JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Nederlands

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioengineering

Generatie van multicue cellulaire micro-omgevingen door UV-fotopatterning van driedimensionale celcultuursubstraten

Published: June 02, 2022
doi:
10.3791/63988
, , , , ,
1Department of Biomedical Engineering,Eindhoven University of Technology, 2Institute for Complex Molecular Systems,Eindhoven University of Technology

Summary

Traditioneel wordt celkweek uitgevoerd op vlakke substraten die de natuurlijke omgeving van cellen in vivo slecht nabootsen. Hier beschrijven we een methode om celkweeksubstraten te produceren met fysiologisch relevante gebogen geometrieën en micropatterned extracellulaire eiwitten, waardoor systematisch onderzoek naar cellulaire detectie van deze extracellulaire signalen mogelijk is.

Abstract

De extracellulaire matrix is een belangrijke regulator van de celfunctie. Omgevingssignalen die in de cellulaire micro-omgeving bestaan, zoals liganddistributie en weefselgeometrie, blijken in toenemende mate een cruciale rol te spelen bij het beheersen van het fenotype en gedrag van cellen. Deze omgevingssignalen en hun effecten op cellen worden echter vaak afzonderlijk bestudeerd met behulp van in vitro platforms die individuele signalen isoleren, een strategie die de complexe in vivo situatie van meerdere signalen sterk oversimplificeert. Technische benaderingen kunnen bijzonder nuttig zijn om deze kloof te overbruggen, door experimentele opstellingen te ontwikkelen die de complexiteit van de in vivo micro-omgeving vastleggen, maar toch de mate van precisie en manipuleerbaarheid van in vitro systemen behouden.

Deze studie benadrukt een aanpak die ultraviolet (UV) -gebaseerde eiwitpatronen en op lithografie gebaseerde substraatmicrofabricage combineert, die samen high-throughput onderzoek naar celgedrag in multicue-omgevingen mogelijk maken. Door middel van maskerloze UV-fotopatterning is het mogelijk om complexe, kleefeiwitverdelingen te creëren op driedimensionale (3D) celcultuursubstraten op chips die een verscheidenheid aan goed gedefinieerde geometrische aanwijzingen bevatten. De voorgestelde techniek kan worden gebruikt voor kweeksubstraten gemaakt van verschillende polymere materialen en gecombineerd met gebieden met kleefpatronen van een breed scala aan eiwitten. Met deze aanpak kunnen enkele cellen, evenals monolagen, worden onderworpen aan combinaties van geometrische signalen en contactgeleidingssignalen die worden gepresenteerd door de patroonsubstraten. Systematisch onderzoek met behulp van combinaties van chipmaterialen, eiwitpatronen en celtypen kan dus fundamentele inzichten bieden in cellulaire reacties op multicue-omgevingen.

Introduction

In vivo worden cellen onderworpen aan een breed scala aan omgevingssignalen die van mechanische, fysische en biochemische aard kunnen zijn en afkomstig zijn van de extracellulaire matrix (ECM). Talrijke omgevingssignalen zijn geïdentificeerd die een vitale rol spelen bij de regulatie van celgedrag, zoals proliferatie, differentiatie en migratie 1,2,3,4,5. Een van de meest onderzochte verschijnselen is contactbegeleiding, die adhesie-gemedieerde celuitlijning beschrijft langs anisotrope biochemische of topografische patronen aanwezig op het extracellulaire substraat 6,7,8,9,10,11. Naast het sturen van de uitlijning van cellen, is ook aangetoond dat contactbegeleidingssignalen andere celeigenschappen beïnvloeden, zoals celmigratie, organisatie van intracellulaire eiwitten, celvorm en celbestemming 12,13,14,15. Bovendien is de geometrische architectuur van de 3D-cellulaire omgeving ook erkend voor zijn regulerende invloed op het gedrag van cellen 16,17. In het menselijk lichaam worden cellen blootgesteld aan een reeks gebogen geometrieën, variërend van collageenvezels op microschaal, haarvaten en glomeruli, tot alveoli en slagaders op mesoschaal18,19. Interessant is dat recente in vitro studies hebben aangetoond dat cellen dergelijke fysieke signalen kunnen waarnemen en erop kunnen reageren, van de nano- tot mesoschaal 20,21,22,23.

Tot op heden zijn de meeste onderzoeken naar celrespons op omgevingssignalen grotendeels uitgevoerd met behulp van experimentele opstellingen die enkele signalen isoleren. Hoewel deze benadering enorme vooruitgang heeft mogelijk gemaakt bij het begrijpen van de basismechanismen achter cellulaire detectie van omgevingssignalen, vat het de in vivo omgeving die tegelijkertijd meerdere signalen presenteert, slecht samen. Om deze kloof te overbruggen is het nuttig om cultuurplatforms te ontwikkelen waarbij meerdere omgevingssignalen onafhankelijk en gelijktijdig kunnen worden aangestuurd. Dit concept heeft de laatste tijd steeds meer tractie gekregen24,25, met studies die matrixstijfheid en liganddichtheid 26,27,28,29, substraatstijfheid en porositeit30, substraatstijfheid en 3D-micronichevolume 31, oppervlaktetopografie en contactgeleidingssignalen 32,33,34 combineren , en nanoschaal contactgeleidingssignalen met mesoschaalkrommingsbegeleidingssignalen23. Het blijft echter een uitdaging om contactgeleidingssignalen te combineren met een verscheidenheid aan 3D-geometrieën op een gecontroleerde en snelle manier.

Dit onderzoeksprotocol pakt deze uitdaging aan en introduceert een methode om celcultuursubstraten te maken met een gecontroleerde combinatie van patroonlijmgebieden van ECM-eiwitten (contactgeleidingssignalen) en substraatkromming (geometrische signalen). Deze aanpak maakt de dissectie van celrespons in een biomimetische multicue-omgeving op een systematische en high-throughput manier mogelijk. De opgedane kennis kan helpen bij het verder begrijpen van celgedrag in complexe omgevingen en kan worden gebruikt om leerzame materialen te ontwerpen met eigenschappen die celreacties naar een gewenst resultaat sturen.

