Modelos de transplante cardíaco de camundongos representam valiosas ferramentas de pesquisa para o estudo da imunologia do transplante. O presente protocolo detalha o transplante cardíaco cervical heterotópico de camundongos que envolve a colocação de manguitos na artéria carótida comum do receptor e no tronco da artéria pulmonar do doador para permitir o fluxo sanguíneo laminar.
Modelos murinos de transplante cardíaco são frequentemente utilizados para estudar a lesão de isquemia-reperfusão, as respostas imunes inatas e adaptativas após o transplante e o impacto das terapias imunomoduladoras na rejeição do enxerto. O transplante cardíaco cervical heterotópico em camundongos foi descrito pela primeira vez em 1991 usando anastomoses suturadas e posteriormente modificado para incluir técnicas de manguito. Essa modificação permitiu melhores taxas de sucesso e, desde então, houve vários relatórios que propuseram melhorias técnicas adicionais. No entanto, a tradução para uma utilização mais difundida permanece limitada devido à dificuldade técnica associada às anastomoses do enxerto, que requer precisão para alcançar o comprimento e o calibre adequados dos manguitos para evitar torção anastomótica vascular ou tensão excessiva, o que pode resultar em danos ao enxerto. O presente protocolo descreve uma técnica modificada para a realização de transplante cardíaco cervical heterotópico em camundongos que envolve a colocação do manguito na artéria carótida comum do receptor e na artéria pulmonar do doador em alinhamento com a direção do fluxo sanguíneo.
Abbott et al. publicaram1 a primeira descrição do transplante cardíaco abdominal heterotópico em ratos em 1964. Essas técnicas cirúrgicas foram refinadas e simplificadas por Ono et al., em 19692. Corry et al. descreveram pela primeira vez um método para transplante cardíaco abdominal heterotópico em camundongos em 1973; semelhante aos modelos de ratos relatados anteriormente, envolveu enxerto no abdome do hospedeiro com revascularização por anastomoses end-to-side da artéria pulmonar do doador e aorta ascendente para a veia cava inferior e aorta abdominal do receptor, respectivamente3. O transplante cardíaco cervical heterotópico em ratos foi descrito por Heron em 1971 com manguitos de Teflon feitos de cateteres intravenosos de 16 G (1,6 mm de diâmetro externo)4. Chen5 e Matsuura et al.6 relataram posteriormente transplante cardíaco cervical heterotópico em camundongos em 1991, cujas técnicas diferiam principalmente em seu método de re-anastomose. A abordagem de Chen envolveu anastomoses suturadas da aorta ascendente do doador para a artéria carótida do receptor e da artéria pulmonar do doador para a veia jugular externa do receptor5. Devido à habilidade técnica avançada necessária para essas anastomoses microcirúrgicas suturadas, uma quantidade significativa de tempo e experiência foi necessária para alcançar uma alta taxa de sucesso. Matsuura et al. descreveram um método utilizando uma técnica de manguito sem sutura, semelhante à utilizada por Heron, que envolveu anastomoses de ponta a ponta utilizando a colocação extraluminal de manguitos. Confeccionou manguitos de Teflon a partir de cateteres intravenosos de 22 G (0,8 mm de diâmetro externo) e 24 G (0,67 mm de diâmetro externo) e colocou-os sobre a veia jugular externa e a artéria carótida comum do receptor, respectivamente6. Esses manguitos foram então colocados dentro da artéria pulmonar e da aorta do doador e fixados amarrando uma ligadura de sutura ao redor da conexão. Esta abordagem traduziu-se numa melhor taxa de sucesso. Mais importante ainda, resultou em um encurtamento do tempo necessário para completar ambas as anastomoses cervicais, reduzindo assim o tempo isquêmico quente do enxerto para menos de um terço do que utiliza o método de sutura abdominal. Além disso, como os manguitos são colocados ao redor da superfície externa do vaso, não há corpo estranho exposto à luz do vaso, o que reduz em grande parte a possibilidade de trombose após a cirurgia7. Enquanto isso, a utilização da técnica do manguito fornece suporte ao redor dos vasos no local da anastomose sem a necessidade de sutura, o que reduz o risco de sangramento após a revascularização6.
Numerosas revisões desta técnica foram propostas. Para acomodar o curto comprimento da artéria carótida comum do camundongo (aproximadamente 5 mm), Tomita et al.8 desenvolveram uma modificação dessa técnica com um manguito arterial menor (0,6 mm de diâmetro externo), omitindo suturas de retenção e puxando a artéria diretamente através do manguito com pinça fina. Wang et al. simplificaram ainda mais essa abordagem, colocando manguitos 22 G e 24 G na artéria pulmonar direita do doador e na artéria carótida comum direita do receptor, respectivamente9. Vários relatos descreveram modificações nessas abordagens, incluindo o uso de manguitos especializados, grampos microcirúrgicos, dilatadores de vasos e cardioplegia10,11,12. Notavelmente, todos esses métodos envolvem a circulação retrógrada do sangue através do coração, com o sangue fluindo da artéria carótida comum receptora para a aorta doadora, as artérias coronárias, o seio coronário, esvaziando então para o átrio direito e saindo da artéria pulmonar para a veia jugular externa receptora.
