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Bioengineering

Erzeugung von Multicue-Zellmikroumgebungen durch UV-Photostrukturierung von dreidimensionalen Zellkultursubstraten

Published: June 02, 2022
doi:
10.3791/63988
, , , , ,
1Department of Biomedical Engineering,Eindhoven University of Technology, 2Institute for Complex Molecular Systems,Eindhoven University of Technology

Summary

Traditionell wird die Zellkultur auf planaren Substraten durchgeführt, die die natürliche Umgebung von Zellen in vivo schlecht nachahmen. Hier beschreiben wir eine Methode zur Herstellung von Zellkultursubstraten mit physiologisch relevanten gekrümmten Geometrien und mikrostrukturierten extrazellulären Proteinen, die systematische Untersuchungen der zellulären Erfassung dieser extrazellulären Hinweise ermöglicht.

Abstract

Die extrazelluläre Matrix ist ein wichtiger Regulator der Zellfunktion. Es hat sich zunehmend gezeigt, dass Umwelthinweise, die in der zellulären Mikroumgebung vorhanden sind, wie die Ligandenverteilung und die Gewebegeometrie, eine entscheidende Rolle bei der Steuerung des Zellphänotyps und -verhaltens spielen. Diese Umwelthinweise und ihre Auswirkungen auf Zellen werden jedoch oft separat mit In-vitro-Plattformen untersucht, die einzelne Hinweise isolieren, eine Strategie, die die komplexe In-vivo-Situation mehrerer Hinweise stark vereinfacht. Technische Ansätze können besonders nützlich sein, um diese Lücke zu schließen, indem experimentelle Aufbauten entwickelt werden, die die Komplexität der In-vivo-Mikroumgebung erfassen und dennoch den Grad an Präzision und Manipulierbarkeit von In-vitro-Systemen beibehalten.

Diese Studie hebt einen Ansatz hervor, der ultraviolette (UV)-basierte Proteinstrukturierung und lithographiebasierte Substratmikrofabrikation kombiniert, die zusammen eine Hochdurchsatzuntersuchung des Zellverhaltens in Multicue-Umgebungen ermöglichen. Mittels maskenloser UV-Photostrukturierung ist es möglich, komplexe, adhäsive Proteinverteilungen auf dreidimensionalen (3D) Zellkultursubstraten auf Chips zu erzeugen, die eine Vielzahl von klar definierten geometrischen Hinweisen enthalten. Die vorgeschlagene Technik kann für Kultursubstrate aus verschiedenen polymeren Materialien eingesetzt und mit adhäsiv strukturierten Bereichen einer breiten Palette von Proteinen kombiniert werden. Mit diesem Ansatz können sowohl einzelne Zellen als auch Monoschichten Kombinationen von geometrischen Hinweisen und Kontaktführungshinweisen ausgesetzt werden, die von den gemusterten Substraten präsentiert werden. Systematische Forschung mit Kombinationen von Chipmaterialien, Proteinmustern und Zelltypen kann so grundlegende Einblicke in zelluläre Reaktionen auf Multicue-Umgebungen liefern.

Introduction

In vivo sind Zellen einer Vielzahl von Umwelteinflüssen ausgesetzt, die mechanischer, physikalischer und biochemischer Natur sein können und von der extrazellulären Matrix (ECM) ausgehen. Es wurden zahlreiche Umwelthinweise identifiziert, die eine wichtige Rolle bei der Regulation des Zellverhaltens spielen, wie Proliferation, Differenzierung und Migration 1,2,3,4,5. Eines der am häufigsten untersuchten Phänomene ist die Kontaktführung, die die adhäsionsvermittelte Zellausrichtung entlang anisotroper biochemischer oder topographischer Muster auf dem extrazellulären Substrat 6,7,8,9,10,11 beschreibt. Neben der Ausrichtung von Zellen wurde auch gezeigt, dass Kontaktführungshinweise andere Zelleigenschaften wie Zellmigration, Organisation intrazellulärer Proteine, Zellform und Zellschicksalbeeinflussen 12,13,14,15. Darüber hinaus wurde die geometrische Architektur der zellulären 3D-Umgebung auch für ihren regulatorischen Einfluss auf das Zellverhaltenanerkannt 16,17. Im menschlichen Körper sind Zellen einer Reihe von gekrümmten Geometrien ausgesetzt, die von mikroskaligen Kollagenfasern, Kapillaren und Glomeruli bis hin zu mesoskaligen Alveolen und Arterien18,19 reichen. Interessanterweise haben neuere In-vitro-Studien gezeigt, dass Zellen solche physikalischen Hinweise wahrnehmen und darauf reagieren können, vom Nano- bis zum Mesomaßstab20,21,22,23.

Bis heute wurden die meisten Studien, die die Zellreaktion auf Umwelthinweise untersuchen, weitgehend mit experimentellen Aufbauten durchgeführt, die einzelne Hinweise isolieren. Während dieser Ansatz enorme Fortschritte beim Verständnis der grundlegenden Mechanismen hinter der zellulären Erfassung von Umwelthinweisen ermöglicht hat, rekapituliert er schlecht die In-vivo-Umgebung, die gleichzeitig mehrere Hinweise präsentiert. Um diese Lücke zu schließen, ist es sinnvoll, Kulturplattformen zu entwickeln, mit denen mehrere Umwelthinweise unabhängig voneinander und gleichzeitig gesteuert werden können. Dieses Konzept hat in letzter Zeit an Zugkraft gewonnen 24,25, mit Studien, die Matrixsteifigkeit und Ligandendichte 26,27,28,29, Substratsteifigkeit und Porosität 30, Substratsteifigkeit und 3D-Mikronischenvolumen 31, Oberflächentopographie und Kontaktführungshinweise 32,33,34 kombinieren , und nanoskalige Kontaktführungshinweise mit mesoskaligen Krümmungsführungshinweisen23. Es bleibt jedoch eine Herausforderung, Kontaktführungshinweise mit einer Vielzahl von 3D-Geometrien kontrolliert und mit hohem Durchsatz zu kombinieren.

Dieses Forschungsprotokoll befasst sich mit dieser Herausforderung und führt eine Methode zur Herstellung von Zellkultursubstraten mit einer kontrollierten Kombination von gemusterten Klebebereichen von ECM-Proteinen (Kontakt-Guidance-Cues) und Substratkrümmung (geometrische Hinweise) ein. Dieser Ansatz ermöglicht die systematische und hochdurchlässige Dissektion der Zellantwort in einer biomimetischen Multicue-Umgebung. Das erworbene Wissen kann zum weiteren Verständnis des Zellverhaltens in komplexen Umgebungen beitragen und kann verwendet werden, um lehrreiche Materialien mit Eigenschaften zu entwerfen, die Zellantworten in ein gewünschtes Ergebnis lenken.

3D-Protein-Photostrukturierung
Die Erstellung von Klebeflächen von ECM-Proteinen (Kontakt-Guidance-Cues) auf Zellkulturmaterialien kann mit einer Vielzahl von Techniken erreicht werden, beispielsweise durch tief-ultraviolette (Tief-UV) Strukturierung oder Mikrokontaktdruck35,36. Die Tief-UV-Strukturierung nutzt UV-Licht, das durch eine Maske auf ein polymeres Material projiziert wird, um Passivierungspolymere an bestimmten Stellen auf dem Zellkultursubstrat abzubauen. Das gemusterte Substrat wird dann mit einem Liganden von Interesse inkubiert, was zu Klebebereichen führt, die die Zellbefestigung und -kultur an vordefinierten Stellen unterstützen 12,37,38. Eine alternative Möglichkeit, Proteinmuster einzuführen, ist der Mikrokontaktdruck, bei dem Elastomerstempel, die eine gewünschte Form enthalten, mit einem Protein der Wahl beschichtet und auf ein Zellkultursubstrat gepresst werden, wodurch die Proteinbeschichtung übertragen wird, an die Zellen 35,37,39,40 haften können. . Da beide Techniken auf Maskenvorbereitung und weichen Lithographiemethoden basieren, sind die Experimente leider zeitaufwendig und arbeitsintensiv sowie in Bezug auf die Musterflexibilität begrenzt. Darüber hinaus eignen sich sowohl die Tief-UV-Strukturierung als auch der Mikrokontaktdruck am besten für planare Materialien und sind technisch schwierig, wenn nicht gar unmöglich, für die Strukturierung von Liganden in einer 3D-Umgebung.