3D-eiwit fotopatterning
Het creëren van kleefgebieden van ECM-eiwitten (contactgeleidingssignalen) op celkweekmaterialen kan worden bereikt met behulp van verschillende technieken, bijvoorbeeld door diep-ultraviolette (diepe UV) patronen of microcontactafdrukken35,36. Deep-UV-patronen maken gebruik van UV-licht dat door een masker op een polymeer materiaal wordt geprojecteerd om passiveringspolymeren op specifieke locaties op het celcultuursubstraat af te breken. Het patroonsubstraat wordt vervolgens geïncubeerd met een ligand van belang, wat resulteert in kleefgebieden die celaanhechting en -cultuur ondersteunen op vooraf gedefinieerde locaties 12,37,38. Een alternatieve manier om eiwitpatronen te introduceren is door middel van microcontactprinten, waarbij elastomeerstempels met een gewenste vorm worden bedekt met een eiwit naar keuze en op een celcultuursubstraat worden geperst, waardoor de eiwitcoating wordt overgebracht waaraan cellenzich 35,37,39,40 kunnen hechten . Helaas, omdat beide technieken afhankelijk zijn van maskervoorbereiding en zachte lithografiemethoden, zijn de experimenten tijdrovend en arbeidsintensief, evenals beperkt in termen van patroonflexibiliteit. Bovendien zijn zowel deep-UV-patronen als microcontactprinten het meest geschikt voor vlakke materialen en zijn ze technisch moeilijk, zo niet onmogelijk, voor het patroon van liganden in een 3D-omgeving.

Om deze conventionele methoden te verbeteren, combineerden Waterkotte et al. maskerloze lithografie, chemische dampafzetting en thermoforming om microverwerkte 3D-polymere substraten te genereren41. Deze techniek is echter afhankelijk van het gebruik van thermovormbare polymeerfilms en biedt een lage eiwitpatroonresolutie (7,5 μm), terwijl cellen naar verluidt reageren op geometrische eiwitpatronen zo klein als 0,1 μm 2,42. Sevcik et al. beschreven een andere veelbelovende methode voor nanopattern ECM-liganden op substraten die nano- en micrometertopografieën bevatten43. Met behulp van microcontactprinten werden ECM-eiwitten overgebracht van polydimethylsiloxaan (PDMS) stempels naar een thermoresponsief poly (N-isopropylacrylamide) (pNIPAM) substraat. Vervolgens stelde de thermoresponsieve eigenschap van het pNIPAM-netwerk hen in staat om het tweedimensionale (2D) eiwitpatroon over te brengen naar een topografisch PDMS-substraat (10-100 μm diepe groeven), waardoor de lokalisatie van hechtingsplaatsen op topografische kenmerken werd gecontroleerd. Niet alle mogelijke microtopografieën kunnen echter worden gemodelleerd, omdat verminderde bevochtigbaarheidsproblemen het moeilijker maken om diepere topografische substraten te modelleren. Sleuven met een hoogte-breedteverhouding van 2,4 zijn gemeld als de ultieme limiet om het patroon met succes over te brengen naar het topografische substraat43. Bovendien zijn de flexibiliteit van verschillende patronen en de resolutie van de gegenereerde patronen slecht vanwege de vereiste van microcontactafdrukken.

Dit artikel beschrijft een methode die de bovengenoemde knelpunten overwint en biedt een flexibele en high-throughput methode om multicue substraten te creëren die kunnen worden gebruikt voor celkweek (zie figuur 1). Fysiologisch relevante geometrieën (cilinders, koepels, ellipsen en zadeloppervlakken) met krommingen variërend van ĸ = 1/2500 tot ĸ = 1/125 μm-1 worden vooraf ontworpen en gemicrofabriceerd in PDMS-chips . Vervolgens worden contactgeleidingssignalen gemaakt bovenop de 3D-geometrieën met behulp van een verscheidenheid aan digitale patroonontwerpen door gebruik te maken van een fotopatterningtechniek met een resolutie zo klein als 1,5 μm44. Daartoe worden de PDMS-chips in eerste instantie gepassiveerd om te voorkomen dat cellen en eiwitten zich hechten; deze passiveringslaag kan vervolgens worden verwijderd door combinatie van de foto-initiator 4-benzoylbenzyl-trimethylammoniumchloride (PLPP) en UV-lichtblootstelling45. Een digitaal masker is ontworpen om de locaties van UV-blootstelling te specificeren, en dus het gebied waar de passiveringslaag wordt verwijderd. Eiwitten kunnen zich vervolgens aan deze gebieden hechten, waardoor celaanhechting mogelijk wordt. Omdat het patroon wordt uitgevoerd met behulp van een digitaal (in plaats van een fysiek) masker, kan een verscheidenheid aan patronen snel worden gemaakt zonder het gedoe en de kosten die gepaard gaan met het ontwerpen en fabriceren van extra fotomaskers. Bovendien kan een breed scala aan ECM-eiwitten (bijv. Collageen type I, gelatine en fibronectine) op het substraat worden gemodelleerd. Hoewel dit protocol wordt uitgevoerd met behulp van celkweekchips gemaakt van PDMS, kan het principe worden toegepast op elk ander materiaal van belang46.

