Tüm Beyin Tek Hücreli Görüntüleme ve MRG, Doku Temizleme ve Işık Tabakası Mikroskobu Kullanarak Bozulmamış Yenidoğan Fare Beyinlerinin Analizi

Tek hücreli çözünürlükte tüm beyin görüntüleme, nörobilimde önemli bir zorluktur. Hücresel çözünürlüklü beyin görüntüleri, beyin devresinin ayrıntılı analizine ve sistem düzeyinde haritalandırılmasına ve bu devrenin nöropsikiyatrik bozukluklar için genetik veya çevresel risk faktörleri, gelişmekte olan embriyolardaki hücresel davranış ve yetişkin beynindeki nöral devreler tarafından nasıl bozulduğuna izin verir ^1,2,3. Yeniden yapılandırılmış 3D beynin yüksek çözünürlüklü görüntülerine izin veren birden fazla histolojik yöntem vardır; Bununla birlikte, bu teknikler pahalı, özel ekipman gerektirir, immünoetiketleme ile uyumlu olmayabilir ve bazı yöntemlerin iki boyutlu (2D) doğası, ^4,5 kesiti sırasında doku hasarına ve kesmeye neden olabilir.

Son gelişmeler, doku kesiti gerektirmeyen tüm beyinleri görüntülemek için alternatif bir yaklaşım sağlamıştır; beyinleri şeffaf hale getirmek için doku temizlemeyi kullanmayı içerirler. Çoğu doku temizleme yönteminde şeffaflık, hem ışık saçılmasının önemli bir kaynağı oldukları için lipitlerin çıkarılması hem de görüntüleme sırasında nesnenin kırılma indisinin (RI) numune daldırma çözeltisinin RI ile eşleştirilmesi ile sağlanır. Işık daha sonra^dağılmadan malzemeler arasındaki sınırdan geçebilir ^6,7,8,9.

İDISCO+ gibi doku temizleme yöntemleri genellikle LSFM ^6,7,10 gibi tek foton uyarma mikroskobu kullanılarak hızlı 3D görüntüleme ile birleştirilir. Florofor ile etiketlenmiş şeffaf dokular içinde, ışık tabakası floresan mikroskopi, ince bir ışık düzlemi ile uyarılarak bölümler^{halinde görüntülenir 11}. LSFM’nin temel avantajı, bir seferde tek bir optik bölümün aydınlatılması, bu bölümdeki moleküllerden gelen tüm floresanların uyarılması ve bu da fotobeyazlatmayı en aza indirmesidir. Dahası, tüm optik dilimin görüntülenmesi, bu heyecanlı dilimin kamera tabanlı algılanmasını sağlayarak nokta tarama^12’ye göre hızı artırır. LSFM, tahribatsız bir şekilde, 3D rekonstrüksiyon için uygun olan iyi kaydedilmiş optik bölümler üretir.

iDISCO + yöntemi ~ 3 hafta içinde ucuz doku temizlemeye izin verirken, protokoldeki dehidrasyon adımları doku büzülmesine ve numune morfolojisinin potansiyel olarak değişmesine neden olabilir, böylece hacimsel ölçümleri etkileyebilir ^6,10. Doku temizleme prosedüründen önce kullanılacak MRI gibi ikincil bir görüntüleme yönteminin eklenmesi, numune boyunca doku temizlemeye bağlı büzülme derecesini ölçebilir. Dehidrasyon aşamaları sırasında, gri ve beyaz cevher arasındaki mekanik özelliklerdeki farklılıklar, düzgün olmayan beyin maddesi deformasyonlarına yol açabilir, bu da vahşi tip ve mutant numuneler arasında farklı doku temizlemeye bağlı hacim deformasyonlarına neden olabilir ve bu numunelerdeki hacimsel farklılıkların yorumlarını karıştırabilir^10,13 . MRG, ilk önce hayvanı bir kontrast madde (örneğin, gadolinyum) ile perfüze ederek, ardından görüntüleme^14’ten önce ekstrakte edilen dokuyu bir daldırma çözeltisinde (örneğin, fomblin) inkübe ederek gerçekleştirilir. MRG, doku temizleme ve aynı numune üzerinde LSFM yapılması ile uyumludur.

LSFM genellikle beyin yapısının nicel olarak değerlendirilmesinden ziyade, ilgilenilen beyin dokusunun kalitatif görselleştirmesi için büyük ölçekli mikroskopi görüntüleri oluşturmak için kullanılır (Şekil 1). Nicel değerlendirme olmadan, genetik veya çevresel hakaretlerden kaynaklanan yapısal farklılıkları göstermek zordur. Doku temizleme ve görüntüleme teknolojileri geliştikçe, depolama ve hesaplama gücünün maliyetlerinin azalmasıyla birlikte, ilgilenilen doku içindeki hücre tipi lokalizasyonlarını ölçmek daha erişilebilir hale geliyor ve daha fazla araştırmacının bu verileri çalışmalarına dahil etmesine izin veriyor.

Fare beynindeki 100 milyondan fazla hücre¹⁵ ve terabaytlarca veri üretebilen tüm beyin görüntüleme oturumlarıyla, hücreler gibi görüntülerdeki özelliklerin doğru bir şekilde ölçülmesini sağlayan gelişmiş görüntü analiz araçlarına olan talep artmaktadır. Nükleer boyama yoğunluğu için eşik uygulayan ve önceden tanımlanmış şekil, boyut veya yoğunluklara sahip nesneleri filtreleyen doku temizlenmiş görüntüler için bir dizi segmentasyon yöntemi mevcuttur^10,16,17,18. Bununla birlikte, sonuçların yanlış yorumlanması, hücre boyutu, görüntü kontrastı ve etiketleme yoğunluğu gibi parametrelerdeki değişikliklerden kaynaklanabilir. Bu makale, fare beynindeki hücre çekirdeklerini ölçmek için kurulan protokolümüzü açıklamaktadır. İlk olarak, P4 fare beyninin doku toplanması için adımları detaylandırıyoruz, ardından halka açık iDISCO+ yöntem^10’dan optimize edilmiş bir doku temizleme ve immünoetiketleme protokolü izliyoruz. İkincisi, görüntü yakalama için kullanılan parametreler de dahil olmak üzere MRI ve ışık tabakası mikroskobu kullanarak görüntü yakalamayı açıklıyoruz. Son olarak, grubumuzun geliştirdiği, doku temizleme, nükleer belirteçlerle immünoetiketleme ve açıklamalı bölgelerin ışık tabakası görüntülemesinden sonra hücre tipine özgü nicelleştirmeye izin veren bir dizi görüntü analiz aracı olan NuMorph^19’u tanımlıyoruz ve gösteriyoruz.