De Peel-Blot-techniek: een cryo-EM-monstervoorbereidingsmethode om enkele lagen te scheiden van meerlagige of geconcentreerde biologische monsters
Summary
De peel-blot-techniek is een cryo-EM-rastervoorbereidingsmethode die het mogelijk maakt om meerlagige en geconcentreerde biologische monsters in enkele lagen te scheiden om de dikte te verminderen, de monsterconcentratie te verhogen en de beeldverwerking te vergemakkelijken.
Abstract
De peel-blot cryo-EM grid preparation techniek is een significant gewijzigde back-injection methode met als doel het bereiken van een vermindering van lagen van meerlagige monsters. Deze verwijdering van lagen voorafgaand aan het bevriezen van de duik kan helpen bij het verminderen van de dikte van het monster tot een niveau dat geschikt is voor cryo-EM-gegevensverzameling, het verbeteren van de vlakheid van het monster en het vergemakkelijken van beeldverwerking. De peel-blot-techniek maakt het mogelijk om multilamellaire membranen in enkele lagen te scheiden, van gelaagde 2D-kristallen in individuele kristallen en van gestapelde, plaatachtige structuren van oplosbare eiwitten die eveneens in enkele lagen moeten worden gescheiden. De hoge monsterdikte van dit soort monsters levert vaak onoverkomelijke problemen op voor cryo-EM-gegevensverzameling en cryo-EM-beeldverwerking, vooral wanneer de microscoopfase moet worden gekanteld voor gegevensverzameling. Bovendien kunnen rasters van hoge concentraties van elk van deze monsters worden voorbereid voor efficiënte gegevensverzameling, omdat de monsterconcentratie voorafgaand aan de rastervoorbereiding kan worden verhoogd en de peel-blot-techniek kan worden aangepast om te resulteren in een dichte verdeling van eenlaags monster.
Introduction
De peel-blot-techniek is ontwikkeld om gestapelde tweedimensionale kristallen van membraaneiwitten in enkele lagen te scheiden om voldoende dunne monsters te verkrijgen voor cryo-EM 2D- en 3D-gegevensverzameling en beeldverwerkingte vergemakkelijken 1. Het protocol is ook geschikt voor andere soorten multilamellaire monsters en voor het bereiken van hoge monsterconcentraties van beide monstertypen op het rooster zonder de dikte in Z te vergroten.
Reductie van monsterlagen tot één laag wordt bereikt door een combinatie van capillaire druk en schuifkrachten toe te passen in een protocol dat de teruginjectiemethode aanzienlijk verlengt en wijzigt2. Een eerste blotting-stap resulteert in strakke sandwiching en hechting aan de koolstoffilm en een rasterbalk aan weerszijden van het meerlagige monster tijdens het blotting op submicron in plaats van de 20-25μm filterpapierporiëngrootte in de back-injectiemethode. De scheiding, of peeling, van een individuele laag vindt plaats bij het forceren van de scheiding van de ingeklemde lagen zodra het raster verticaal op een trehalosedruppel wordt gedrukt, waardoor de koolstoffilm weg wordt gedwongen van de rasterbalk (figuur 1). Het verplaatsen van de koolstoffilm weg van het oorspronkelijke contactpunt met de rasterbalk vindt plaats in de volgende stap, wanneer het raster opnieuw wordt uitgeveegd op submicronfilterpapier. Het aantal iteraties van deze stappen kan worden geoptimaliseerd voor specifieke voorbeelden. Bovendien kan het protocol worden gebruikt om de monsterconcentraties te verhogen en tegelijkertijd aggregatie in Z te vermijden. Vanwege de afhankelijkheid van de naleving van de rasterbalk en koolstoffilm en krachtige scheiding, is deze aanpak mogelijk niet geschikt voor zeer fragiele moleculen zoals bepaalde delicate en / of onstabiele eiwitten en eiwitcomplexen.
De peel-blot techniek vereist geen gespecialiseerde apparatuur of dure benodigdheden. Toepasbaarheid op specifieke monsters vereist echter zorgvuldige overwegingen van biologische parameters. De beslissing is gemakkelijker voor 2D-kristallen omdat koolstoffilm nodig is om vlakheid te garanderen, maar manipulatie via de peel-blot-techniek kan de biologische integriteit van het monster of de kristallijne volgorde beïnvloeden. De geschiktheid van de peel-blot-techniek voor afzonderlijke deeltjes is beperkt tot en kan worden getest voor deeltjes die koolstoffilm nodig hebben en stabiel zijn voor manipulatie. Specimens met kritische biologische interacties tussen lagen zijn mogelijk niet geschikt voor karakterisering met behulp van de peel-blot-techniek vanwege de verstoring van dergelijke interacties.