Protocol

In de studies die in dit protocol worden beschreven, werden primaire menselijke keratocyten gebruikt. Dit onderzoek werd uitgevoerd in overeenstemming met de principes van de Verklaring van Helsinki. Primaire keratocyten werden geïsoleerd uit overgebleven menselijke cadaverische corneosclerale weefsels van Descemet Membrane Endothelial Keratoplasty surgery, die werden verkregen van de afdeling Hoornvlies van het ETB-BISLIFE Multi-Tissue Center (Beverwijk, Nederland) na toestemming van de nabestaanden van alle overleden donoren. OPMERKING: Zie de tabel met materialen voor meer informatie over alle materialen, reagentia, apparatuur en software die in dit protocol worden gebruikt. 1. Fabricage van 3D-celcultuursubstraten Maak een negatieve glasvorm (#1) met alle interessante kenmerken, in dit geval gemaakt van glas met behulp van een femtoseconde-laser direct-write techniek (zie figuur 2). Plaats de negatieve glazen mal (#1) voorzichtig op de bodem van een petrischaaltje. Bereid een PDMS-prepolymeer voor door een lege conische buis van 50 ml op een weegschaal te plaatsen, de schaal te tarra en giet de gewenste hoeveelheid siliconenelastomeerbasis in de buis. Voeg uithardingsmiddel toe met behulp van een Pasteur-pipet, zodat de uiteindelijke verhouding van elastomeerbasis en uithardingsmiddel 10: 1 (w / g) is. Meng de componenten in de conische buis grondig met behulp van een spatel. Centrifugeer bij 2.000 × g gedurende 70 s om alle luchtbellen te verwijderen. Giet het PDMS-prepolymeer bovenop de negatieve glazen mal (# 1) in de petrischaal om het volledig te bedekken. Plaats de petrischaal met de negatieve glazen mal (#1) en het PDMS-prepolymeer in de vacuümdesiccator en start de vacuümpomp. Zodra een vacuüm is bereikt, wacht u 5 minuten om alle bellen te verwijderen die aanwezig zijn op het grensvlak tussen het matrijsoppervlak en het PDMS-prepolymeer. Verwijder het vacuüm en haal de petrischaal uit de exsiccator. Hard het PDMS-prepolymeer een nacht uit in de oven op 65 °C. Verwijder voorzichtig de nieuw uitgeharde positieve PDMS-chip (# 2) uit de negatieve glazen mal (# 1) door de randen van de PDMS op te tillen met behulp van een spatel. Als de positieve PDMS-chip (# 2) de neiging heeft om aan de negatieve glazen mal (# 1) te kleven, voeg dan ethanol of water toe aan de randen van de afdruk tijdens het tillen.OPMERKING: De vloeistof loopt tussen de twee lagen en vergemakkelijkt de scheiding van de negatieve glasvorm (# 1) en de positieve PDMS-chip (# 2). Snijd met behulp van een mes de zijkanten van de positieve PDMS-chip (# 2) af, zodat er een rechthoekige chip overblijft. Plaats de positieve PDMS-chip (#2) in een exsiccator naast een kleine injectieflacon met een druppel tridecafluoro (1,1,2,2-tetrahydrooctyl)trichlooranilaan, een silanisatiemiddel, en laat het een nacht onder vacuüm.OPMERKING: Silanisatie zorgt ervoor dat de afdruk niet bindt aan andere PDMS-lagen later in het protocol. Andere silanisatiemiddelen en/of methoden kunnen ook werken om ervoor te zorgen dat de oppervlakken van de PDMS-chips niet aan andere PDMS-lagen blijven plakken.LET OP: Tridecafluoro(1,1,2,2-tetrahydrooctyl)trichlooranilaan is ontvlambaar (H226) en veroorzaakt ernstige huidverbrandingen en oogbeschadiging (H314). Draag persoonlijke beschermingsmiddelen, werk in een zuurkast en was de handen grondig na het hanteren. Houd het silanisatiemiddel uit de buurt van hitte, hete oppervlakken, vonken, open vuur en andere ontstekingsbronnen. Bewaren tussen 15 en 30 °C (P280, P210, P240, P403, P235, P310). Verwijder het vacuüm en plaats de positieve PDMS-chip (#2) op de bodem van een petrischaaltje. Giet PDMS-prepolymeer (10:1) erop om meerdere negatieve PDMS-mallen te produceren (# 3). Plaats de petrischaal 15 minuten onder vacuüm in de exsiccator om alle bubbels te verwijderen. Hard het PDMS-prepolymeer ‘s nachts uit bij 65 °C, waarna de negatieve PDMS-mal (#3) met een spatel van de positieve PDMS-chip (#2) kan worden afgepeld. Silaniseer de uiteindelijke negatieve PDMS-mal (# 3) met behulp van silanisatiemiddel in een vacuümdesiccator ‘s nachts. Produceer meerdere celkweekchips (#4, zie figuur 2) van ongeveer 5 mm dikte door PDMS-prepolymeer in de negatieve PDMS-mal (#3) te gieten, bellen te verwijderen met behulp van de exsiccator en uit te harden gedurende 3 uur bij 65 °C. Snijd met een scheermesje de chip tot de uiteindelijke grootte zoals gevisualiseerd in figuur 2. Bewaar de chips op kamertemperatuur.OPMERKING: Oppervlakteruwheid kan de cellulaire respons beïnvloeden. Indien nodig kan een extra dunne laag PDMS worden gebruikt als coating op de positieve PDMS-chip (# 2) om het oppervlak glad te maken. Om dit te doen, giet een klein druppeltje PDMS-prepolymeer op de chip en verspreid het over de volledige chip met behulp van lucht onder druk. Laat de gecoate chip 3 uur uitharden bij 65 °C en ga verder met stap 1.12. 2. Fabricage van platte PDMS-monsters (controlemonsters) Bereid PDMS-prepolymeer (10:1) voor volgens stap 1.3-1.6. Plaats een glazen afdekplaat op de afgeronde vacuümpost in het midden van de spincoater. Schakel de stofzuiger in om de glazen afdekplaat aan de machine te bevestigen en pipetteer een druppel PDMS in het midden van de afdekplaat met behulp van een Pasteur-pipet. Verdeel het PDMS-prepolymeer over het glazen substraat met behulp van het volgende protocol om een laag van ongeveer 10 μm dik te krijgen.Spincoat gedurende 10 s bij 0,45 × g, versnelling: 0,2 × g/s. Spincoat gedurende 50 s bij 44,8 × g, acceleratie: 0,54 × g/s. Schakel het vacuüm uit, verwijder de coverslip van de spincoater met een pincet en plaats het in een petrischaaltje. Laat het PDMS een nacht uitharden in de oven bij 65 °C en daarna op kamertemperatuur bewaren. 