ラットモデルにおける乳癌予防のための乳管内エタノール焼灼治療のX線可視化

記載されているすべての実験は、ミシガン州立大学の施設動物管理および使用委員会によって承認されたプロトコルの下で実施されました。 1.拡張抗炎症治療 カルプロフェンの経口投与としてスクラロースゲルカップを準備します。70%EtOHのID注射を受ける2日前から手順の7日まで、ラットにこの抗炎症治療を提供します。 カルプロフェンの作業溶液を滅菌PBSで希釈してカップに注射する。50 mg/mLストック溶液から、1%v/v滅菌青色食用色素で着色された希釈2 mg/mL溶液を調製し、各カップに500 μLを注入します。染料の添加は、カップのスクラロース内の薬物の完全な混合の視覚化に役立ちます。 製造元の推奨に従って、カルプロフェンを追加するためのカップを準備します。ベンダーから特に指示がない限り、汚染のリスクを減らすために、カップを60°Cの水浴で15分間温め、取り外したら乾かします。スクラロースカップの蓋を70%EtOHで拭き取り、カルプロフェン作業溶液を含むシリンジの針を導入します。適切な容量(500 μL)を分注します。 パンクをステッカーで覆います。カップを15秒間精力的に振ってから、そのカップをさらに15秒間渦の中に置きます。後で使用するために保管する前に、均質で完全な混合を視覚的に評価します。濃い青色の存在を探します。注意: カップを室温に戻します。必要に応じてカップを室温で保管しますが、製造元からの薬効ガイダンスに注意してください。または、カップを4°Cで保管し、1か月以内に使用してください。ステッカーの日付を記入することは、ペンや鋭いマーカーが蓋に穴を開けるリスクなしに注射日を追跡するための良い習慣です。 使用直前に、70%EtOHでカップの外側を拭き取ってください。カップを動物ケージに入れる前に蓋を外してください。カップは一日おきまたは空のときに交換してください。適切な投与量を確保するために、毎日ゲルのレベルを確認してください。.1カップで最大2匹のラットに最大2日間カルプロフェンを供給することができます。ただし、ラットはカップ全体をより早く消費する可能性があります。 2.術前の準備 注意: 動物の準備ステップがID注射手順より2〜3日先行していることを確認してください。 イソフルラン気化器(2%-3%イソフルラン、1.5 L /分の酸素)をオンにして、ラットに麻酔をかけます。.動物を加温パッドの上のノーズコーンに移動します。ラットに目の潤滑剤を塗布し、動物を背中に配置します。動物の呼吸を注意深く監視して、麻酔面がイソフルランの1%〜3%に維持されていることを確認します。注意: 電気かみそりを使用して、脱毛前に余分な毛皮を取り除くことができます。かみそりで乳首を傷つけないように細心の注意を払う必要があります。このため、この手順はスキップできます。ラットはマウスよりも脱毛クリームに敏感であるため、余分なクリームの除去は非常に重要です。脱毛による擦り傷がすでに存在する領域にエタノール含有溶液を注入することは避けてください。一部のクリームには、擦り傷の可能性を最小限に抑えるのに役立つアロエやラノリンなどの化合物が追加されています。 コットンチップアプリケーターを使用して、市販の脱毛クリームを乳首領域に広げます。アプリケーターを使用して、クリームをその領域に10〜30秒間こすりつけます。毛皮がすぐに緩んだかどうかを確認します。クリームをラットにできるだけ短い間隔で放置し、皮膚のやけどを防ぐために完全に取り除きます。ラットはマウスよりもこの手順にさらに敏感です。 10〜30秒塗布した後、ガーゼを温水で濡らし、それを使用してクリームと緩んだ毛皮を動物から洗い流します。新鮮な湿らせたガーゼでその領域を少なくとも3回すすぎ、最後のすすぎの後に乾いたガーゼで乾かします。毛皮が取り除かれた場所から乳首の領域への良好な視認性とアクセスを確認します。必要に応じて脱毛手順を繰り返します。 ラットを加熱パッドの上のきれいなケージに入れ、回復させます。ラットをチェックして、麻酔から完全に回復していることを確認してから、永久ケージに戻します。 