Um diese konventionellen Methoden zu verbessern, kombinierten Waterkotte et al. maskenlose Lithographie, chemische Gasphasenabscheidung und Thermoformung, um mikrostrukturierte 3D-Polymersubstratezu erzeugen 41. Diese Technik beruht jedoch auf der Verwendung thermoformbarer Polymerfilme und bietet eine niedrige Proteinmusterauflösung (7,5 μm), während Zellen auf geometrische Proteinmuster von nur 0,1 μm 2,42 reagieren. Sevcik et al. beschrieben eine weitere vielversprechende Methode zur Nanomuster-ECM-Liganden auf Substraten, die Nano- und Mikrometertopographien enthalten43. Mittels Mikrokontaktdruck wurden ECM-Proteine von Polydimethylsiloxan (PDMS)-Stempeln auf ein thermoresponsives Poly(N-Isopropylacrylamid)-Substrat (pNIPAM) übertragen. Anschließend erlaubte ihnen die thermoresponsive Eigenschaft des pNIPAM-Netzwerks, das zweidimensionale (2D) Proteinmuster auf ein topographisches PDMS-Substrat (10-100 μm tiefe Rillen) zu übertragen und so die Lokalisation von Adhäsionsstellen auf topographischen Merkmalen zu steuern. Allerdings können nicht alle möglichen Mikrotopographien gemustert werden, da verminderte Benetzbarkeitsprobleme es schwieriger machen, tiefere topographische Substrate zu strukturieren. Es wurde berichtet, dass Gräben mit einem Verhältnis von Tiefe zu Breite von 2,4 die ultimative Grenze für die erfolgreiche Übertragung des Musters auf das topographische Substrat43 darstellen. Darüber hinaus sind die Flexibilität variierender Muster und die Auflösung der generierten Muster aufgrund der Anforderung des Mikrokontaktdrucks schlecht.

Dieses Papier beschreibt eine Methode, die die oben genannten Engpässe überwindet und eine flexible und Hochdurchsatzmethode zur Herstellung von Multicue-Substraten bietet, die für die Zellkultur verwendet werden können (siehe Abbildung 1). Physiologisch relevante Geometrien (Zylinder, Kuppeln, Ellipsen und Sattelflächen) mit Krümmungen von ĸ = 1/2500 bis ĸ = 1/125 μm-1 werden in PDMS-Chips vorkonstruiert und mikrofabriziert. Anschließend werden Kontaktführungshinweise auf den 3D-Geometrien unter Verwendung einer Vielzahl von digitalen Musterdesigns erstellt, indem eine Photopatterning-Technik mit einer Auflösung von nur 1,5 μm44 verwendet wird. Dazu werden die PDMS-Chips zunächst passiviert, um zu verhindern, dass Zellen und Proteine anhaften; Diese Passivierungsschicht kann dann durch Kombination des Photoinitiators 4-Benzoylbenzyl-trimethylammoniumchlorid (PLPP) und UV-Lichteinwirkung45 entfernt werden. Eine digitale Maske wurde entwickelt, um die Orte der UV-Exposition und damit den Bereich anzugeben, in dem die Passivierungsschicht entfernt wird. Proteine können anschließend an diesen Bereichen haften bleiben und so die Zellanheftung ermöglichen. Da die Musterung mit einer digitalen (und nicht mit einer physischen) Maske durchgeführt wird, kann eine Vielzahl von Mustern schnell erstellt werden, ohne den Aufwand und die Kosten, die mit dem Entwerfen und Herstellen zusätzlicher Fotomasken verbunden sind. Darüber hinaus kann eine Vielzahl von ECM-Proteinen (z. B. Kollagen Typ I, Gelatine und Fibronektin) auf dem Substrat gemustert werden. Obwohl dieses Protokoll mit Zellkulturchips aus PDMS durchgeführt wird, kann das Prinzip auf jedes andere Material von Interesse angewendet werden46.