3. Substraat passivering van 3D-celcultuursubstraten Activeer de hydroxylgroepen op het oppervlak van de PDMS-chip (#4) met O2-plasma. Plaats met een pincet de chip in het mandje van de plasma-asher. Voer een ascyclus uit met een vermogen van 20 W gedurende 30 s. Ontlucht de askamer met N2. Haal de chip uit de mand en plaats deze in een kleine PDMS-container (zie figuur 1). Voeg met behulp van een Pasteur-pipet 500 μL Poly-L-lysine (PLL, 0,01%) toe aan de bovenkant van de chip, zodat het volledige oppervlak wordt ondergedompeld in de PLL-oplossing. Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder 450 μL van de PLL uit de celkweekchip met een pipet en spoel het chipoppervlak drie keer met 500 μL van 0,1 M HEPES-buffer (8 < pH < 8,5). Laat altijd een klein volume vloeistof op de PDMS-chip achter om uitdroging van het monster te voorkomen, wat de uiteindelijke patroonkwaliteit zal verminderen. Maak 500 μL van een 50 mg / ml methoxypolyethyleenglythyleenglycol-succinimidylvalraat (mPEG-SVA; MW 5.000 Da) oplossing in 0,1 M HEPES-buffer (8 < pH < 8,5) per celkweekchip en laat deze gedurende 60 minuten op het monster incuberen. Aangezien de mPEG-SVA een halfwaardetijd van 15 minuten heeft, moet u de vereiste hoeveelheid vlak voor gebruik voorbereiden.OPMERKING: De mPEG-SVA wordt opgelost wanneer de oplossing volledig transparant is. Verwijder 450 μL van de mPEG-SVA-oplossing met behulp van een micropipet en was het chipoppervlak vijf keer met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Zorg ervoor dat u meerdere keren per wasbeurt op en neer pipettert om ervoor te zorgen dat alle ongebonden mPEG-SVA wordt verwijderd. Om te voorkomen dat het monster uitdroogt, minimaliseert u de tijd tussen de wasstappen en zorgt u ervoor dat u een teveel (500 μL of meer) PBS gebruikt voor het wassen. Sla de monsters op door ze onder te dompelen in PBS of ga verder met de patroonstap van het protocol.OPMERKING: Indien gewenst kan passivering worden uitgevoerd onder steriele omstandigheden bij het werken in een kweekkast en het werken met steriele oplossingen en apparatuur. 4. Opslag van patrooncelkweeksubstraten OPMERKING: 3D-celcultuursubstraten kunnen tijdens verschillende stappen in het proces worden opgeslagen. Bewaar uitgeharde PDMS-celkweekchips onder droge omstandigheden bij kamertemperatuur. Bewaar de gepassiveerde celkweekchips op een van de volgende twee manieren:Bewaren in PBS bij 4 °C gedurende maximaal 7 dagen. Bewaren in droge omstandigheden voor maximaal enkele maanden. Om droge monsters te verkrijgen, verwijdert u de PBS en spoelt u meerdere keren met dubbel gedestilleerd water (ddH2O). Föhnen met een stikstof- of luchtpistool. 5. Ontwerp van digitale maskers die worden gebruikt voor fotopatterning OPMERKING: Het patroon van 3D-substraten kan worden uitgevoerd met behulp van een enkele of meerdere brandpuntsvlakken (zie figuur 3). Een enkel brandpuntsvlak kan worden gebruikt op functies die niet groter zijn dan één digitaal spiegelapparaat (DMD, ongeveer 300 μm x 500 μm) en die niet te hoog zijn (50-100 μm). Ontwerp in dat geval een digitaal patroon met behulp van de TIFF-modus. Voor functies die de afmetingen van één DMD overschrijden en relatief hoog zijn, verdeelt u de patroonvorming van het substraat in meerdere stappen. In dit geval worden meerdere patronen ontworpen met behulp van de PDF-modus die allemaal afzonderlijk focussen op enkele brandpuntsvlakken. Ontwerp een digitaal masker met behulp van ontwerpsoftwaretools.Patronen in TIFF-modus (pixels): Maak een volledig zwart tekengebied van 1.140 x 1.824 pixels (de exacte grootte van 1 DMD, ongeveer 300 μm x 500 μm) en vul het tekengebied met de interessante vormen. Exporteer het tekengebied als een 8-bits TIFF-bestand.OPMERKING: Verschillende grijsniveaus in het patroonontwerp bepalen de hoeveelheid belichting die op die locatie wordt uitgevoerd. Patronen in PDF-modus (metrische eenheden): maak een zwart tekengebied van de gewenste grootte in mm en vul het tekengebied met elke gewenste vorm. Verdeel het patroon in meerdere bestanden als het 3D-substraat een patroon moet maken met behulp van meerdere brandpuntsvlakken. Sla het tekengebied op als PDF-bestand.OPMERKING: Verschillende grijsniveaus in het patroonontwerp bepalen de hoeveelheid belichting die op die locatie wordt uitgevoerd. 6. UV-fotopatterning van 3D-celcultuursubstraten CalibratieOPMERKING: Kalibratie van de laser wordt gedaan om de juiste focus te krijgen op het materiaal van belang. Omdat de PDMS-celcultuursubstraten te dik zijn om door te patronen, gebruikt u een glazen dia waarop de chip ondersteboven wordt geplaatst. Omdat de laser de glasschuif als eerste tegenkomt, gebruikt u glas om de laser te kalibreren.Breng fluorescerende highlighter aan op een glazen coverslip en plaats de glazen coverslip in het stadium van de fluorescerende microscoop. Zorg ervoor dat het gemarkeerde oppervlak naar boven is gericht. Schakel de microscoop en de PRIMO-apparatuur in en open Micro-manager om toegang te krijgen tot Leonardo-software onder ‘plug-ins’. Kies Kalibratie in het beginmenu, gevolgd door het selecteren van het 20x-objectief, zowel op de microscoop als in de software. Klik op Volgende. Plaats de glasplaat met fluorescerende markeerstift in het optische pad van de microscoop. Schakel over naar de fluorescentiemodus en concentreer u zorgvuldig op de PRIMO-afbeelding die wordt weergegeven, waarbij u ervoor zorgt dat zowel het logo als de tekst scherp zijn. Klik op Volgende om de kalibratieprocedure te voltooien. Noteer de Z-locatie van het podium bij het kalibreren en gebruik deze locatie als referentie later in het protocol.OPMERKING: Het kalibratiemateriaal moet overeenkomen met het materiaal dat wordt gebruikt voor patroonvorming later in het protocol. De bovenstaande stappen beschrijven de kalibratie die nodig is voor de celkweeksubstraten. Voor kalibratie van platte PDMS-controlemonsters past u fluorescerende markeerstift toe op een extra vlak PDMS-monster en kalibreert u met stappen 6.1.2-6.1.5. 