A Técnica Peel-Blot: Um Método de Preparação de Amostras Crio-EM para Separar Camadas Individuais de Amostras Biológicas Multicamadas ou Concentradas
Summary
A técnica peel-blot é um método de preparação de grade crio-EM que permite a separação de amostras biológicas multicamadas e concentradas em camadas únicas para reduzir a espessura, aumentar a concentração da amostra e facilitar o processamento da imagem.
Abstract
A técnica de preparação de grade crio-EM peel-blot é um método de retroinjeção significativamente modificado com o objetivo de alcançar uma redução nas camadas de amostras de várias camadas. Essa remoção de camadas antes do congelamento por imersão pode ajudar a reduzir a espessura da amostra para um nível adequado para a coleta de dados crio-EM, melhorando a planicidade da amostra e facilitando o processamento da imagem. A técnica peel-blot permite a separação de membranas multilamelares em camadas únicas, de cristais 2D em camadas em cristais individuais e de estruturas empilhadas em forma de folha de proteínas solúveis para também serem separadas em camadas únicas. A alta espessura da amostra desses tipos de amostras frequentemente apresenta problemas insuperáveis para a coleta de dados crio-EM e processamento de imagem crio-EM, especialmente quando o estágio do microscópio deve ser inclinado para a coleta de dados. Além disso, grades de altas concentrações de qualquer uma dessas amostras podem ser preparadas para uma coleta de dados eficiente, uma vez que a concentração da amostra antes da preparação da grade pode ser aumentada e a técnica peel-blot ajustada para resultar em uma distribuição densa de amostra de camada única.
Introduction
A técnica peel-blot foi desenvolvida com o objetivo de separar cristais bidimensionais empilhados de proteínas de membrana em camadas únicas para obter amostras adequadamente finas para coleta de dados crio-EM 2D e 3D e facilitar o processamento de imagens1. O protocolo é igualmente adequado para outros tipos de amostras multilamelares, bem como para alcançar altas concentrações de amostra de qualquer tipo de amostra na grade sem aumentar a espessura em Z.
A redução das camadas de amostra para uma camada é alcançada pela aplicação de uma combinação de pressão capilar e forças de cisalhamento em um protocolo que se estende substancialmente e modifica o método de retroinjeção2. Uma primeira etapa de blotting resulta em sanduíche apertado e aderência ao filme de carbono e uma barra de grade em ambos os lados da amostra de várias camadas durante a mancha em submícron, em vez do tamanho do poro de papel de filtro de 20-25μm no método de retroinjeção. A separação, ou descamação, de uma camada individual ocorre ao forçar a separação das camadas ensanduichadas uma vez que a grade é pressionada verticalmente em uma gota de trealose, forçando o filme de carbono para longe da barra de grade (Figura 1). O reposicionamento do filme de carbono para longe do ponto de contato original com a barra de grade ocorre na próxima etapa, quando a grade é novamente manchada em papel de filtro submícron. O número de iterações dessas etapas pode ser otimizado para amostras específicas. Além disso, o protocolo pode ser usado para aumentar as concentrações da amostra, evitando a agregação em Z. Devido à dependência da aderência à barra de grade e ao filme de carbono, bem como à separação forçada, essa abordagem pode não ser adequada para moléculas altamente frágeis, como certas proteínas delicadas e / ou instáveis e complexos proteicos.
A técnica peel-blot não requer equipamentos especializados nem suprimentos caros. A aplicabilidade a amostras específicas exigirá, no entanto, considerações cuidadosas sobre os parâmetros biológicos. A decisão é mais fácil para os cristais 2D, pois o filme de carbono é necessário para garantir a planicidade, mas a manipulação através da técnica peel-blot pode afetar a integridade biológica da amostra ou a ordem cristalina. A adequação da técnica peel-blot a partículas individuais é restrita e pode ser testada para aquelas que requerem filme de carbono e são estáveis à manipulação. Espécimes com interações biológicas críticas entre camadas podem não ser adequados para caracterização com a ajuda da técnica peel-blot devido à interrupção de tais interações.
A técnica peel-blot (“peel-blot”) é mais rapidamente otimizada por testes e triagem com coloração negativa ou amostras não coradas por MET à temperatura ambiente. Uma vez que o número ideal de iterações de peel-blot tenha sido identificado, o tempo para controlar a espessura antes da vitrificação pode ser determinado.
Protocol
Representative Results
Discussion
O peel-blot é um método poderoso para superar o empilhamento e a espessura de cristais 2D de várias camadas e amostras semelhantes para coleta de dados crio-EM e processamento de imagens. Uma decisão sobre o uso do peel-blot será baseada em parâmetros biológicos da amostra e também exigirá avaliação assim que um modelo crio-EM 3D estiver disponível. A importância biológica dos contactos e a potencial flexibilidade das regiões de contacto serão particularmente importantes nesta avaliação.
<p class="j…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Parte deste trabalho foi apoiado pela subvenção do NIH HL090630 (ISK).
Materials
| 600-mesh grids | SPI | 2060-C-XA | |
| Anti-capillary forceps | Ted Pella | 510-5 | |
| Carbon to coat mica | |||
| Cryo-EM | Cryo-EM grids may be screened at 120 kV or 200 kV. High-resolution data is collected at 300 kV. | ||
| Dumpont #5 forceps | Ted Pella | 5622 | |
| Grid box for cryo-EM storage | Ted Pella | 160-40 | |
| Kim Wipes | |||
| Liquid nitrogen | |||
| Mica | Ted Pella | 56 | The mica is carbon-coated and cut into squares that are slighlty larger than a TEM grid. The carbon thickness may require optimization to avoid thin carbon that breaks easily upon multiple peel blots. |
| Negative stain | 1-2% uranyl acetate is suitable for many samples. Other stains such as phosphotungstic acid can be substituted. | ||
| Parafilm | |||
| Polystyrene container | Used for vitrifying the peel-blot grid. A polystyrene shipping container can be recycled for this purpose and lined with aluminium foil. | ||
| Submicron filter paper | MilliporeSigma | DAWP04700 | |
| Transmission electron microscope | JEOL | JEM-1400 | Any TEM operated at an accelerating voltage of 80-120 kV will be suitable for screening of negatively stained grids. |
| Trehalose | Prepare 4% trehalose solution. | ||
| Whatman #4 filter paper | MilliporeSigma | WHA1004150 | This corresponds to the 20-25 μm pore size filter paper in the protocol. |
References
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