Protocol

In den in diesem Protokoll beschriebenen Studien wurden primäre humane Keratozyten verwendet. Diese Forschung wurde in Übereinstimmung mit den Grundsätzen der Erklärung von Helsinki durchgeführt. Primäre Keratozyten wurden aus übrig gebliebenem menschlichem Kadaver-Korneoskleralgewebe aus Descemet Membrane Endothelial Keratoplasty Surgery isoliert, die von der Hornhautabteilung des ETB-BISLIFE Multi-Tissue Center (Beverwijk, Niederlande) nach Einholung der Zustimmung der nächsten Angehörigen aller verstorbenen Spender erhalten wurden. HINWEIS: In der Materialtabelle finden Sie Details zu allen Materialien, Reagenzien, Geräten und Software, die in diesem Protokoll verwendet werden. 1. Herstellung von 3D-Zellkultursubstraten Erstellen Sie eine Negativglasform , die alle interessanten Merkmale enthält, in diesem Fall aus Glas mit einer Femtosekunden-Laser-Direktschreibtechnik (siehe Abbildung 2). Legen Sie die Negativglasform vorsichtig auf den Boden einer Petrischale. Bereiten Sie ein PDMS-Prepolymer vor, indem Sie ein leeres konisches 50-ml-Rohr auf eine Waage legen, die Waage tären und die gewünschte Menge an Silikonelastomerbasis in die Tube gießen. Fügen Sie Härter mit einer Pasteur-Pipette hinzu, so dass das Endverhältnis von Elastomerbasis und Härter 10:1 (w/w) beträgt. Mischen Sie die Komponenten im konischen Rohr gründlich mit einem Spatel. Zentrifugieren Sie bei 2.000 × g für 70 s, um alle Luftblasen zu entfernen. Gießen Sie das PDMS-Prepolymer auf die Negativglasform in der Petrischale, um es vollständig abzudecken. Legen Sie die Petrischale mit der Negativglasform und dem PDMS-Prepolymer in den Vakuum-Exsikkator und starten Sie die Vakuumpumpe. Sobald ein Vakuum erreicht ist, warten Sie 5 Minuten, um alle Blasen zu entfernen, die an der Grenzfläche zwischen der Formoberfläche und dem PDMS-Prepolymer vorhanden sind. Entfernen Sie das Vakuum und nehmen Sie die Petrischale aus dem Exsikkator. Das PDMS-Prepolymer über Nacht im Ofen bei 65 °C aushärten. Entfernen Sie vorsichtig den neu ausgehärteten positiven PDMS-Chip aus der Negativglasform , indem Sie die Kanten des PDMS mit einem Spatel anheben. Wenn der positive PDMS-Chip dazu neigt, an der negativen Glasform zu haften, fügen Sie beim Anheben Ethanol oder Wasser an die Kanten des Abdrucks hinzu.HINWEIS: Die Flüssigkeit läuft zwischen den beiden Schichten und erleichtert die Trennung der Negativglasform und des positiven PDMS-Chips . Schneiden Sie mit einer Klinge die Seiten des positiven PDMS-Chips ab, so dass ein rechteckiger Chip übrig bleibt. Legen Sie den positiven PDMS-Chip in einen Exsikkator neben einer kleinen Durchstechflasche mit einem Tröpfchen Tridecafluor (1,1,2,2-tetrahydrooctyl) trichlorsilan, einem Silanisierungsmittel, und lassen Sie es über Nacht unter Vakuum.HINWEIS: Durch die Silanisierung wird sichergestellt, dass der Abdruck später im Protokoll nicht an andere PDMS-Schichten gebunden wird. Andere Silanisierungsmittel und/oder -methoden können ebenfalls sicherstellen, dass die Oberflächen der PDMS-Chips nicht an anderen PDMS-Schichten haften bleiben.ACHTUNG: Tridecafluor(1,1,2,2-tetrahydrooctyl)trichlorsilan ist brennbar (H226) und verursacht schwere Hautverbrennungen und Augenschäden (H314). Tragen Sie persönliche Schutzausrüstung, arbeiten Sie in einem Abzug und waschen Sie sich nach der Handhabung gründlich die Hände. Halten Sie das Silanisierungsmittel von Hitze, heißen Oberflächen, Funken, offenen Flammen und anderen Zündquellen fern. Zwischen 15 und 30 °C lagern (P280, P210, P240, P403, P235, P310). Entfernen Sie das Vakuum und legen Sie den positiven PDMS-Chip auf den Boden einer Petrischale. Gießen Sie PDMS-Prepolymer (10: 1) darauf, um mehrere negative PDMS-Formen zu erzeugen . Stellen Sie die Petrischale 15 Minuten lang unter Vakuum in den Exsikkator, um alle Blasen zu entfernen. Das PDMS-Prepolymer wird über Nacht bei 65 °C ausgehärtet, woraufhin die negative PDMS-Form mit einem Spatel vom positiven PDMS-Chip abgezogen werden kann. Silanisieren Sie die endgültige negative PDMS-Form mit Silanisierungsmittel in einem Vakuum-Exsikkator über Nacht. Herstellung von Mehrfachzellkulturchips (#4, siehe Abbildung 2) mit einer Dicke von ca. 5 mm, indem PDMS-Prepolymer in die negative PDMS-Form gegossen wird (+), Blasen mit dem Exsikkator entfernt und 3 h bei 65 °C ausgehärtet werden. Schneiden Sie den Chip mit einer Rasierklinge auf die endgültige Größe, wie in Abbildung 2 dargestellt. Lagern Sie die Chips bei Raumtemperatur.HINWEIS: Die Oberflächenrauheit kann die zelluläre Reaktion beeinflussen. Bei Bedarf kann eine zusätzliche dünne Schicht PDMS als Beschichtung auf dem positiven PDMS-Chip verwendet werden, um die Oberfläche zu glätten. Gießen Sie dazu einen kleinen Tropfen PDMS-Prepolymer auf den Chip und verteilen Sie ihn mit Druckluft auf den gesamten Chip. Härten Sie den beschichteten Chip bei 65 °C für 3 h aus und fahren Sie mit Schritt 1.12 fort. 2. Herstellung von flachen PDMS-Proben (Kontrollproben) PDMS-Prepolymer (10:1) gemäß den Schritten 1.3-1.6 herstellen. Legen Sie einen Glasdeckel auf den abgerundeten Vakuumpfosten in der Mitte des Spincoaters. Schalten Sie das Vakuum ein, um das Glasdeckglas an der Maschine zu befestigen, und pipettieren Sie ein Tropfen PDMS in der Mitte des Deckglases mit einer Pasteur-Pipette. Verteilen Sie das PDMS-Prepolymer unter Verwendung des folgenden Protokolls über das Glassubstrat, um eine etwa 10 μm dicke Schicht zu erhalten.Spincoat für 10 s bei 0,45 × g, Beschleunigung: 0,2 × g/s. Spincoat für 50 s bei 44,8 × g, Beschleunigung: 0,54 × g/s. Schalten Sie das Vakuum aus, entfernen Sie das Deckglas mit einer Pinzette vom Spincoater und legen Sie es in eine Petrischale. Das PDMS über Nacht im Ofen bei 65 °C aushärten und anschließend bei Raumtemperatur lagern. 3. Substratpassivierung von 3D-Zellkultursubstraten Aktivieren Sie die Hydroxylgruppen auf der Oberfläche des PDMS-Chips mitO2-Plasma. Legen Sie den Chip mit einer Pinzette in den Korb des Plasma-Ashers. Führen Sie einen Aschezyklus mit einer Leistung von 20 W für 30 s durch. Entlüften Sie die Aschekammer mit N2. Nehmen Sie den Chip aus dem Korb und legen Sie ihn in einen kleinen PDMS-Behälter (siehe Abbildung 1). Mit einer Pasteur-Pipette werden 500 μL Poly-L-Lysin (PLL, 0,01%) auf die Oberseite des Chips gegeben, so dass die gesamte Oberfläche in die PLL-Lösung eingetaucht wird. 30 min bei Raumtemperatur inkubieren. Entfernen Sie 450 μL des PLL mit einer Pipette vom Zellkulturchip und spülen Sie die Chipoberfläche dreimal mit 500 μL 0,1 M HEPES-Puffer (8 < pH < 8,5) ab. Lassen Sie immer ein kleines Flüssigkeitsvolumen auf dem PDMS-Chip, um ein Austrocknen der Probe zu vermeiden, wodurch die endgültige Musterqualität verringert wird. 500 μL eines 50 mg/ml Methoxypolyethylenglykol-Succinimidylvalerats (mPEG-SVA; MW 5.000 Da) Lösung in 0,1 M HEPES-Puffer (8 < pH < 8,5) pro Zellkulturchip und 60 min auf der Probe inkubieren lassen. Da der mPEG-SVA eine Halbwertszeit von 15 min hat, stellen Sie sicher, dass Sie die erforderliche Menge kurz vor dem Gebrauch vorbereiten.HINWEIS: Die mPEG-SVA wird aufgelöst, wenn die Lösung vollständig transparent ist. Entfernen Sie 450 μL der mPEG-SVA-Lösung mit einer Mikropipet und waschen Sie die Chipoberfläche fünfmal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Stellen Sie sicher, dass Sie mehrmals pro Waschgang auf und ab pipettieren, um sicherzustellen, dass alle ungebundenen mPEG-SVA entfernt werden. Um zu verhindern, dass die Probe austrocknet, minimieren Sie die Zeit zwischen den Waschschritten und achten Sie darauf, einen Überschuss (500 μL oder mehr) PBS zum Waschen zu verwenden. Speichern Sie die Proben, indem Sie sie in PBS eintauchen oder mit dem Musterungsschritt des Protokolls fortfahren.HINWEIS: Falls gewünscht, kann die Passivierung unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden, wenn in einem Kulturschrank gearbeitet wird und mit sterilen Lösungen und Geräten gearbeitet wird. 4. Lagerung von gemusterten Zellkultursubstraten HINWEIS: 3D-Zellkultursubstrate können in verschiedenen Prozessschritten gelagert werden. Lagern Sie ausgehärtete PDMS-Zellkulturchips unter trockenen Bedingungen bei Raumtemperatur. Lagern Sie die passivierten Zellkulturchips auf eine der beiden folgenden Arten:Bis zu 7 Tage in PBS bei 4 °C lagern. Bis zu mehreren Monaten unter trockenen Bedingungen lagern. Um trockene Proben zu erhalten, entfernen Sie das PBS und spülen Sie es mehrmals mit doppelt destilliertem Wasser (ddH2O) ab. Föhnen Sie mit einer Stickstoff- oder Luftpistole. 