De peel-blot techniek (“peel-blot”) wordt het snelst geoptimaliseerd door testen en screenen met negatieve vlekken of niet-gekleurde monsters door TEM bij kamertemperatuur. Zodra het optimale aantal peel-blot iteraties is geïdentificeerd, kan de tijd om de dikte vóór de vitrificatie te regelen worden bepaald.
Protocol
Representative Results
Discussion
De peel-blot is een krachtige methode om stapeling en dikte van meerlaagse 2D-kristallen en soortgelijke monsters voor cryo-EM-gegevensverzameling en beeldverwerking te overwinnen. Een beslissing over het gebruik van de peel-blot zal gebaseerd zijn op biologische parameters van het monster en zal ook moeten worden beoordeeld zodra een 3D cryo-EM-model beschikbaar is. Het biologische belang van contacten en de potentiële flexibiliteit van contactregio’s zullen bij deze beoordeling bijzonder belangrijk zijn.
<p class=…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Een deel van dit werk werd ondersteund door NIH-subsidie HL090630 (ISK).
Materials
| 600-mesh grids | SPI | 2060-C-XA | |
| Anti-capillary forceps | Ted Pella | 510-5 | |
| Carbon to coat mica | |||
| Cryo-EM | Cryo-EM grids may be screened at 120 kV or 200 kV. High-resolution data is collected at 300 kV. | ||
| Dumpont #5 forceps | Ted Pella | 5622 | |
| Grid box for cryo-EM storage | Ted Pella | 160-40 | |
| Kim Wipes | |||
| Liquid nitrogen | |||
| Mica | Ted Pella | 56 | The mica is carbon-coated and cut into squares that are slighlty larger than a TEM grid. The carbon thickness may require optimization to avoid thin carbon that breaks easily upon multiple peel blots. |
| Negative stain | 1-2% uranyl acetate is suitable for many samples. Other stains such as phosphotungstic acid can be substituted. | ||
| Parafilm | |||
| Polystyrene container | Used for vitrifying the peel-blot grid. A polystyrene shipping container can be recycled for this purpose and lined with aluminium foil. | ||
| Submicron filter paper | MilliporeSigma | DAWP04700 | |
| Transmission electron microscope | JEOL | JEM-1400 | Any TEM operated at an accelerating voltage of 80-120 kV will be suitable for screening of negatively stained grids. |
| Trehalose | Prepare 4% trehalose solution. | ||
| Whatman #4 filter paper | MilliporeSigma | WHA1004150 | This corresponds to the 20-25 μm pore size filter paper in the protocol. |
References
- Johnson, M. C., Uddin, Y. M., Neselu, K., Schmidt-Krey, I. 2D crystallography of membrane protein single-, double- and multi-layered ordered arrays. Methods in Molecular Biology. 2215, 227-245 (2021).
- Kühlbrandt, W., Downing, K. H. Two-dimensional structure of plant light harvesting complex at 3.7 Å resolution by electron crystallography. Journal .of Molecular Biology. 207 (4), 823-828 (1989).
- Nannenga, B. L., Gonen, T. MicroED: a versatile cryoEM method for structure determination. Emerging Topics in Life Sciences. 2 (1), 1-8 (2018).
- Martynowycz, M. W., Zhao, W., Hattne, J., Jensen, G. J., Gonen, T. Collection of continuous rotation microED data from ion beam-milled crystals of any size. Structure. 27 (3), 545-548 (2019).
- Gonen, T. et al. Lipid-protein interactions in double-layered two-dimensional AQP0 crystals. Nature. 438 (7068), 633-638(2005).
- Gonen, T. The collection of high-resolution electron diffraction data. Methods in Molecular Biology. 955, 153-169 (2013).
- Wisedchaisri, G., Gonen T. Phasing electron diffraction data by molecular replacement: strategy for structure determination and refinement. Methods in Molecular Biology. 955, 243-272 (2013).
- Gipson B., Zeng X., Zhang Z. Y., Stahlberg, H. 2dx-user-friendly image processing for 2D crystals. Journal of Structural Biology. 157 (1), 64-72 (2007).
- Biyani, N. et al. Focus: The interface between data collection and data processing in cryo-EM. Journal of Structural Biology. 198 (2), 124-133 (2017).
- Righetto, R., Stahlberg, H.Single particle analysis for high-resolution 2D electron crystallography. Methods in Molecular Biology. 2215, 267-284 (2021).
