La technique du peel-blot : une méthode de préparation d’échantillons cryo-EM pour séparer les couches uniques des échantillons biologiques multicouches ou concentrés
Summary
La technique peel-blot est une méthode de préparation de grille cryo-EM qui permet de séparer des échantillons biologiques multicouches et concentrés en couches uniques afin de réduire l’épaisseur, d’augmenter la concentration des échantillons et de faciliter le traitement des images.
Abstract
La technique de préparation de la grille cryo-EM par transfert peel-blot est une méthode de rétro-injection considérablement modifiée dans le but d’obtenir une réduction des couches d’échantillons multicouches. Cette élimination des couches avant la congélation peut aider à réduire l’épaisseur de l’échantillon à un niveau approprié pour la collecte de données cryo-EM, à améliorer la planéité de l’échantillon et à faciliter le traitement de l’image. La technique peel-blot permet de séparer les membranes multilamellaires en couches simples, les cristaux 2D stratifiés en cristaux individuels et les structures empilées en feuilles de protéines solubles à séparer également en couches uniques. L’épaisseur élevée de ces types d’échantillons pose souvent des problèmes insurmontables pour la collecte de données cryo-EM et le traitement d’images cryo-EM, en particulier lorsque la platine du microscope doit être inclinée pour la collecte de données. De plus, des grilles de concentrations élevées de l’un de ces échantillons peuvent être préparées pour une collecte efficace des données, car la concentration de l’échantillon avant la préparation de la grille peut être augmentée et la technique du transfert de pelage ajustée pour aboutir à une distribution dense de l’échantillon à une seule couche.
Introduction
La technique peel-blot a été développée afin de séparer les cristaux bidimensionnels empilés de protéines membranaires en couches uniques afin d’obtenir des échantillons suffisamment minces pour la collecte de données cryo-EM 2D et 3D et de faciliter le traitement des images1. Le protocole convient également à d’autres types d’échantillons multilamellaires ainsi qu’à l’obtention de concentrations élevées d’échantillons de l’un ou l’autre type d’échantillon sur la grille sans augmenter l’épaisseur en Z.
La réduction des couches d’échantillon en une seule couche est obtenue en appliquant une combinaison de pression capillaire et de forces de cisaillement dans un protocole qui étend considérablement et modifie la méthode de rétroinjection2. Une première étape de buvard entraîne une prise en sandwich serrée et une adhérence au film de carbone et à une barre de grille de chaque côté de l’échantillon multicouche pendant le buvard sur submicron plutôt que la taille des pores du papier filtre de 20 à 25 μm dans la méthode de rétroinjection. La séparation, ou le pelage, d’une couche individuelle se produit lorsque l’on force la séparation des couches en sandwich une fois que la grille est pressée verticalement sur une goutte de tréhalose, forçant le film de carbone à s’éloigner de la barre de grille (Figure 1). Le repositionnement du film de carbone loin du point de contact d’origine avec la barre de grille se produit à l’étape suivante, lorsque la grille est à nouveau épongée sur du papier filtre submicronique. Le nombre d’itérations de ces étapes peut être optimisé pour des échantillons spécifiques. De plus, le protocole peut être utilisé pour augmenter les concentrations des échantillons tout en évitant l’agrégation en Z. En raison de la dépendance à l’adhérence à la barre de grille et au film de carbone ainsi que de la séparation forcée, cette approche peut ne pas convenir aux molécules très fragiles telles que certaines protéines et complexes protéiques délicats et / ou instables.
La technique du peel-blot ne nécessite ni équipement spécialisé ni fournitures coûteuses. L’applicabilité à des échantillons spécifiques nécessitera toutefois un examen attentif des paramètres biologiques. La décision est plus facile pour les cristaux 2D car un film de carbone est nécessaire pour assurer la planéité, mais la manipulation via la technique du peel-blot peut affecter l’intégrité biologique de l’échantillon ou l’ordre cristallin. L’adéquation de la technique peel-blot aux particules uniques est limitée et peut être testée pour celles qui nécessitent un film de carbone et sont stables à la manipulation. Les spécimens présentant des interactions biologiques critiques entre les couches peuvent ne pas convenir à la caractérisation à l’aide de la technique du peel-blot en raison de la perturbation de ces interactions.
La technique du peel-blot (« peel-blot ») est optimisée le plus rapidement par le test et le dépistage avec des échantillons négatifs ou non colorés par TEM à température ambiante. Une fois que le nombre optimal d’itérations peel-blot a été identifié, le temps nécessaire pour contrôler l’épaisseur avant la vitrification peut être déterminé.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le peel-blot est une méthode puissante pour surmonter l’empilement et l’épaisseur de cristaux 2D multicouches et d’échantillons similaires pour la collecte de données cryo-EM et le traitement d’images. Une décision sur l’utilisation du peel-blot sera basée sur les paramètres biologiques de l’échantillon et devra également être évaluée une fois qu’un modèle 3D cryo-EM sera disponible. L’importance biologique des contacts et la flexibilité potentielle des régions de contact seront particuliè…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Une partie de ce travail a été soutenue par la subvention HL090630 (ISK) des NIH.
Materials
| 600-mesh grids | SPI | 2060-C-XA | |
| Anti-capillary forceps | Ted Pella | 510-5 | |
| Carbon to coat mica | |||
| Cryo-EM | Cryo-EM grids may be screened at 120 kV or 200 kV. High-resolution data is collected at 300 kV. | ||
| Dumpont #5 forceps | Ted Pella | 5622 | |
| Grid box for cryo-EM storage | Ted Pella | 160-40 | |
| Kim Wipes | |||
| Liquid nitrogen | |||
| Mica | Ted Pella | 56 | The mica is carbon-coated and cut into squares that are slighlty larger than a TEM grid. The carbon thickness may require optimization to avoid thin carbon that breaks easily upon multiple peel blots. |
| Negative stain | 1-2% uranyl acetate is suitable for many samples. Other stains such as phosphotungstic acid can be substituted. | ||
| Parafilm | |||
| Polystyrene container | Used for vitrifying the peel-blot grid. A polystyrene shipping container can be recycled for this purpose and lined with aluminium foil. | ||
| Submicron filter paper | MilliporeSigma | DAWP04700 | |
| Transmission electron microscope | JEOL | JEM-1400 | Any TEM operated at an accelerating voltage of 80-120 kV will be suitable for screening of negatively stained grids. |
| Trehalose | Prepare 4% trehalose solution. | ||
| Whatman #4 filter paper | MilliporeSigma | WHA1004150 | This corresponds to the 20-25 μm pore size filter paper in the protocol. |
References
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