טכניקת ה-peel-blot: שיטת הכנת דגימות Cryo-EM להפרדת שכבות בודדות מדגימות ביולוגיות רב-שכבתיות או מרוכזות
Summary
טכניקת הקילוף-כתם היא שיטת הכנה לרשת cryo-EM המאפשרת הפרדת דגימות ביולוגיות רב-שכבתיות ומרוכזות לשכבות בודדות כדי להפחית את העובי, להגדיל את ריכוז הדגימה ולהקל על עיבוד התמונה.
Abstract
טכניקת הכנת רשת קריו-EM עם כתם קליפה היא שיטת הזרקה אחורית ששונתה באופן משמעותי במטרה להשיג הפחתה בשכבות של דגימות רב שכבתיות. הסרה זו של שכבות לפני הקפאת הדגימה יכולה לסייע בהפחתת עובי הדגימה לרמה המתאימה לאיסוף נתוני cryo-EM, שיפור שטוחות הדגימה והקלה על עיבוד התמונה. טכניקת הקליפה מאפשרת הפרדה של ממברנות מולטי-למלריות לשכבות בודדות, של גבישים דו-ממדיים שכבתיים לגבישים בודדים, ושל מבנים מוערמים דמויי יריעות של חלבונים מסיסים כדי שגם אותם ניתן להפריד לשכבות בודדות. עובי הדגימה הגבוה של דגימות מסוג זה מהווה לעתים קרובות בעיות בלתי עבירות לאיסוף נתונים cryo-EM ועיבוד תמונה cryo-EM, במיוחד כאשר יש להטות את שלב המיקרוסקופ לצורך איסוף נתונים. יתר על כן, רשתות של ריכוזים גבוהים של כל אחת מהדגימות הללו יכולות להיות מוכנות לאיסוף נתונים יעיל מכיוון שניתן להגדיל את ריכוז הדגימות לפני הכנת הרשת ולהתאים את טכניקת הקילוף-כתם כדי לגרום לפיזור צפוף של דגימה חד-שכבתית.
Introduction
טכניקת ה-peel-blot פותחה על מנת להפריד גבישים דו-ממדיים מוערמים של חלבוני ממברנה לשכבות בודדות כדי לקבל דגימות דקות מתאימות לאיסוף נתונים דו-ממדיים ותלת-ממדיים של cryo-EM ולהקל על עיבוד תמונה1. הפרוטוקול מתאים באופן דומה לסוגים אחרים של דגימות מולטי-לאמלר וכן להשגת ריכוזי דגימה גבוהים של כל אחד מסוגי הדגימה ברשת מבלי להגדיל את העובי ב-Z.
הפחתת שכבות הדגימה לשכבה אחת מושגת על ידי הפעלת שילוב של לחץ נימי וכוחות גזירה בפרוטוקול המרחיב באופן משמעותי את שיטת ההזרקה האחורית2 ומשנה אותה. שלב ראשון של הכתמה גורם לכריכה הדוקה ולהיצמדות לסרט הפחמן ולפס רשת משני צדי הדגימה הרב-שכבתית במהלך הכתם על תת-מיקרון במקום גודל הנקבובית של נייר הסינון 20-25 מיקרומטר בשיטת ההזרקה האחורית. ההפרדה, או הקילוף, של שכבה בודדת מתרחש כאשר מכריחים את הפרדת השכבות הדחוקות ברגע שהרשת נלחצת אנכית על טיפת טרהלוז, מה שמאלץ את סרט הפחמן להתרחק מפס הרשת (איור 1). מיקום מחדש של סרט הפחמן הרחק מנקודת המגע המקורית עם סרגל הרשת מתרחש בשלב הבא, כאשר הרשת מוכתמת שוב על נייר סינון תת-מיקרוני. ניתן למטב את מספר האיטרציות של שלבים אלה עבור דוגמאות ספציפיות. יתר על כן, ניתן להשתמש בפרוטוקול כדי להגדיל את ריכוזי הדגימה תוך הימנעות מצבירה ב- Z. בשל ההסתמכות על הדבקות במוט הרשת וביריעת הפחמן, כמו גם הפרדה כוחנית, גישה זו עשויה שלא להתאים למולקולות שבריריות מאוד כגון חלבונים עדינים ו/או לא יציבים וקומפלקסים של חלבונים.
טכניקת הקליפה אינה דורשת ציוד מיוחד או אספקה יקרה. עם זאת, תחולת דגימות ספציפיות תדרוש שיקולים זהירים של פרמטרים ביולוגיים. ההחלטה קלה יותר עבור גבישים דו-ממדיים מכיוון שסרט פחמן נדרש כדי להבטיח שטוחות, אך מניפולציה באמצעות טכניקת הקליפה-כתם עשויה להשפיע על השלמות הביולוגית של הדגימה או הסדר הגבישי. התאמת טכניקת הקילוף-כתם לחלקיקים בודדים מוגבלת וניתן לבחון אותה עבור אלה הזקוקים לסרט פחמן ויציבים למניפולציה. דגימות עם אינטראקציות ביולוגיות קריטיות בין שכבות עשויות שלא להתאים לאפיון בעזרת טכניקת הקילוף-כתם בשל השיבוש של אינטראקציות כאלה.