5. Design von digitalen Masken für die Fotostrukturierung HINWEIS: Die Strukturierung von 3D-Substraten kann mit einer oder mehreren Fokusebenen durchgeführt werden (siehe Abbildung 3). Eine einzelne Fokusebene kann für Merkmale verwendet werden, die nicht größer als ein digitales Spiegelgerät (DMD, ca. 300 μm x 500 μm) und nicht zu hoch (50-100 μm) sind. In diesem Fall entwerfen Sie ein digitales Muster mit dem TIFF-Modus. Bei Merkmalen, die die Abmessungen eines DMD überschreiten und relativ hoch sind, teilen Sie die Musterung des Substrats in mehrere Schritte auf. In diesem Fall werden im PDF-Modus mehrere Muster entworfen, die sich alle einzeln auf einzelne Fokusebenen konzentrieren. Entwerfen Sie eine digitale Maske mit Design-Software-Tools.Musterung im TIFF-Modus (Pixel): Erstellen Sie eine komplett schwarze Zeichenfläche von 1.140 x 1.824 Pixeln (die genaue Größe von 1 DMD, ca. 300 μm x 500 μm) und füllen Sie die Zeichenfläche mit den gewünschten Formen. Exportieren Sie die Zeichenfläche als 8-Bit-TIFF-Datei.HINWEIS: Verschiedene Graustufen im Musterdesign bestimmen die Menge an Belichtung, die an dieser Stelle durchgeführt wird. Musterung im PDF-Modus (metrische Einheiten): Erstellen Sie eine schwarze Zeichenfläche der gewünschten Größe in mm und füllen Sie die Zeichenfläche mit einer beliebigen gewünschten Form. Teilen Sie das Muster in mehrere Dateien auf, wenn das 3D-Substrat mit mehreren Fokusebenen gemustert werden soll. Speichern Sie die Zeichenfläche als PDF-Datei.HINWEIS: Verschiedene Graustufen im Musterdesign bestimmen die Menge an Belichtung, die an dieser Stelle durchgeführt wird. 6. UV-Photostrukturierung von 3D-Zellkultursubstraten KalibrierungHINWEIS: Die Kalibrierung des Lasers wird durchgeführt, um den richtigen Fokus auf das Material von Interesse zu erhalten. Da die PDMS-Zellkultursubstrate zu dick sind, um sie zu durchmustern, verwenden Sie einen Glasschieber, auf dem der Chip kopfüber platziert wird. Da der Laser zuerst auf den Glasschieber trifft, verwenden Sie Glas, um den Laser zu kalibrieren.Tragen Sie den fluoreszierenden Textmarker auf einen Glasdecker auf und legen Sie den Glasdecker in die Stufe des fluoreszierenden Mikroskops. Stellen Sie sicher, dass die hervorgehobene Oberfläche nach oben zeigt. Schalten Sie das Mikroskop und das PRIMO-Gerät ein und öffnen Sie den Micro-Manager, um unter “Plugins” auf die Leonardo-Software zuzugreifen. Wählen Sie im Anfangsmenü Kalibrierung , gefolgt von der Auswahl des 20-fachen Objektivs sowohl am Mikroskop als auch in der Software. Klicken Sie auf Weiter. Legen Sie den Glasobjektträger mit fluoreszierendem Textmarker in den Strahlengang des Mikroskops. Wechseln Sie in den fluoreszierenden Modus und konzentrieren Sie sich sorgfältig auf das angezeigte PRAMO-Bild, um sicherzustellen, dass sowohl das Logo als auch der Text im Fokus sind. Klicken Sie auf Weiter, um den Kalibrierungsvorgang abzuschließen. Notieren Sie sich bei der Kalibrierung die Z-Position der Stufe und verwenden Sie diese Position später im Protokoll als Referenz.HINWEIS: Das Kalibriermaterial sollte mit dem Material übereinstimmen, das später im Protokoll für die Strukturierung verwendet wird. Die obigen Schritte beschreiben die Kalibrierung, die für die Zellkultursubstrate erforderlich ist. Für die Kalibrierung von flachen PDMS-Kontrollproben wenden Sie den fluoreszierenden Textmarker auf eine zusätzliche flache PDMS-Probe an und kalibrieren Sie sie mit den Schritten 6.1.2-6.1.5. Strukturieren von 3D-Features mit einer einzigen FokusebeneHINWEIS: Die Strukturierung mit einer einzelnen Brennebene erfolgt bei 3D-Features, die die Abmessungen eines DMD (ca. 300 μm x 500 μm) nicht überschreiten. Ein Schema des Aufbaus der Fokusebene ist in Abbildung 3 dargestellt.Entfernen Sie den Kalibrierungsobjektträger von der Bühne und legen Sie einen Glasobjektträger mit einem Tropfen (~ 50 μL) Photoinitiator (PLPP) in die Bühne.ACHTUNG: PLPP reizt die Augen, die Atemwege und die Haut (R36-38). Tragen Sie persönliche Schutzausrüstung, halten Sie sie von explosiven Stoffen fern, fügen Sie diesem Produkt niemals Wasser hinzu, ergreifen Sie Vorsichtsmaßnahmen gegen statische Entladungen und vermeiden Sie Stöße und Reibung (S26-36). Legen Sie das PDMS-Zellkultursubstrat kopfüber in den Tropfen des Photoinitiators. Stellen Sie sicher, dass die 3D-Merkmale auf der Oberfläche des Zellkultursubstrats dem Glasobjektträger zugewandt sind und vollständig in PLPP eingetaucht sind, um eine ordnungsgemäße Musterung zu gewährleisten. Wählen Sie in der Software Muster aus. Wechseln Sie auf dem Mikroskop in den Hellfeldmodus und verschieben Sie die Bühne auf die gewünschte Funktion. Konzentrieren Sie sich auf die Ober- oder Unterseite konvexer bzw. konkaber Strukturen (Abbildung 3). Wählen Sie PRIMO aus, um ein Muster Ihrer Wahl einzufügen. Beobachten Sie die Mustervorschau in Orange über dem Live-Hellfeldbild. Passen Sie die Musterungseinstellungen je nach Merkmal an (Position, Winkel, Wiederholungen) und wählen Sie eine Dosis von 1.000 mJ/mm2. Klicken Sie auf Sperren und schalten Sie das Mikroskop in den Fluoreszenzmodus . Klicken Sie auf die Schaltfläche Wiedergabe rechts unten auf dem Bildschirm, um die Musterung zu starten. Wenn Sie fertig sind, beobachten Sie das Muster, das grün angezeigt wird. Wenn Sie mit allen Merkmalen eines Zellkulturchips fertig sind, entfernen Sie den Chip aus dem Musterungsobjektträger und lagern Sie ihn in PBS bei 4 °C. Strukturieren von 3D-Features mit mehreren FokusebenenHINWEIS: Die Musterung mit mehreren Fokusebenen erfolgt bei 3D-Merkmalen, die größer als ein DMD (ca. 300 μm x 500 μm) oder relativ hoch sind. In diesem Fall müssen die 3D-Features in mehreren Schritten gemustert werden, d.h. das Musterdesign sollte entsprechend dem Beispiel in Abbildung 3 angepasst werden.Entfernen Sie den Kalibrierungsobjektträger von der Bühne und legen Sie einen Glasobjektträger mit einem Tropfen (~ 50 μL) Photoinitiator (PLPP) in die Bühne. Legen Sie den PDMS-Zellkulturchip kopfüber mit einer Pinzette in den Tropfen des Photoinitiators. Wählen Sie in der Software Muster aus. Wechseln Sie auf dem Mikroskop in den Hellfeldmodus und verschieben Sie die Bühne auf die gewünschte Funktion. Konzentrieren Sie sich auf den Bereich des Chips an der richtigen Stelle. Da die Musterung in einer einzigen Fokusebene durchgeführt wird und die Features größer als ein einzelnes DMD sind, verwenden Sie mehrere Fokusebenen und damit mehrere Runden der Musterung pro 3D-Substrat, um eine ausreichende Musterauflösung entlang der gesamten Höhe und Breite des Features sicherzustellen (siehe Abbildung 3). Mustern Sie beispielsweise für ein Feature mit einer Höhe von 150 μm das Feature in drei Runden (± 1 Brennebene pro 50 μm Z-Federweg) und fokussieren Sie sich um 25 μm, 75 μm und 125 μm von der Unterseite des Features. Stellen Sie sicher, dass der untere