3D-functies patronen maken met één brandpuntsvlakOPMERKING: Patronen met behulp van een enkel brandpuntsvlak worden uitgevoerd op 3D-functies die de afmetingen van één DMD (ongeveer 300 μm x 500 μm) niet overschrijden. Een schema van de opstelling van het brandpuntsvlak wordt geïllustreerd in figuur 3.Verwijder de kalibratieschuif uit het stadium en plaats een glazen dia met een druppel (~50 μL) foto-initiator (PLPP) in het stadium.LET OP: PLPP is irriterend voor de ogen, het ademhalingssysteem en de huid (R36-38). Draag persoonlijke beschermingsmiddelen, houd deze uit de buurt van explosieve materialen, voeg nooit water toe aan dit product, neem voorzorgsmaatregelen tegen statische ontladingen en vermijd schokken en wrijving (S26-36). Plaats het PDMS-celcultuursubstraat ondersteboven in de druppel van de foto-initiator. Zorg ervoor dat de 3D-functies op het oppervlak van het celcultuursubstraat naar de glasschuif zijn gericht en volledig zijn ondergedompeld in PLPP om een goed patroon te garanderen. Selecteer Patroon in de software. Schakel over naar de brightfield-modus op de microscoop en verplaats het podium naar de interessante functie. Focus op respectievelijk de boven- of onderkant van bolle en concave structuren (figuur 3). Selecteer PRIMO om een patroon naar keuze in te voegen. Bekijk het patroonvoorbeeld in oranje boven op de live brightfield-afbeelding. Pas de patrooninstellingen aan volgens de functie (locatie, hoek, herhalingen) en selecteer een dosis van 1.000 mJ/mm2. Klik op Vergrendelen en schakel de microscoop over naar de fluorescentiemodus . Klik op de knop Afspelen rechtsonder in het scherm om het patroon te starten. Als u klaar bent, ziet u het patroon dat in het groen wordt weergegeven. Als u klaar bent met alle functies op een celkweekchip, verwijdert u de chip van de patroonschuif en bewaart u deze in PBS bij 4 °C. 3D-functies patronen maken met behulp van meerdere brandpuntsvlakkenOPMERKING: Patronen met behulp van meerdere focale vlakken worden gedaan op 3D-functies die groter zijn dan één DMD (ongeveer 300 μm x 500 μm) of relatief lang zijn. In dit geval moeten de 3D-functies in meerdere stappen worden gemodelleerd, dat wil zeggen dat het patroonontwerp moet worden aangepast aan het voorbeeld in figuur 3.Verwijder de kalibratieschuif uit het stadium en plaats een glazen dia met een druppel (~50 μL) foto-initiator (PLPP) in het stadium. Plaats de PDMS-celkweekchip ondersteboven in de druppel van de foto-initiator met behulp van een pincet. Selecteer Patroon in de software. Schakel over naar de brightfield-modus op de microscoop en verplaats het podium naar de interessante functie. Focus op het gebied van de chip op de juiste locatie. Aangezien patroonvorming wordt uitgevoerd in een enkel brandpuntsvlak en de kenmerken groter zijn dan een enkele DMD, gebruikt u meerdere brandpuntsvlakken en dus meerdere patroonrondes per 3D-substraat om voldoende patroonresolutie te garanderen langs de volledige hoogte en breedte van het kenmerk (zie figuur 3). Voor een functie met een hoogte van 150 μm, patroont u bijvoorbeeld het kenmerk in drie rondes (± 1 brandpuntsvlak per 50 μm Z-travel), waarbij ongeveer 25 μm, 75 μm en 125 μm vanaf de onderkant van de functie worden scherpgesteld. Zorg ervoor dat de onderkant van de functie rond de waarde ligt die is opgeschreven in stap 6.1.5. Selecteer PRIMO om het gewenste patroon in te voegen. Bekijk het patroonvoorbeeld dat in oranje wordt weergegeven boven op de live brightfield-afbeelding. Pas de patrooninstellingen aan op basis van de functie (locatie, hoek) en selecteer een dosis van 1.000 mJ/mm2. Klik op Vergrendelen en schakel de microscoop over naar de fluorescentiemodus . Klik op de knop Afspelen rechtsonder in het scherm om het patroon te starten. Als u klaar bent, ziet u het patroon dat in het groen wordt weergegeven. Herhaal stap 6.3.4-6.3.8 over het interessante kenmerk wanneer meerdere brandpuntsvlakken worden gebruikt. Als u klaar bent met alle functies op een celkweekchip, verwijdert u de chip van de patroonschuif en slaat u deze op in PBS bij 4 °C.OPMERKING: Breng indien gewenst de UV-fotocorrectie aan onder steriele omstandigheden, maak gebruik van petrischalen met glazen bodem en bereid alle substraten voor in steriele kweekkasten. Bewaar de patroonmonsters in PBS gedurende maximaal een paar weken. Bij wasbeurt met ddH2O en gedroogd met perslucht kunnen monsters tot enkele maanden bij 4 °C worden bewaard. 