («пилинг-блотт») наиболее быстро оптимизируется путем тестирования и скрининга с отрицательным пятном или неокрашенными образцами ТЭМ при комнатной температуре. После того, как оптимальное количество итераций шелушения-пятна было определено, можно определить время для контроля толщины до витрификации.
Protocol
Representative Results
Discussion
Пил-блоттинг является мощным методом преодоления укладки и толщины многослойных 2D-кристаллов и аналогичных образцов для сбора крио-ЭМ данных и обработки изображений. Решение об использовании пилинга будет основываться на биологических параметрах образца, а также потребует оценки по?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Часть этой работы была поддержана грантом NIH HL090630 (ISK).
Materials
| 600-mesh grids | SPI | 2060-C-XA | |
| Anti-capillary forceps | Ted Pella | 510-5 | |
| Carbon to coat mica | |||
| Cryo-EM | Cryo-EM grids may be screened at 120 kV or 200 kV. High-resolution data is collected at 300 kV. | ||
| Dumpont #5 forceps | Ted Pella | 5622 | |
| Grid box for cryo-EM storage | Ted Pella | 160-40 | |
| Kim Wipes | |||
| Liquid nitrogen | |||
| Mica | Ted Pella | 56 | The mica is carbon-coated and cut into squares that are slighlty larger than a TEM grid. The carbon thickness may require optimization to avoid thin carbon that breaks easily upon multiple peel blots. |
| Negative stain | 1-2% uranyl acetate is suitable for many samples. Other stains such as phosphotungstic acid can be substituted. | ||
| Parafilm | |||
| Polystyrene container | Used for vitrifying the peel-blot grid. A polystyrene shipping container can be recycled for this purpose and lined with aluminium foil. | ||
| Submicron filter paper | MilliporeSigma | DAWP04700 | |
| Transmission electron microscope | JEOL | JEM-1400 | Any TEM operated at an accelerating voltage of 80-120 kV will be suitable for screening of negatively stained grids. |
| Trehalose | Prepare 4% trehalose solution. | ||
| Whatman #4 filter paper | MilliporeSigma | WHA1004150 | This corresponds to the 20-25 μm pore size filter paper in the protocol. |
References
- Johnson, M. C., Uddin, Y. M., Neselu, K., Schmidt-Krey, I. 2D crystallography of membrane protein single-, double- and multi-layered ordered arrays. Methods in Molecular Biology. 2215, 227-245 (2021).
- Kühlbrandt, W., Downing, K. H. Two-dimensional structure of plant light harvesting complex at 3.7 Å resolution by electron crystallography. Journal .of Molecular Biology. 207 (4), 823-828 (1989).
- Nannenga, B. L., Gonen, T. MicroED: a versatile cryoEM method for structure determination. Emerging Topics in Life Sciences. 2 (1), 1-8 (2018).
- Martynowycz, M. W., Zhao, W., Hattne, J., Jensen, G. J., Gonen, T. Collection of continuous rotation microED data from ion beam-milled crystals of any size. Structure. 27 (3), 545-548 (2019).
- Gonen, T. et al. Lipid-protein interactions in double-layered two-dimensional AQP0 crystals. Nature. 438 (7068), 633-638(2005).
- Gonen, T. The collection of high-resolution electron diffraction data. Methods in Molecular Biology. 955, 153-169 (2013).
- Wisedchaisri, G., Gonen T. Phasing electron diffraction data by molecular replacement: strategy for structure determination and refinement. Methods in Molecular Biology. 955, 243-272 (2013).
- Gipson B., Zeng X., Zhang Z. Y., Stahlberg, H. 2dx-user-friendly image processing for 2D crystals. Journal of Structural Biology. 157 (1), 64-72 (2007).
- Biyani, N. et al. Focus: The interface between data collection and data processing in cryo-EM. Journal of Structural Biology. 198 (2), 124-133 (2017).
- Righetto, R., Stahlberg, H.Single particle analysis for high-resolution 2D electron crystallography. Methods in Molecular Biology. 2215, 267-284 (2021).