抗炎症治療のために、カルプロフェンを投与した(1 mg /カップ)スクラロースゲルカップをケージに入れます。.ゲルの消費量を毎日チェックし、必要に応じて新しいカップと交換してください。カップを2日以上放置しないでください。通常、カップは1日後に交換する必要があります。 3.管内注射 滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を用いて19に記載のように333.3mMでTaOxストック溶液を調製する。粉末が完全に溶解しない場合は、溶液を温めます。穏やかにかき混ぜる。気泡の形成を避けるために、渦を巻いたり激しく振ったりしないでください。 333.3 mM TaO x 3部と 100% EtOH 7 部を混合して、最終的な 70% EtOH 100 mM/TaOx 溶液にします。任意選択で、ゲル化剤として0.5%〜1.5%エチルセルロース(EC)の適量を添加して、アブレーション溶液の局所保持を最大化する。注入中の乳管樹への送達を目視検査するために、アブレーション溶液に1%v / v青色食用染料を追加します。 実験のニーズに適したボリュームを準備します。腺ペア1(子宮頸部)と6(鼠径部)には最大100 μLの溶液を充填でき、他のすべてのペアは最大300 μLで充填できます。 ステップ2.1のようにラットを麻酔し、完全に麻酔されたらラットをノーズコーンに移動します。両目に目の潤滑剤を塗り、動物を背中に置きます。必要に応じて、注射される乳首の近くにテープを使用して、ステレオスコープの下にラットを固定します。ラットの体重は、一般に、テーピングなしで実質的に動かないようにするのに十分です。 注射用の乳首を準備するには、可能であれば、乳首の開口部を細かい先のとがった鉗子で覆っている死んだ皮膚を取り除きます。ラットは、乳首の開口部から突き出たプラグを持っていることが多く、取り外さないと乳首のカニューレ挿入の成功を妨げる可能性があります。注:ラットで使用されているアブレーション溶液の注射量が多いと、注射部位の近くに表在性の皮膚創傷が生じる可能性が高いことに注意することが重要です。.このため、1回のセッションで他のすべての乳首を注射することは、隣接する乳首を注射するよりも動物への損傷と刺激が少なくなります。注射後7日間、ラットの擦り傷を監視することで、動物の引っかき傷による深刻な健康への影響がなく、ケージの床の破片による汚染による感染の可能性が導入されないようにすることができます。トリプル抗生物質軟膏またはクロルヘキシジン溶液による洗浄は、発生する可能性のある傷害感染の兆候を治療するために使用できます(表1)。 33 Gの針が付いた500 μLのシリンジを使用して、101〜301 μLのアブレーション溶液を吸引します。カニューレ針を取り外すときに軽微な漏れを防ぐために、追加の1μLの溶液を吸引します。注:これらは、乳管樹を完全に満たすことを目的とした量の推奨事項です:頸部腺と鼠径部腺で最大100μL、その他の腺で最大300μL。他のアプリケーションでは、小さいボリュームまたは大きいボリュームを使用するのが適切な場合があります。 ピンセットを使用して乳首をそっと保持し、針を乳首の開口部にカニューレ挿入します。ベベルが乳首の中に完全に入るまで、針をそっと挿入し続けます。針を乳首に収めるには、針を乳首に押し下げるのではなく、乳首を針に向かって持ち上げます。(表1)。乳首の開口部の経路をたどるように注意してください。注:ラットの乳首は、サイズが大きいため、一般的にマウスの乳首よりも操作とカニューレ挿入がはるかに簡単です。ただし、乳首開口部周辺の脂肪量が増えると、針が主管から外れた場合に誤って脂肪パッドを注入する可能性も高くなります。 針のかさばが完全に挿入されたら、ラットに約100 μL / minの一定速度で溶液をゆっくりと注入します。.注入速度の急激な変化は、管の木を破裂または損傷する可能性があります。注入終了後30秒間待ってから、鉗子を使用して補助してカニューレの木から針を外す。これにより、注入された量が管樹内に留まり(図2)、漏れの可能性が減少します。 画像に余分なコントラスト溶液を避けるために、湿らせたガーゼまたはEtOHワイプでこぼれた溶液を取り除きます。 