Em comparação com o enxerto no abdômen, o transplante cardíaco cervical oferece múltiplas vantagens. Como mencionado anteriormente, a exposição cervical permite uma revascularização mais rápida e tempos isquêmicos quentes mais curtos6. O método cervical também é menos invasivo e está associado a menores tempos de recuperação pós-operatória, pois evita uma laparotomia6. É importante ressaltar que anastomoses de ponta a ponta com manguitos podem ser realizadas em vez de anastomoses de ponta a ponta, o que diminui o risco de complicações como sangramento anastomótico. A abordagem abdominal também representa um risco aumentado de desenvolver complicações trombóticas na aorta abdominal ou veia cava inferior, levando a isquemia da medula espinhal e paralisia dos membros posteriores. A localização cervical superficial do transplante permite fácil acesso à avaliação da viabilidade do enxerto por palpação, eletrocardiografia e imagens invasivas ou não invasivas. Embora os enxertos cervicais retomem a atividade cardíaca espontânea após a reperfusão, eles não afetam significativamente os parâmetros sistólicos e diastólicos do receptor. Este modelo fornece informações valiosas para o estudo das respostas celulares após o transplante, como lesão de isquemia-reperfusão e rejeição do enxerto. Além disso, este modelo oferece uma abordagem ideal para permitir imagens pós-transplante, como microscopia intravital de dois fótons ou tomografia por emissão de pósitrons (PET). Para tanto, nosso laboratório já relatou métodos de imagem de tecidos e órgãos em movimento em camundongos, incluindo batimento de corações murinos e enxertos de arco aórtico após transplante cervical heterotópico para visualizar o tráfico de leucócitos durante lesão de isquemia-reperfusão e dentro de placas ateroscleróticas, respectivamente13,14,15 . Além disso, devido à sua localização superficial e facilidade de exposição, esse modelo é adequado para o retransplante cardíaco16.
Este relato descreve uma técnica que permite o fluxo sanguíneo laminar com a colocação externa dos manguitos vasculares nos vasos de onde se origina o fluxo sanguíneo. Isso permite uma transição suave do fluxo sanguíneo de um vaso para o outro, evitando a exposição da borda do vaso distal no lúmen vascular. Além disso, a técnica utiliza um manguito maior de 20 G, em vez de manguitos de 22 G usados anteriormente, para a artéria pulmonar doadora para garantir amplo retorno do fluxo sanguíneo para o receptor.
Utilizando esta técnica, o transplante cardíaco cervical heterotópico de camundongo pode ser realizado em menos de 40 minutos por um microcirurgião experiente e em aproximadamente 60 minutos por um microcirurgião de nível básico. Embora o transplante cardíaco cervical tenha sido estudado em numerosos modelos animais, um modelo de camundongo continua sendo o padrão-ouro devido a múltiplas cepas genéticas bem definidas, capacidades de alteração genética e disponibilidade de numerosos reagentes, incluindo anti…
The authors have nothing to disclose.
A DK é apoiada pelos subsídios dos Institutos Nacionais de Saúde 1P01AI116501, R01HL094601, R01HL151078, Veterans Administration Merit Review grant 1I01BX002730 e The Foundation for Barnes-Jewish Hospital.
6-0 braided silk ties | Henry Schein Inc | 7718729 | |
0.75% Providone iosine scrub | Priority Care Inc | NDC 57319-327-0 | |
10-0 nylon suture | Surgical Specialties Corporation | AK-0106 | |
655-nm nontargeted Q-dots | Invitrogen | Q21021MP | |
70% Ethanol | Pharmco Products Inc | 111000140 | |
8-0 braided silk ties | Henry Schein Inc | 1005597 | |
Adson forceps | Fine Science Tools Inc | 91127-12 | |
BALB/c and C57BL/6 mice (6-8 weeks) | Jackson Laboratories | ||
Bipolar coagulator | Valleylab Inc | SurgII-20, E6008/E6008B | |
Carprofen (Rimadyl) injection | Transpharm | 35844 | |
Carprofen (Rimadyl) oral chewable tablet | Transpharm | 38995/37919 | |
Custom-built 2P microscope running ImageWarp acquisition software | A&B Software | ||
Dumont no. 5 forceps | Fine Science Tools Inc | 11251-20 | |
Fine vannas style spring scissors | Fine Science Tools Inc | 15000-03 | |
GraphPad Prism 5.0 | Sun Microsystems Inc. | ||
Halsey needle holder | Fine Science Tools Inc | 91201-13 | |
Halsted-Mosquito clamp curved tip | Fine Science Tools Inc | 91309-12 | |
Harvard Apparatus mouse ventilator model 687 | Harvard Apparatus | MA1 55-0001 | |
Heparin solution (100 U/mL) | Abraxis Pharmaceutical Products | 504031 | |
Imaris | Bitplane | ||
Ketamine (50 mg/kg) | Wyeth | 206205-01 | |
Microscope—Leica Wild M651 × 6–40 magnification | Leica Microsystems | ||
Moria extra fine spring scissors | Fine Science Tools Inc | 15396-00 | |
Ohio isoflurane vaporizer | Parkland Scientific | V3000i | |
Qdots | ThermoFisher | 1604036 | |
S&T SuperGrip Forceps angled tip | Fine Science Tools Inc | 00649-11 | |
S&T SuperGrip Forceps straight tip | Fine Science Tools Inc | 00632-11 | |
Sterile normal saline (0.9% (wt/vol) sodium chloride | Hospira Inc | NDC 0409-4888-20 | |
Sterile Q-tips (tapered mini cotton tipped 3-inch applicators) | Puritan Medical Company LLC | 823-WC | |
Surflow 20 gauge 1/4-inch Teflon angiocatheter | Terumo Medical Corporation | SR-OX2032CA | |
Surflow 24 gauge 3/4-inch Teflon angiocatheter | Terumo Medical Corporation | R-OX2419CA | |
ThermoCare Small Animal ICU System (recovery settings 3 L/min O2, 80 °C, 40% humidity) | Thermocare Inc | ||
VetBond | Santa Cruz Biotechnology SC361931 | NC0846393 | |
Xylazine (10 mg/kg) | Lloyd Laboratories | 139-236 |