Rand des Features um den in Schritt 6.1.5 notierten Wert liegt. Wählen Sie PRIMO aus, um das Muster Ihrer Wahl einzufügen. Beachten Sie die orange dargestellte Mustervorschau über dem Live-Hellfeldbild. Passen Sie die Musterungseinstellungen je nach Merkmal (Position, Winkel) an und wählen Sie eine Dosis von 1.000 mJ/mm2. Klicken Sie auf Sperren und schalten Sie das Mikroskop in den Fluoreszenzmodus . Klicken Sie auf die Schaltfläche Wiedergabe rechts unten auf dem Bildschirm, um die Musterung zu starten. Wenn Sie fertig sind, beobachten Sie das Muster, das grün angezeigt wird. Wiederholen Sie die Schritte 6.3.4-6.3.8 für das Feature von Interesse, wenn mehrere Fokusebenen verwendet werden. Sobald Sie mit allen Merkmalen eines Zellkulturchips fertig sind, entfernen Sie den Chip vom Musterobjektträger und lagern Sie ihn in PBS bei 4 ° C.HINWEIS: Wenn gewünscht, tragen Sie die UV-Photostrukturierung unter sterilen Bedingungen unter Verwendung von Petrischalen mit Glasboden auf und bereiten Sie alle Substrate in sterilen Kulturschränken vor. Lagern Sie die gemusterten Proben bis zu einigen Wochen in PBS. Wenn sie mit ddH2O gewaschen und mit Druckluft getrocknet werden, können die Proben bis zu einigen Monaten bei 4 °C gelagert werden. 7. Proteininkubation HINWEIS: Es wird empfohlen, frisch proteininkubierte Substrate für die Zellkultur zu verwenden. Fahren Sie nur dann mit diesem Teil des Protokolls fort, wenn die Zellaussaat (Schritt 8) direkt danach durchgeführt wird. Übertragen Sie den gemusterten Zellkulturchip in sterile PDMS-Behälter im Kulturschrank. Waschen Sie die gemusterten Zellkulturchips 3x mit einem Überschuss an sterilem PBS, wenn die Musterung nicht unter sterilen Bedingungen durchgeführt wurde. Bereiten Sie eine frische Proteinlösung in PBS vor.Fibronektin: 2 ml PBS mit einer Mikropipet in eine Durchstechflasche mit 20 μg Rhodamin-markiertem Fibronektin geben, um eine Konzentration von 10 μg/ml zu erhalten. Pipettieren Sie vorsichtig, um die Bildung von Proteinklumpen zu vermeiden und vor Licht zu schützen. Gelatine: 200 μL Aliquot gelöster Gelatine-Fluorescein-Gelatine. Vor Licht schützen. Fügen Sie 200-500 μL der Proteinlösung mit einem Mikropipett zum Zellkulturchip hinzu. Stellen Sie die Inkubationszeit und -temperatur je nach ausgewähltem Protein ein: Fibronektin: 5 min bei Raumtemperatur, Gelatine: 15 min bei 37 °C. Achten Sie darauf, die Probe abzudecken (z. B. mit Aluminiumfolie). Entfernen Sie die Proteinlösung und waschen Sie sie 5x mit 500 μL sterilem PBS. Stellen Sie sicher, dass Sie das PBS mehrmals über alle relevanten Merkmale des Zellkulturchips nach oben und unten pipettieren, um ungebundenes Protein zu entfernen.HINWEIS: Während der Waschschritte ist es wichtig, dass die Probe niemals austrocknet. Wenn Sie die Proteinlösung oder PBS während des Waschens entfernen, fügen Sie sofort neues PBS hinzu, um die Bildung von Proteinklumpen zu verhindern (siehe Abbildung 4). Konvexe Merkmale sind besonders empfindlich gegen Austrocknung, da sie über der Substratoberfläche erhöht sind. Optional: Überprüfen Sie die Proteinmuster unter einem Fluoreszenzmikroskop. Halten Sie die Proben steril und tauchen Sie in PBS ein. 8. Zellaussaat HINWEIS: Dieses Protokoll verwendet menschliche primäre Keratozyten und humane dermale Fibroblasten. Die Keratozyten wurden aus menschlichem Hornhautgewebe von Patienten in Übereinstimmung mit den niederländischen Richtlinien für die sekundäre Verwendung von Materialien gewonnen und zuvor als Keratozyten47 charakterisiert. Diese Zellen werden in DMEM kultiviert, ergänzt mit 5% fetalem Rinderserum (FBS), 1% Penicillin / Streptomycin (P / S) und 1 mM L-Ascorbinsäure 2-Phosphat-Sesquimagnesiumsalzhydrat (Vitamin C) bei 37 ° C für maximal vier Passagen. Humane dermale Fibroblasten wurden gekauft und in DMEM kultiviert, ergänzt mit 10% FBS und 1% P / S bei 37 ° C für maximal 15 Passagen. Für die Aussaat von Keratozyten und dermalen Fibroblasten auf dem photostrukturierten Zellkulturchip wurden 20.000 Zellen pro Chip verwendet. Lösen Sie die interessierenden Zellen (z. B. mit Trypsin) und bereiten Sie 1 ml einer Zellsuspension von ± 10.000-50.000 Zellen / ml in Kulturmedium pro Chip vor. Passen Sie die genaue Anzahl der pro Substrat hinzugefügten Zellen in Abhängigkeit von der Zellgröße und der gewünschten Anzeige an. Entfernen Sie das PBS vom Zellkulturchip und fügen Sie 1 ml der Zellsuspension hinzu. Transportieren Sie den Zellkulturchip vorsichtig mit den Zellen zum Inkubator und inkubieren Sie für 60 min bei 37 °C. Überprüfen Sie die Adhäsion der Zellen auf dem gemusterten Zellkulturchip unter einem Hellfeldmikroskop. Suchen Sie bei Linienmustern nach länglichen Zellmorphologien (siehe Abbildung 5). Wenn Zellen auch außerhalb des gemusterten Bereichs zu haften begonnen haben, entfernen Sie diese, indem Sie das Medium direkt über den Zellen auf dem Substrat nach oben und unten pipettieren.HINWEIS: Zellen, die an den gemusterten Bereich angehängt sind, bleiben angehängt, während sich Zellen außerhalb der gemusterten Bereiche lösen. Entfernen Sie den Zellkulturchip aus dem PDMS-Behälter und verwenden Sie eine sterile Pinzette, um ihn in eine 6-Well-Platte zu legen, die mit ~ 5 ml Kulturmedium gefüllt ist. Kultivieren Sie die Zellen für die gewünschte Zeitdauer. Ersetzen Sie das Zellkulturmedium alle 2-3 Tage. Um die Visualisierung des Proteinmusters nach der Zellkultur zu gewährleisten, reduzieren Sie die Lichtexposition der Probe während der Kultur. 9. Färbung, Bildaufnahme und Analyse Fixierung und FärbungNach der gewünschten Kulturlänge fast das gesamte Medium entfernen und dreimal mit überschüssigem PBS waschen. Als nächstes inkubieren Sie mit 3,7% Formalin für 15 min bei Raumtemperatur, gefolgt von drei Waschschritten mit PBS für 5 min pro Waschgang bei Raumtemperatur. Lassen Sie die Probe niemals austrocknen.VORSICHT: Formalin ist schädlich, wenn es verschluckt oder eingeatmet wird (H302, H332), kann eine allergische Hautreaktion hervorrufen (H317), steht im Verdacht, genetische Defekte zu verursachen (H341) und kann Krebs verursachen (H350). Tragen Sie persönliche Schutzausrüstung und arbeiten Sie in einem Abzug. Färben Sie das Zellkultursubstrat mit den gewünschten Färbemitteln oder Antikörpern. Um das Volumen der Färbemittel zu reduzieren, legen Sie die Zellkulturchips kopfüber in einen Tröpfchen Färbelösung, der auf einen Glasobjektträger pipettiert wird. Lagern Sie die Proben in PBS (kurzfristig) oder befestigt an einem Deckglas mit Montagemedium (langfristig) bei 4 °C. BildaufnahmeLegen Sie die gefärbte Probe kopfüber in einen Tropfen PBS auf einen Glasobjektträger. Legen Sie die Probe in den Stadium eines konfokalen Mikroskops. Je nach gewünschtem Detaillierungsgrad erstellen Sie Z-Stacks mit einem geeigneten Objektiv (10x, 20x oder 40x) und Z-Abstand, um eine ordnungsgemäße Bildaufnahme zu gewährleisten. Bildanalyse und VisualisierungÖffnen Sie die Rohbilddateien in einer Bildanalysesoftware und überprüfen Sie, ob die Bildeigenschaften (z. B. Abmessungen, Auflösung) korrekt sind. Passen Sie bei Bedarf die Helligkeit und den Kontrast pro Kanal an. Schneiden Sie den interessierenden Bereich zu, der das Muster und die Zellen enthält. Optional: Führen Sie bei Bedarf einen Dekonvolutionsschritt durch. Erstellen Sie ein 3D-Rendering des Z-Stacks mit einer 3D-Rendering-Software. Optimieren Sie die Kontrast- und Verstärkungseinstellungen für jeden einzelnen Kanal. Um ein Bild des 3D-Renderns zu erstellen, erstellen Sie einen Schnappschuss und exportieren Sie ihn als . TIFF-Datei. Um einen Film des 3D-Renderings zu erstellen, legen Sie den Start- und Endframe sowie den Zeitrahmen fest, bevor Sie den Film registrieren. Exportieren als .avi.