7. Eiwit incubatie OPMERKING: Het wordt geadviseerd om vers eiwit-geïncubeerde substraten te gebruiken voor celkweek. Ga alleen verder met dit deel van het protocol als het zaaien van cellen (stap 8) direct daarna wordt gedaan. Breng de patrooncelkweekchip over naar steriele PDMS-containers in de kweekkast. Was de celkweekchips met patronen 3x met een teveel aan steriele PBS als de patroonvorming niet onder steriele omstandigheden is uitgevoerd. Bereid een verse eiwitoplossing in PBS.Fibronectine: voeg 2 ml PBS met behulp van een micropipet toe aan een injectieflacon van 20 μg rhodamine-gelabelde fibronectine om een concentratie van 10 μg/ml te verkrijgen. Pipetteer voorzichtig om de vorming van eiwitklonten te voorkomen en te beschermen tegen licht. Gelatine: ontdooi een aliquot van 200 μL opgelost gelatine-fluoresceïne. Bescherm tegen licht. Voeg 200-500 μL van de eiwitoplossing toe aan de celkweekchip met behulp van een micropipet. Pas de incubatietijd en temperatuur aan afhankelijk van het eiwit van keuze: Fibronectine: 5 min bij kamertemperatuur, Gelatine: 15 min bij 37 °C. Zorg ervoor dat u het monster bedekt (bijvoorbeeld met aluminiumfolie). Verwijder de eiwitoplossing en was 5x met 500 μL steriel PBS. Zorg ervoor dat u de PBS meerdere keren op en neer pipetteert, vooral met alle relevante kenmerken van de celkweekchip om elk ongebonden eiwit te verwijderen.OPMERKING: Tijdens de wasstappen is het van cruciaal belang dat het monster nooit uitdroogt. Voeg bij het verwijderen van de eiwitoplossing of PBS tijdens het wassen onmiddellijk nieuwe PBS toe om te voorkomen dat eiwitklonters zich vormen (zie figuur 4). Bolle kenmerken zijn bijzonder gevoelig voor uitdroging omdat ze boven het substraatoppervlak zijn verheven. Optioneel: bekijk de eiwitpatronen onder een fluorescentiemicroscoop. Houd de monsters steriel en ondergedompeld in PBS. 8. Celzaaien OPMERKING: Dit protocol maakt gebruik van menselijke primaire keratocyten en menselijke dermale fibroblasten. De keratocyten werden geoogst uit menselijk hoornvliesweefsel van patiënten, in overeenstemming met de Nederlandse richtlijnen voor secundair materiaalgebruik, en eerder gekarakteriseerd als keratocyten47. Deze cellen worden gekweekt in DMEM aangevuld met 5% Foetaal Runderserum (FBS), 1% penicilline/streptomycine (P/S) en 1 mM L-ascorbinezuur 2-fosfaat sesquimagnesiumzouthydraat (vitamine C) bij 37 °C gedurende maximaal vier passages. Menselijke dermale fibroblasten werden gekocht en gekweekt in DMEM aangevuld met 10% FBS en 1% P / S bij 37 ° C voor een maximum van 15 passages. Voor het zaaien van zowel keratocyten als dermale fibroblasten op de gefotopatterde celkweekchip werden 20.000 cellen per chip gebruikt. Maak de cellen van belang los (bijvoorbeeld met behulp van trypsine) en bereid 1 ml van een celsuspensie van ± 10.000-50.000 cellen / ml in kweekmedium per chip. Pas het exacte aantal cellen dat per substraat wordt toegevoegd aan, afhankelijk van de celgrootte en de gewenste uitlezing. Verwijder de PBS uit de celkweekchip en voeg 1 ml van de celsuspensie toe. Transporteer de celkweekchip voorzichtig met de cellen naar de incubator en incubeer gedurende 60 minuten bij 37 °C. Controleer de hechting van de cellen op de patrooncelkweekchip onder een brightfieldmicroscoop. Zoek naar langwerpige celmorfologieën in het geval van lijnpatronen (zie figuur 5). Als cellen ook buiten het patroongebied zijn gaan hechten, verwijder deze dan door medium op en neer te pipetteren direct boven de cellen op het substraat.OPMERKING: Cellen die aan het patroongebied zijn gekoppeld, blijven vastzitten, terwijl cellen buiten de patroongebieden losraken. Verwijder de celkweekchip uit de PDMS-container en gebruik een steriel pincet om het in een 6-well plaat gevuld met ~ 5 ml kweekmedium te plaatsen. Kweek de cellen voor de gewenste tijdsduur. Vervang het celkweekmedium elke 2-3 dagen. Om de visualisatie van het eiwitpatroon na celkweek te garanderen, vermindert u de hoeveelheid blootstelling van het monster aan licht tijdens de kweek. 9. Kleuring, beeldacquisitie en analyse Fixatie en vlekkenVerwijder na de gewenste lengte van de cultuur bijna al het medium en was drie keer met overtollig PBS. Incubeer vervolgens met 3,7% formaline gedurende 15 minuten op kamertemperatuur, gevolgd door drie wasstappen met PBS gedurende 5 minuten per wasbeurt bij kamertemperatuur. Laat het monster nooit uitdrogen.LET OP: Formaline is schadelijk als het wordt ingeslikt of als het wordt ingeademd (H302, H332), kan een allergische huidreactie veroorzaken (H317), wordt verdacht van het veroorzaken van genetische defecten (H341) en kan kanker veroorzaken (H350). Draag persoonlijke beschermingsmiddelen en werk in een zuurkast. Kleur het celkweeksubstraat met de gewenste kleuringsmiddelen of antilichamen. Om de volumes van kleuringsmiddelen te verminderen, plaatst u de celkweekchips ondersteboven in een druppel kleuringsoplossing die op een glasplaat is gepijpt. Bewaar de monsters in PBS (kortdurend) of bevestigd aan een afdekplaat met behulp van montagemedium (lange termijn) bij 4 °C. BeeldacquisitiePlaats het gekleurde monster ondersteboven in een druppel PBS op een glazen glijbaan. Plaats het monster in het stadium van een confocale microscoop. Afhankelijk van het vereiste detailniveau, maak je Z-stacks met een geschikt objectief (10x, 20x of 40x) en Z-afstand om de juiste beeldacquisitie te garanderen. Beeldanalyse en visualisatieOpen de RAW-afbeeldingsbestanden in de software voor beeldanalyse en controleer of de afbeeldingseigenschappen (bijv. afmetingen, resolutie) correct zijn. Pas indien nodig de helderheid en het contrast per kanaal aan. Snijd het interessegebied bij dat het patroon en de cellen bevat. Optioneel: voer indien nodig een deconvolutiestap uit. Maak een 3D-render van de Z-stack met behulp van 3D-renderingsoftware. Optimaliseer de contrast- en versterkingsinstellingen voor elk afzonderlijk kanaal. Als u een afbeelding van de 3D-render wilt maken, maakt u een momentopname en exporteert u deze als . TIFF-bestand. Als u een film van de 3D-render wilt maken, stelt u het begin- en eindframe en het tijdsbestek in voordat u de film registreert. Exporteer als .avi.