טכניקת הקלף-כתם (“peel-blot”) ממוטבת במהירות הרבה ביותר על ידי בדיקה וסינון עם כתם שלילי או דגימות לא מוכתמות על ידי TEM בטמפרטורת החדר. לאחר זיהוי המספר האופטימלי של איטרציות כתמי קליפה, ניתן לקבוע את הזמן לשליטה בעובי לפני הוויטריפיקציה.
Protocol
Representative Results
Discussion
כתם הקליפה הוא שיטה רבת עוצמה להתגבר על ערימה ועובי של גבישים דו-ממדיים רב-שכבתיים ודגימות דומות לאיסוף נתונים cryo-EM ועיבוד תמונה. החלטה על השימוש בכתם הקליפה תתבסס על פרמטרים ביולוגיים של הדגימה ותדרוש גם הערכה ברגע שיהיה מודל קריו-EM תלת-ממדי זמין. החשיבות הביולוגית של מגעים וגמישות פוטנצ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
חלק מעבודה זו נתמך על ידי מענק NIH HL090630 (ISK).
Materials
| 600-mesh grids | SPI | 2060-C-XA | |
| Anti-capillary forceps | Ted Pella | 510-5 | |
| Carbon to coat mica | |||
| Cryo-EM | Cryo-EM grids may be screened at 120 kV or 200 kV. High-resolution data is collected at 300 kV. | ||
| Dumpont #5 forceps | Ted Pella | 5622 | |
| Grid box for cryo-EM storage | Ted Pella | 160-40 | |
| Kim Wipes | |||
| Liquid nitrogen | |||
| Mica | Ted Pella | 56 | The mica is carbon-coated and cut into squares that are slighlty larger than a TEM grid. The carbon thickness may require optimization to avoid thin carbon that breaks easily upon multiple peel blots. |
| Negative stain | 1-2% uranyl acetate is suitable for many samples. Other stains such as phosphotungstic acid can be substituted. | ||
| Parafilm | |||
| Polystyrene container | Used for vitrifying the peel-blot grid. A polystyrene shipping container can be recycled for this purpose and lined with aluminium foil. | ||
| Submicron filter paper | MilliporeSigma | DAWP04700 | |
| Transmission electron microscope | JEOL | JEM-1400 | Any TEM operated at an accelerating voltage of 80-120 kV will be suitable for screening of negatively stained grids. |
| Trehalose | Prepare 4% trehalose solution. | ||
| Whatman #4 filter paper | MilliporeSigma | WHA1004150 | This corresponds to the 20-25 μm pore size filter paper in the protocol. |
References
- Johnson, M. C., Uddin, Y. M., Neselu, K., Schmidt-Krey, I. 2D crystallography of membrane protein single-, double- and multi-layered ordered arrays. Methods in Molecular Biology. 2215, 227-245 (2021).
- Kühlbrandt, W., Downing, K. H. Two-dimensional structure of plant light harvesting complex at 3.7 Å resolution by electron crystallography. Journal .of Molecular Biology. 207 (4), 823-828 (1989).
- Nannenga, B. L., Gonen, T. MicroED: a versatile cryoEM method for structure determination. Emerging Topics in Life Sciences. 2 (1), 1-8 (2018).
- Martynowycz, M. W., Zhao, W., Hattne, J., Jensen, G. J., Gonen, T. Collection of continuous rotation microED data from ion beam-milled crystals of any size. Structure. 27 (3), 545-548 (2019).
- Gonen, T. et al. Lipid-protein interactions in double-layered two-dimensional AQP0 crystals. Nature. 438 (7068), 633-638(2005).
- Gonen, T. The collection of high-resolution electron diffraction data. Methods in Molecular Biology. 955, 153-169 (2013).
- Wisedchaisri, G., Gonen T. Phasing electron diffraction data by molecular replacement: strategy for structure determination and refinement. Methods in Molecular Biology. 955, 243-272 (2013).
- Gipson B., Zeng X., Zhang Z. Y., Stahlberg, H. 2dx-user-friendly image processing for 2D crystals. Journal of Structural Biology. 157 (1), 64-72 (2007).
- Biyani, N. et al. Focus: The interface between data collection and data processing in cryo-EM. Journal of Structural Biology. 198 (2), 124-133 (2017).
- Righetto, R., Stahlberg, H.Single particle analysis for high-resolution 2D electron crystallography. Methods in Molecular Biology. 2215, 267-284 (2021).