Representative Results

Mittels des beschriebenen Protokolls können 3D-PDMS-Zellkultursubstrate UV-photostrukturiert werden, um präzise und hochdurchlässige Klebeflächen zu schaffen, die für die Zellbefestigung geeignet sind. Auf diese Weise werden Zellen sowohl relevanten Substratgeometrien als auch Haftligandenmustern gleichzeitig ausgesetzt. Zelleigenschaften wie Orientierung, Zellfläche und Anzahl der fokalen Adhäsionen können leicht überwacht und verwendet werden, um das Zellverhalten in komplexen, in vivo-ähnlichen Umgebungen besser zu verstehen. Um die Musterungsereignisse auf den 3D-PDMS-Substraten zu überprüfen, wurden atomare Oberflächenzusammensetzungen des Materials in verschiedenen Phasen des Protokolls mit atomarer Röntgen-Photoelektronenspektroskopie (XPS)48 gemessen. Zusammenfassend zeigten die XPS-Messungen das Vorhandensein von PEG-Ketten mit einem erhöhten Kohlenstoffsignal auf passivierten Proben, das nach der Photostrukturierung reduziert wurde. Die Inkubation mit Fibronektin führte zu einer Zunahme des Kohlenstoffsignals, was wiederum auf eine erfolgreiche Proteinadhäsion auf der Oberfläche des Zellkulturchips hinweist. Als nächstes wurden die Musterauflösung und -ausrichtung auf 3D-Merkmalen auf einer Vielzahl von kreisförmigen, konkaven Gruben charakterisiert (ĸ = 1/250 μm-1, ĸ = 1/1.000 μm-1 und ĸ = 1/3.750 μm-1, siehe Abbildung 6). Aus den Projektionen mit maximaler Intensität kann geschlossen werden, dass das Proteinmuster auf allen drei 3D-Merkmalen erfolgreich gemustert wurde. Das Intensitätsprofil in Abbildung 6A zeigt eine hohe Musterauflösung mit scharfen Übergängen zwischen gemusterten und nicht gemusterten Bereichen. Zusätzlich wurde eine konsistente Proteinintensität über das gesamte Muster in der Grube erhalten. Die konkave Grube mit ĸ = 1/250 μm-1 wurde nach der Einzelbrennebene (ein Muster) gemustert, während die Gruben mit ĸ = 1/1.000 μm-1 und ĸ = 1/3.750 μm-1 mit zwei bzw. drei Fokusebenen (Mustern) gemustert wurden. Wie in den Projektionen mit maximaler Intensität in Abbildung 6 zu sehen ist, führen beide Methoden zu einer perfekten Ausrichtung der Muster auf den Features. Es können keine falsch ausgerichteten Übergänge zwischen den beiden unterschiedlichen Fokusebenen und -mustern beobachtet werden. Mit dem beschriebenen Protokoll kann eine breite Palette von Proteinmusterdesigns auf eine Vielzahl von Geometrien angewendet werden (siehe Abbildung 7 und Video 1). Um die Vielseitigkeit dieser Methode zu veranschaulichen, wurden Halbzylinder (konvex und konkav), eine Sattelfläche und eine Grube mit Linien und Kreisen unterschiedlicher Breite gemustert. Die photostrukturierten Materialien können anschließend für die Zellkultur verwendet werden (siehe Abbildung 7, Abbildung 8, Video 2, Video 3 und Video 4). Ein Beispiel für dermale Fibroblasten, die auf einem gemusterten (Fibronektinlinien, rot, 5 μm breit und 5 μm Lücken) konkaven Halbzylinder kultiviert sind, ist in Abbildung 8, Abbildung 9 und Video 4 dargestellt. Während des Experiments spüren und haften die Zellen am Multicue-Zellkultursubstrat und bleiben im Laufe der Zeit lebensfähig. Wie aus der immunfluoreszierenden Färbung in Abbildung 8 hervorgeht, bilden Zellen fokale Adhäsionen (Vinkulin-Cluster) hauptsächlich an den Fibronektinlinien. Eine weitere Beispielstudie, die diese Zellkulturmaterialien verwendet, wurde kürzlich von unserer Gruppe48 veröffentlicht. In dieser Studie wurden menschliche Myofibroblasten und Endothelzellen der Kombination von Kontaktleitlinien und geometrischen Topographien unterzogen. In vivo erfahren beide Zelltypen Krümmungs- und Kontaktführungshinweise in nativen Geweben wie im menschlichen Gefäßsystem. Indem die Zellen in vitro einer Umgebung ausgesetzt werden, die beide Umwelthinweise kombiniert, kann die In-vivo-Situation rekapituliert werden, was zu einem tieferen Verständnis der Rolle der Mikroumgebung für das Zellverhalten führt. Es wurde gezeigt, dass sich menschliche Myofibroblasten mit Kontaktführungshinweisen (parallele Fibronektinlinien) auf konkaven zylindrischen Substraten ausrichten48. Bei konvexen Strukturen mit zunehmenden Krümmungen überstimmten die geometrischen Hinweise jedoch die biochemischen Hinweise, was darauf hindeutet, dass Myofibroblasten sowohl den Grad als auch das Vorzeichen der Krümmung wahrnehmen können. Interessanterweise konnten Endothelzellen nur an den konkaven Multicue-Substraten und nicht an den konvexen PDMS-Substraten haften. Auf konkaven, proteingemusterten Substraten sind die Endothelzellen in Richtung des Kontaktleitfadens ausgerichtet. Dieses grundlegende In-vitro-Wissen hat physiologische Relevanz auf dem Gebiet des vaskulären Tissue Engineering und kann schließlich bei der Entwicklung intelligenter Tissue-Engineering-Konstrukte helfen. Abbildung 1: Die experimentelle Zeitleiste der Anwendung von Kontaktführungshinweisen auf 3D-Zellkultursubstrate. Zunächst werden positive Zellkulturchips aus einer negativen PDMS-Form hergestellt, die eine Reihe von Geometrien enthält. Nicht ausgehärtetes PDMS wird in die Form gegossen und 3 h bei 65 °C ausgehärtet. Anschließend wird das PDMS mitO2-Plasma behandelt und mit PLL und mPEG-SVA (blau, markiert) inkubiert, um die Oberfläche des Zellkultursubstrats zu passivieren. Nach dem Waschen wird das Substrat in einem Tropfen Photoinitiator (PLPP, grün, markiert) auf den Kopf gestellt und mit dem LIMAP-Ansatz UV-photostrukturiert. Hier wird eine digitale Maske mit einem benutzerdefinierten Muster verwendet, um die Passivierungsschicht an definierten Stellen zu spalten. Als nächstes kann eine Proteinlösung (rot, markiert) inkubiert werden und haftet nur an den Stellen, an denen die Passivierungsschicht entfernt wird. Zellen, die auf dem Substrat ausgesät sind, werden sowohl Geometrie- als auch Proteinmustern unterzogen, was die Erforschung des Zellverhaltens in komplexen, in vivo nachahmenden Umgebungen ermöglicht. Abkürzungen: PDMS = Polydimethylsiloxan; mPEG-SVA = Methoxypolyethylenglykol-Succinimidylvalerat; PLPP = 4-Benzoylbenzyl-trimethylammoniumchlorid; LIMAP = Lichtinduzierte molekulare Adsorption von Proteinen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Abbildung 2: Verschiedene Stadien während der Herstellung und Passivierung des 3D-Zellkultursubstrats. Die Negativglasform wird mit computergestützter Designsoftware entworfen und mit einer Femtosekunden-Laser-Direktschreibtechnik hergestellt. Diese Form wird verwendet, um den intermediären positiven PDMS-Chip und die negative PDMS-Form herzustellen, die anschließend zur Herstellung des endgültigen Zellkulturchips verwendet werden . Abkürzung: PDMS = Polydimethylsiloxan. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Abbildung 3: Schematische Darstellung der beiden Musterungsmethoden. Links: Die UV-Photostrukturierung wird auf kleineren Merkmalen (ungefähr einem DMD) unter Verwendung einer einzigen Fokusebene und eines einzigen Musters durchgeführt. Dadurch wird das komplette Feature in einem Rutsch gemustert. Rechts: Wenn größere Features verwendet werden (größer als ein DMD), wird die Musterung auf mehrere Fokusebenen und Muster aufgeteilt. Abkürzung: DMD = Digital Mirror Device. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Abbildung 4: Ein typisches Beispiel für ein normales und ausgetrocknetes proteininkubiertes Substrat. Projektionen mit maximaler Intensität (XY) und orthogonale Ansichten (XZ) von normalen und ausgetrockneten proteininkubierten Substraten. Beim Waschen eines gemusterten Zellkultursubstrats nach der Inkubation mit einer Proteinlösung ist es wichtig, die Probe immer nass zu halten. Obwohl das Muster in allen Bildern auf den Merkmalen identisch ist (ĸ = 1/1.000 μm-1), bildete das Gelatine-Fluorescein (grün) einen großen Klumpen, wenn die Probe einige Sekunden trocknen gelassen wurde. Bleibt die Probe immer nass, können korrekte Proteinmuster beobachtet werden. Maßstabsstäbe = 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 5: Hellfeldbilder nach dem Seeding Primäre Keratozyten (links) und dermale Fibroblasten (rechts) 4 h nach der Aussaat auf geometrischen 3D-Merkmalen (konkave Grube von ĸ = 1/1.000 μm-1 und Halbzylinder von ĸ = 1/500, 1/375, 1/250, 1/175 und 1/125 μm-1). Die Einsätze oben links stellen das Linienmuster dar, das für die Musterung der Geometrien verwendet wird. Weiße Pfeile zeigen sich ausbreitende Zellen an, die bereits ausgerichtet sind. Maßstabsbalken = 250 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 6: Charakterisierung von Kreismustern auf konkaven Gruben. (A) Die maximale Intensität Projektion (XY) und orthogonale Ansicht (XZ) der akonkaven Grube (ĸ = 1/250 μm-1), die mit LIMAP (Linienbreite: 20 μm, Spaltbreite: 20 μm) strukturiert und mit Gelatine-Fluorescein (grün) inkubiert wurde. Das Intensitätsprofil entlang der weißen Linie wird gegen die Entfernung gezeichnet, was eine konsistente Musterqualität und Auflösung zeigt. (B) Zusätzliche Musterung an konkaven Gruben mit ĸ = 1/1.000 μm-1 und ĸ = 1/3750 μm-1, die Flexibilität in Bezug auf geometrische Merkmale zeigt, die für die Musterung verwendet werden können. Auch hier werden sowohl die Projektionen mit maximaler Intensität (XY) als auch die orthogonalen Ansichten (XZ) visualisiert. Maßstabsstäbe = 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 7: 3D-Mikroskopiedaten von gemusterten Strukturen. Typische Beispiele für 3D-gemusterte Zellkulturmaterialien nach Photostrukturierung und Zellkultur, visualisiert mit 3D-Rendering-Software. (A) Konvexe Halbzylinder mit 10 μm breiten Linien (Rhodamin-Fibronektin, rot) und 10 μm breiten Lücken. Skalenbalken = 5 μm. (B) Dermale Fibroblasten, die für F-Aktin (grün) gefärbt sind, kultiviert auf konkaven Halbzylindern mit 20 μm breiten Linien (Rhodamin-Fibronektin, rot) und 20 μm breiten Lücken. Skalenbalken = 5 μm. (C) Satteloberfläche mit 20 μm breiten Linien (Rhodamin-Fibronektin, rot) und 20 μm breiten Lücken. Maßstabsleiste = 5 μm. (D) Konkave Grube mit konzentrischen Kreisen von 20 μm breiten Linien (Gelatine-Fluorescein, grün) und 20 μm breiten Lücken. Das F-Actin-Zytoskelett der menschlichen Keratozyten wird mit Phalloidin gefärbt und rot visualisiert. Maßstabsleiste = 200 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Abbildung 8: Immunfluoreszierende Färbung menschlicher dermaler Fibroblasten auf einem photostrukturierten, konkaven Halbzylinder. (A) Projektion mit maximaler Intensität (XY) und orthogonale Schnitte (XZ und YZ) von menschlichen dermalen Fibroblasten, die 24 h lang auf einem gemusterten (Fibronektinlinien, rot, 5 μm breit und 5 μm Lücken) konkaven Halbzylinder kultiviert wurden. Die Zellen sind für F-Actin (Magenta), Vinculin (grün) und Kerne (blau) gefärbt. Maßstabsleiste = 100 μm. (B) Zoom-in einer Zelle, die an der Multicue-Umgebung haftet. Maßstabsbalken = 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Abbildung 9: Hellfeld-Zeitrafferbilder menschlicher dermaler Fibroblasten auf einem gemusterten, konkaven Zylinder. Der konkave Halbzylinder (ĸ = 1/250 μm-1) wurde mit parallelen Linien (5 μm breit und 5 μm Lücken) gemustert und vor der Zellaussaat mit Rhodamin-Fibronektin inkubiert. Die Zeitrafferbildgebung wird 1 h nach der ersten Zellaussaat (links, 0 min) gestartet, wenn die Zellen noch abgerundet und nicht adhärent sind (Pfeile). Nach ca. 24 h (Mitte, 1.420 min) haften die Zellen am Multicue-Substrat und zeigen eine Ausrichtungsreaktion gemäß dem Kontaktführungsmuster. Sowohl die Ausrichtungsantwort als auch die Zelllebensfähigkeit bleiben während der gesamten Kulturdauer (rechts, 3.180 min) erhalten. Maßstabsbalken = 200 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Video 1: Musterbeispiel auf einem zylindrischen 3D-Substrat. 3D-Darstellung eines konvexen Zylinders, der mit Rhodamin-Fibronektin (rot) gemustert ist. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen. Video 2: 3D-Darstellung dermaler Fibroblasten, die auf einem strukturierten, zylindrischen 3D-Substrat (ĸ = 1/500 μm-1) kultiviert sind. Dermale Fibroblasten, die 24 h lang auf einem gemusterten (Fibronektinlinien, rot, 10 μm breit und 10 μm Lücken) konvexen Halbzylinder kultiviert wurden. Die Zellen sind für F-Actin (Magenta), Vinculin (grün) und Kerne (blau) gefärbt. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen. Video 3: 3D-Darstellung menschlicher Keratozyten, die auf einer gemusterten 3D-Grube kultiviert sind (ĸ = 1/3.750 μm-1). 3D-Darstellung menschlicher Keratozyten, die 24 h lang in einer konkaven, gemusterten Grube kultiviert wurden (Gelatinekreise, grün, 20 μm breit und 20 μm Lücken). Die Zellen sind für F-Aktin (rot) gefärbt. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen. Video 4: Hellfeld-Zeitraffer-Bildgebung menschlicher dermaler Fibroblasten auf einem gemusterten, konkaven Zylinder. Der konkave Halbzylinder (ĸ = 1/250 μm-1) wurde mit parallelen Linien (5 μm breit und 5 μm Lücken) gemustert und vor der Zellaussaat mit Rhodamin-Fibronektin inkubiert. Die Zeitraffer-Bildgebung wird 1 Stunde nach der anfänglichen Zellaussaat gestartet, wenn die Zellen eine anfängliche Adhärenz an der Multicue-Umgebung zeigen. Während des gesamten Zeitraffers orientieren sich die Zellen überwiegend entlang der Kontaktführungshinweise, während die Zelllebensfähigkeit erhalten bleibt. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.