Representative Results

Door middel van het beschreven protocol kunnen 3D PDMS-celcultuursubstraten UV-gefotopatterd worden om nauwkeurige en high-throughput kleefgebieden te creëren die geschikt zijn voor celaanhechting. Op deze manier worden cellen tegelijkertijd onderworpen aan zowel relevante substraatgeometrieën als kleefligandpatronen. Celeigenschappen zoals oriëntatie, celoppervlak en aantal focale verklevingen kunnen eenvoudig worden bewaakt en gebruikt om het gedrag van cellen in complexe, in vivo-achtige omgevingen beter te begrijpen. Om de patroongebeurtenissen op de 3D PDMS-substraten te verifiëren, zijn atomaire oppervlaktesamenstellingen van het materiaal in verschillende stadia van het protocol gemeten met behulp van atomaire röntgenfoto-elektronenspectroscopie (XPS)48. Samenvattend toonden de XPS-metingen de aanwezigheid aan van PEG-ketens met een verhoogd koolstofsignaal op gepassiveerde monsters, dat na fotocorrectie werd verminderd. Incubatie met fibronectine resulteerde in een toename van het koolstofsignaal, wat opnieuw wijst op een succesvolle eiwithechting op het oppervlak van de celkweekchip. Vervolgens werden patroonresolutie en uitlijning op 3D-kenmerken gekarakteriseerd op een verscheidenheid aan cirkelvormige, concave putten (ĸ = 1/250 μm-1, ĸ = 1/1.000 μm-1 en ĸ = 1/3.750 μm-1, zie figuur 6). Uit de projecties met maximale intensiteit kan worden geconcludeerd dat het eiwitpatroon met succes is gemodelleerd op alle drie de 3D-kenmerken. Het intensiteitsprofiel in figuur 6A toont een hoge patroonresolutie met scherpe overgangen tussen gebieden met een patroon en gebieden zonder patronen. Bovendien werd een consistente eiwitintensiteit over het volledige patroon in de put verkregen. De concave put met ĸ = 1/250 μm-1 werd gemodelleerd met behulp van de single focal plane-methode (één patroon), terwijl de putten met ĸ = 1/1.000 μm-1 en ĸ = 1/3.750 μm-1 werden gemodelleerd met behulp van respectievelijk twee en drie focale vlakken (patronen). Zoals te zien is in de projecties met maximale intensiteit in figuur 6, resulteren beide methoden in een perfecte uitlijning van de patronen bovenop de kenmerken. Er kunnen geen verkeerd uitgelijnde overgangen tussen de twee verschillende brandpuntsvlakken en patronen worden waargenomen. Met behulp van het beschreven protocol kan een breed scala aan eiwitpatroonontwerpen worden toegepast op verschillende geometrieën (zie figuur 7 en video 1). Om de veelzijdigheid van deze methode te illustreren, werden semicylinders (convex en concaaf), een zadeloppervlak en een put met patronen gemaakt met behulp van lijnen en cirkels van verschillende breedtes. De gefotopatterde materialen kunnen vervolgens worden gebruikt voor celkweek (zie figuur 7, figuur 8, video 2, video 3 en video 4). Een voorbeeld van dermale fibroblasten gekweekt op een patroon (fibronectinelijnen, rood, 5 μm breed en 5 μm openingen) concave semicylinder is weergegeven in figuur 8, figuur 9 en video 4. Tijdens het experiment voelen cellen en hechten ze zich aan het multicue celcultuursubstraat en blijven ze levensvatbaar in de loop van de tijd. Zoals blijkt uit de immunofluorescente kleuring in figuur 8, vormen cellen focale verklevingen (vinculineclusters) voornamelijk op de fibronectinelijnen. Een ander voorbeeldonderzoek dat gebruik maakt van deze celkweekmaterialen is onlangs gepubliceerd door onze groep48. In deze studie werden menselijke myofibroblasten en endotheelcellen onderworpen aan de combinatie van contactgeleidingssignalen en geometrische topografieën. In vivo ervaren beide soorten cellen krommings- en contactgeleidingssignalen in inheemse weefsels zoals in de menselijke vasculatuur. Door de cellen in vitro te onderwerpen aan een omgeving die beide omgevingssignalen combineert, kan de in vivo situatie worden samengevat, waardoor een dieper inzicht ontstaat in de rol van de micro-omgeving op het gedrag van cellen. Van menselijke myofibroblasten werd aangetoond dat ze uitlijnen met contactgeleidingssignalen (parallelle fibronectinelijnen) op concave cilindrische substraten48. Op convexe structuren met toenemende krommingen overruleden de geometrische signalen echter de biochemische signalen, wat suggereert dat myofibroblasten zowel de mate als het teken van kromming kunnen waarnemen. Interessant is dat endotheelcellen zich alleen konden hechten aan de concave multicue substraten en niet aan de bolle PDMS-substraten. Op concave substraten met eiwitpatroon zijn de endotheelcellen georiënteerd in de richting van de contactgeleidingscue. Deze fundamentele in vitro kennis heeft fysiologische relevantie op het gebied van vasculaire weefseltechnologie en kan uiteindelijk helpen bij het ontwerpen van slimme weefselmanipulaties. Figuur 1: De experimentele tijdlijn van het toepassen van contactgeleidingssignalen op 3D-celcultuursubstraten. Ten eerste worden positieve celkweekchips geproduceerd uit een negatieve PDMS-mal die een reeks geometrieën bevat. Ongehard PDMS wordt in de mal gegoten en gedurende 3 uur bij 65 °C uitgehard. Vervolgens wordt het PDMS behandeld met O2-plasma en geïncubeerd met PLL en mPEG-SVA (blauw, gelabeld) om