ID注射液にエタノールが含まれている場合、アルコール中毒の影響を軽減するために、5%ショ糖(10 mL / kg)を含むPBSを腹腔内に注射します。.この用量は、手順の開始時および終了時に投与することができる。 4. マイクロCTイメージング すべての所望の腺が注入された後、動物をマイクロCTシステムに素早く移動させ、組み込まれたイソフルラン気化器を使用して麻酔を維持し続ける。 動物の背骨をまっすぐにし、各後肢を伸ばした位置にテープで留めて、動物の脚の骨が関心のある下部腺からさらに離れ、スキャンされた画像の関心領域と重ならないようにします。 腹部を横切ってテープで留めて、下部腺をスキャンする場合の呼吸のアーチファクトを最小限に抑えます。注:ラットの放射線の適切な許容生涯線量を決定し、累積線量がこのレベルを超えないように注意が払われる場合、動物はさまざまなスキャンパラメータ(高解像度、縦断スキャンなど)で画像化できます。放射線被曝は、スキャンを行わずに透視静止画やビデオを取得することでさらに低減できます(図2)。 ラット乳管樹のTaOxイメージング を良好な解像度で実行し、次のスキャンパラメータを使用して標準(2分)取得スキャンを繰り返す機会があります:90 kVp/88 μA;視野 (FOV), 72 mm;スライス数、512;スライスの厚さ、72μm;ボクセル分解能、72 μm3。より長い期間(4〜14分)の高解像度スキャンは、同じパラメータを使用して縦方向にスキャンされない動物でも取得できます。 データ取得後、ラットを麻酔コーンから慎重に離し、加熱パッド上の新しい清潔なケージに入れます。ラットをチェックして、麻酔から完全に回復してから、永久ケージに戻します。カルプロフェン含有スクラロースカップを置き、ステップ2.5の説明に従って適切に交換して、動物が次の7日間抗炎症治療を受け続けるようにします。. スキャンした画像をマイクロCTソフトウェア内ですばやくレンディション処理して、コントラストの漏れ、部分的な充填のみ、または過剰充填をよりよく理解します(図2)。 次のセクションに進み、必要に応じて、公開用の正式な画像処理またはスキャンの詳細な分析を実行します(図3)。 5. 画像解析 専用のソフトウェアパッケージを使用して、塗りつぶされたダクタルツリーのレンダリングを作成します。注:注入された乳管樹の最良の表現を得るために、乳脂肪パッドをセグメント化することが最善です。スプラインは、このセグメンテーションを達成するために、動物の厚さ全体にわたって脂肪パッドの暗い境界をトレースします。 対象の乳管ツリーが含まれているファットパッド(マウスとは異なり、このコンパートメントの境界は、同様のハウンズフィールドユニットのため、腹腔、大腿筋、および皮膚と簡単に区別できません)をセグメント化するには、手動メニューから「スプライントレース」オプションを選択することが、レンダリングを作成する最初のステップです。 スプラインは、3 スライスごとにファットパッドの輪郭をトレースします。半自動メニューから[ オブジェクトの伝播 ]オプションをクリックします。これにより、すべてのスライスが伝播され、関心のある単一のセグメント化されたオブジェクトに接続されます。注:セグメント化された領域内のしきい値を変更すると、ハウンズフィールドユニット(HU)の特定範囲内でのみ信号を視覚化できます。他の造影剤または画像パラメータについては、この範囲を調整する必要があるかもしれません。ソフトウェアパッケージまたは人工知能分析を使用して、他の測定値や画像を作成し、ダクトツリーがどれだけ満たされたかを示すことができます。 しきい値ボリュームタブの下の半自動メニューで、HU値を下限300および最高点3,000に設定します。これにより、ダクトツリー内のコントラスト(TaOx)のみを表示するレンディションを作成できます。 「表示」ボタンを使用してレンディションをプライマリとして設定します。これにより、ダクタルツリーの3Dレンディションのみを表示するように表示が変更されます。注意: さらに分析するために、管樹の再建を実行します。