Discussion

Heutzutage wird das Zellverhalten oft auf Flachkultursubstraten untersucht, denen die Komplexität der nativen Zellmikroumgebung fehlt. Als Alternative kommen 3D-Umgebungen wie Gerüste und Hydrogele zum Einsatz. Obwohl diese Zellkulturumgebungen die In-vivo-Relevanz verbessern, bleiben sowohl systematische Studien des Zellverhaltens als auch die Machbarkeit von Auslesemethoden eine Herausforderung. Um das Zellverhalten auf repräsentativen Kultursubstraten systematisch zu untersuchen, werden konsistente Multicue-Substrate benötigt, die ein mikroskopisches Auslesen ermöglichen. Daher beschreiben wir in diesem Protokoll eine Methode zur Herstellung von Multicue-Zellkultursubstraten mit physiologisch relevanten Geometrien und gemusterten ECM-Proteinen. Die größte Herausforderung bei der Kombination von Umwelteinflüssen wie Gewebegeometrie und Kontaktführungshinweisen auf In-vitro-Plattformen ist weitgehend technologischer Natur. Herkömmliche Methoden zur Anwendung von Kontaktführungshinweisen (z. B. weiche Lithographie, Tief-UV-Strukturierung und Mikrokontaktdruck35,36) auf Zellkulturmaterialien wurden für planare Substrate optimiert. Der Bedarf an 3D-Zellkulturmaterialien in Kombination mit Kontaktführungshinweisen zeigte mehrere technologische Herausforderungen auf, wie z. B. schlechte Musterausrichtung, Auflösung und Flexibilität. Um diese Herausforderungen zu meistern, kann eine maskenlose, lichtbasierte Musterungsmethode mit hohem Durchsatzverwendet werden 45,49. Hier ermöglicht ein optisches Mikroskop eine präzise Musterausrichtung und eine Auflösung in der Größenordnung von Mikrometern (siehe Abbildung 6). Darüber hinaus ermöglicht die Verwendung einer digitalen Maske den Forschern, das Zellverhalten an einer Vielzahl von Mustern zu untersuchen, ohne arbeitsintensive physische Masken herstellen zu müssen.

Der UV-Photopatterning-Ansatz kann in Kombination mit einer Vielzahl von 3D-Geometrien (z. B. Zylinder, Sätteln, Kuppeln, Gruben) verwendet werden, die aus einer Reihe von Materialienhergestellt werden 48. Die in dieser Studie verwendeten 3D-Zellkultursubstrate bestehen aus PDMS; Es können jedoch auch andere Materialien verwendet werden. Dies kann verschiedene Schritte erfordern, um das endgültige Zellkultursubstrat mit den interessierenden Merkmalen herzustellen. Da sich gezeigt hat, dass Zellen empfindlich auf die Oberflächenrauheit von Zellkulturmaterialien reagieren, ist es wichtig, die Zellkulturchips mit einer glatten Oberfläche zu erzeugen, damit die Reaktion der beobachteten Zellen vollständig auf die 3D-Geometrie und die Kontaktführungshinweise50,51 zurückzuführen ist. Messmethoden wie optische Profilometrie, Rasterelektronenmikroskopie oder Rasterkraftmikroskopie können zur Messung der Oberflächenrauheit eingesetzt werden. Nach der Herstellung des Zellkulturmaterials kann man eine Musterungsmethode auswählen, die auf einer oder mehreren Fokusebenen basiert, abhängig von den spezifischen Abmessungen des interessierenden Merkmals (siehe Abbildung 3). Typischerweise wird eine einzelne Fokusebene verwendet, um einen Bereich innerhalb eines Z-Bereichs von etwa 50 μm zu strukturieren. Die Musterauflösung wurde anhand dieser Faustregel als konsistent gezeigt (siehe Abbildung 6). Ein Nachteil dieser Methode ist jedoch die erhöhte Musterungszeit mit der Einführung mehrerer fokaler Ebenen und Muster. In unserer Hand wurden mit mehreren Fokusebenen geometrische 3D-Merkmale bis zu 16 mm x 16 mm x 0,17 mm (X x Y x Z) erfolgreich mit hoher Musterqualität gemustert.

