ピールブロット法:多層または濃縮された生物学的サンプルから単層を分離するクライオEMサンプル調製法

ピールブロット法は、膜タンパク質の積層2次元結晶を単層に分離し、クライオEM 2Dおよび3Dデータ収集に適した薄いサンプルを取得し、画像処理を容易にするために開発されました¹。このプロトコルは、他のタイプの多層サンプルにも同様に適しており、Zの厚さを増やすことなく、グリッド上のいずれかのサンプルタイプの高濃度を達成するのにも適しています。

サンプル層を1層に減らすことは、毛細管圧とせん断力の組み合わせを、バックインジェクション法²に実質的に拡張して変更するプロトコルに適用することによって達成されます。最初のブロッティングステップでは、バックインジェクション法の20〜25μmのろ紙の孔径ではなく、サブミクロンでのブロッティング中に、多層サンプルの両側にあるカーボンフィルムとグリッドバーにしっかりと挟まれ、接着されます。個々の層の分離または剥離は、グリッドがトレハロースドロップに垂直に押し付けられ、炭素膜がグリッドバーから強制的に離れると、挟まれた層を強制的に分離したときに発生します(図1)。グリッドバーとの元の接触点から離れたカーボンフィルムの再配置は、グリッドがサブミクロン濾紙上で再び吸い取られる次のステップで発生します。これらのステップの反復回数は、特定のサンプルに対して最適化できます。さらに、このプロトコルは、Zでの凝集を回避しながらサンプル濃度を高めるために使用できます。 グリッドバーと炭素膜への付着、および強制的な分離に依存するため、このアプローチは、特定の繊細で不安定なタンパク質やタンパク質複合体などの非常に壊れやすい分子には適さない場合があります。

ピールブロット技術は、特殊な機器や高価な消耗品を必要としません。ただし、特定のサンプルに適用するには、生物学的パラメータを慎重に検討する必要があります。2D結晶では平坦性を確保するために炭素膜が必要であるため、決定は簡単ですが、ピールブロット法 による 操作は、サンプルの生物学的完全性または結晶秩序に影響を与える可能性があります。単一粒子に対するピールブロット技術の適合性は、炭素膜を必要とし、操作に対して安定なものに限定され、試験され得る。層間に重要な生物学的相互作用を有する標本は、そのような相互作用の破壊のために、ピールブロット技術の助けを借りての特性評価に適さない可能性があります。

ピールブロット法(「ピールブロット」)は、室温のTEMによる陰性染色または未染色サンプルでの試験およびスクリーニングによって最も迅速に最適化されます。ピールブロットの反復の最適な回数が特定されたら、ガラス化前の厚さを制御する時間を決定できます。