Darüber hinaus ist es wichtig zu erwähnen, dass die Höhe (Z-Achse) von geometrischen Merkmalen, die in Kombination mit diesem Protokoll verwendet werden können, begrenzt ist. Da sowohl die UV-Photostrukturierung als auch viele zelluläre Auslesungen auf einen mikroskopischen Aufbau angewiesen sind, bestimmt der Arbeitsabstand der Objektive die maximale Höhe eines Merkmals. In unserer Hand können Geometrien, die eine Höhe von 300 μm überschreiten, immer noch UV-photostrukturiert werden, und die Auslesungen wurden mit einem konfokalen Mikroskop mit 40-fachen Objektiven durchgeführt. Somit ist eine mechanobiologische Forschung von intrazellulärer bis zellulärer und Gewebeskala unter Verwendung des beschriebenen Protokolls möglich.

Ein weiterer Faktor, der berücksichtigt werden muss, ist das Risiko, dass Proben während oder nach der UV-Photostrukturierungaustrocknen 49. Dies ist besonders relevant bei der Verwendung von 3D-Geometrien, da Konvexitäten häufig außerhalb von Zellkulturmaterialien freigelegt werden. Wie in Abbildung 4 gezeigt, könnte dies zu ungleichmäßigen Mustern führen, wobei sich Proteinaggregate zusätzlich zu dem interessierenden Merkmal bilden. Das Waschen der Zellkulturchips nach der Proteininkubation und während der Zellkultur ist entscheidend für die richtige Beschichtung von 3D-Geometrien. Daher wird empfohlen, kleine Mengen einer Arbeitslösung (PBS, PLPP, Proteinlösung, Zellkulturmedium) immer auf dem Zellkulturchip zu belassen.

Bisher wurden mehrere Proteinbeschichtungen (Fibronektin, Kollagen Typ I und IV, Gelatine, FNC) und Zelltypen (menschliche Knochenmarkstromazellen, menschliche Myofibroblasten, menschliche Endothelzellen, menschliche Keratozyten und dermale Fibroblasten) in Kombination mit dem beschriebenen Photostrukturierungsansatz an strukturierten Zellkulturmaterialien verwendet. Wie in einer früheren Studie48 gezeigt, ist die Optimierung von Proteininkubationsparametern entscheidend für die systematische Untersuchung neuer Zelltypen. Daher wird empfohlen, vor der Durchführung eines neuen Experiments mit neuen Proteinen oder Zellen einen Bereich von Proteinkonzentrationen, Inkubationstemperaturen und Inkubationszeiten zu testen. Durch den Vergleich der Zellmorphologie nach anfänglicher Adhäsion auf homogenen, gemusterten flachen Flächen mit der Zellmorphologie unter “normalen” Zellkulturbedingungen kann ein optimierter Satz experimenteller Parameter erhalten werden. Darüber hinaus kann jeder Zelltyp nach dem Seeding eine andere Zeit in Anspruch nehmen, um eine erkennbare Adhäsionsmorphologie in einer bestimmten Multicue-Umgebung zu zeigen (siehe Abbildung 5). Zu diesem Zweck ist es entscheidend, die Zeit zu optimieren, die pro Zelltyp benötigt wird, um Kontaktereignisse auf dem strukturierten Bereich während des Waschens in Schritt 8.4 darzustellen. Zum Beispiel beobachteten wir, dass menschliche Keratozyten innerhalb der ersten 30 Minuten nach der Aussaat längliche Morphologien aufweisen, während Endothelzellen und dermale Fibroblasten mehrere Stunden benötigen, bevor sie eine Veränderung der Adhäsionsmorphologie zeigen. Die experimentellen Parameter, die für die Proteininkubation (Schritt 7) und die Zellaussaat (Schritt 8) benötigt werden, könnten daher vom Protein und dem Zelltyp der Wahl abhängen.

Der vorgestellte Ansatz zur Anwendung von Kontaktführungshinweisen auf 3D-Geometrien kann dazu beitragen, ein tieferes Verständnis des Zellverhaltens in komplexen Multicue-Umgebungen zu schaffen. Dies kann Untersuchungen zu intrazellulären Komponenten wie fokalen Adhäsionen und Kernen umfassen und kann auch Experimente umfassen, die mit der vorgeschlagenen Methode auf einer größeren, Zell- oder Gewebeskala durchgeführt werden. Schließlich wird erwartet, dass die gewonnenen Erkenntnisse bei der Entwicklung von Tissue-Engineering-Anwendungen genutzt werden können, bei denen komplexe zelluläre Umgebungen so gestaltet sind, dass das Zellverhalten auf ein gewünschtes Ergebnis ausgerichtet ist.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken Dr. Nello Formisano (MERLN Institute for Technology-Inspired Regenerative Medicine) für die Bereitstellung humaner primärer Keratozyten. Diese Arbeit wurde vom Chemelot InSciTe (Projekt BM3.02) unterstützt; der Europäische Forschungsrat (Zuschuss 851960); und das Ministerium für Bildung, Kultur und Wissenschaft für das Gravitationsprogramm 024.003.013 “Materials Driven Regeneration”. Die Autoren möchten Alvéole für ihre Korrespondenz, Hilfe und Fehlerbehebung danken.

Materials

Anti-vinculin antibody, mouse monoclonal IgG1 Sigma V9131 Dilution: 1/600
Bovine Serum albumin, Fraction V Roche 10735086001
DMEM, high glucose, pyruvate Gibco 41966029
DMEM/F-12 + GlutaMAX (1x) Gibco 10565018
DMi8 epifluorescent microscope Leica Microsystems
Ethanol Biosolve 0005250210BS
Fetal Bovine Serum Serana 758093
Fiji/ImageJ, version v1.53k www.imageJ.nih.gov
Fluorescent highlighter Stabilo 4006381333627
Fluorescin-labeled gelatin Invitrogen G13187 Concentration: 0.01%
Formaldehyde solution Merck F8775
Glass coverslips 24 x 60 mm, #1 VWR 631-1575
Glass coverslips, ø = 32 mm, #1 Menzel-Gläser
HCX PL fluotar L 20X/0.40na microscope objective Leica 11506242
HEPES Gibco 15630080
Human dermal fibroblasts Lonza CC-2511
Human primary keratocytes MERLN Institute for Technology-Inspired Regenerative Medicine
Illustrator, Version 26.0.1 Adobe
Laboratory oven Carbolite
L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate Sigma-Aldrich A8960
Leica Application Suite X software, version 3.5.7.23225 Leica Microsystems
Leonardo software, version 4.16 Alvéole
Micro-manager, version 1.4.23 Open imaging
Mowiol 4-88 Sigma-Aldrich 81381 mounting medium
mPEG-succinimidyl valerate MW 5,000 Da Laysan Bio MPEG-SVA-5000 Concentration: 50 mg/mL
Negative glass mold FEMTOprint
NucBlue Live Readyprobes Reagent (Hoechst 33342) Invitrogen R37605 2 drops/mL
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Gibco 15140163
Petri dish (ø=100 mm) Greiner Bio-one 664160
Phalloidin Atto 647N Sigma 65906 Dilution: 1/250
Phosphate Buffered Saline Sigma P4417
Plasma asher Emitech K1050X
PLPP (photoinitiator) Alvéole
Poly-L-lysine, sterile-filtered Sigma-Aldrich P4707 Concentration: 0.01%
PRIMO Alvéole
Rhodamine-labeled fibronectin Cytoskeletn, Inc. FNR01 Concentration: 10 µg/mL
Secondary antibody with Alexa 488, Goat anti-mouse IgG1 (H) Molecular Probes A21121 Dilution: 1/300
Secondary antibody with Alexa 555, Goat anti-mouse IgG1 (H) Molecular Probes A21127 Dilution: 1/300
Spin coater Leurell Technologies Corporation model WS-650MZ-23NPPB
SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit DOW 1673921
TCS SP8X confocal microscope Leica Microsystems
tridecafluoro(1,1,2,2-tetrahydrooctyl)trichlorosilane ABCR AB111444
TrypLE Express Enzyme (1x), no phenol red Gibco 12604013
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red Gibco 25300054
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van der Putten, C., D’Urso, M., Bril, M., Woud, T. E., Bouten, C. V. C., Kurniawan, N. A. Generation of Multicue Cellular Microenvironments by UV-Photopatterning of Three-Dimensional Cell Culture Substrates. J. Vis. Exp. (184), e63988, doi:10.3791/63988 (2022).
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