het oppervlak van het celcultuursubstraat te passiveren. Na het wassen wordt het substraat ondersteboven gekeerd in een druppel foto-initiator (PLPP, groen, gelabeld) en UV-gefotopatterd met behulp van de LIMAP-aanpak. Hier wordt een digitaal masker met een door de gebruiker gedefinieerd patroon gebruikt om de passiveringslaag op gedefinieerde locaties te splitsen. Vervolgens kan een eiwitoplossing (rood, gelabeld) worden geïncubeerd en hecht deze zich alleen aan de locaties waar de passiveringslaag wordt verwijderd. Cellen die op het substraat worden gezaaid, worden onderworpen aan zowel geometrie- als eiwitpatronen, wat onderzoek naar celgedrag in complexe, in vivo nabootsende omgevingen mogelijk maakt. Afkortingen: PDMS = polydimethylsiloxaan; mPEG-SVA = methoxypolyethyleenglycol-succinimidylvalraat; PLPP = 4-benzoylbenzyl-trimethylammoniumchloride; LIMAP = Licht-geïnduceerde moleculaire adsorptie van eiwitten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 2: Verschillende stadia tijdens de productie en passivering van het 3D-celcultuursubstraat. De negatieve glasvorm (#1) is ontworpen met computerondersteunde ontwerpsoftware en geproduceerd met behulp van een femtoseconde-laser direct-write techniek. Deze mal wordt gebruikt om de tussenliggende positieve PDMS-chip (# 2) en negatieve PDMS-mal (# 3) te produceren, die vervolgens worden gebruikt om de uiteindelijke celcultuurchip (# 4) te produceren. Afkorting: PDMS = polydimethylsiloxaan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 3: Schematische illustratie van de twee patroonmethoden. Links: UV-fotopatterning wordt uitgevoerd op kleinere functies (ongeveer één DMD) met behulp van een enkel brandpuntsvlak en patroon. Als gevolg hiervan is de volledige functie in één keer gemodelleerd. Rechts: Wanneer grotere objecten worden gebruikt (groter dan één DMD), wordt het patroon verdeeld over meerdere brandpuntsvlakken en patronen. Afkorting: DMD = digitaal spiegelapparaat. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 4: Een typisch voorbeeld van een normaal en uitgedroogd eiwit-geïncubeerd substraat. Maximale intensiteitsprojecties (XY) en orthogonale weergaven (XZ) van normale en uitgedroogde eiwit-geïncubeerde substraten. Bij het wassen van een patroonvormig celcultuursubstraat na incubatie met een eiwitoplossing, is het cruciaal om het monster altijd nat te houden. Hoewel het patroon identiek is in alle afbeeldingen op de kenmerken (ĸ = 1/1.000 μm-1), vormde de gelatine-fluoresceïne (groen) een grote klomp wanneer het monster een paar seconden werd gedroogd. Als het monster altijd nat blijft, kunnen de juiste eiwitpatronen worden waargenomen. Schaalbalken = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Figuur 5: Brightfield-afbeeldingen na het zaaien. Primaire keratocyten (links) en dermale fibroblasten (rechts) 4 uur na het zaaien op 3D geometrische kenmerken (concave put van ĸ = 1/1.000 μm-1 en semicylinders van ĸ = 1/500, 1/375, 1/250, 1/175 en 1/125 μm-1). De inserts linksboven vertegenwoordigen het lijnpatroon dat wordt gebruikt voor het patroon van de geometrieën. Witte pijlen geven verspreidende cellen aan die al uitlijning vertonen. Schaalbalken = 250 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Figuur 6: Karakterisering van cirkelvormige patronen op concave putten. (A) De maximale intensiteitsprojectie (XY) en orthogonale weergave (XZ) van een holle put (ĸ = 1/250 μm-1) met limap (lijnbreedte: 20 μm, spleetbreedte: 20 μm) en geïncubeerd met gelatine-fluoresceïne (groen). Het intensiteitsprofiel langs de witte lijn wordt tegen de afstand uitgezet, met een consistente patroonkwaliteit en resolutie. (B) Aanvullende patronen uitgevoerd op concave putten met ĸ = 1/1.000 μm-1 en ĸ = 1/3750 μm-1, met flexibiliteit in termen van geometrische kenmerken die kunnen worden gebruikt voor patronen. Nogmaals, zowel de maximale intensiteitsprojecties (XY) als orthogonale weergaven (XZ) worden gevisualiseerd. Schaalbalken = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Figuur 7: 3D-microscopiegegevens van patroonstructuren. Typische voorbeelden van 3D-patroon celkweekmaterialen na fotopatterning en celkweek, gevisualiseerd met behulp van 3D-renderingsoftware. (A) Convexe semicylinder met een patroon van 10 μm brede lijnen (rhodamine-fibronectine, rood) en 10 μm brede openingen. Schaalbalk = 5 μm. (B) Dermale fibroblasten gekleurd voor F-actine (groen) gekweekt op concave semicylinder met een patroon van 20 μm brede lijnen (rhodamine-fibronectine, rood) en 20 μm brede openingen. Schaalbalk = 5 μm. (C) Zadeloppervlak met 20 μm brede lijnen (rhodamine-fibronectine, rood) en 20 μm brede openingen. Schaalbalk = 5 μm. (D) Concave putpatroon met concentrische cirkels van 20 μm brede lijnen (gelatine-fluoresceïne, groen) en 20 μm brede openingen. Het F-actine cytoskelet van de menselijke keratocyten is gekleurd met behulp van falloidine en gevisualiseerd in rood. Schaalbalk = 200 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Figuur 8: Immunofluorescente kleuring van menselijke dermale fibroblasten op een gefotopatterde, concave semicylinder. (A) Maximale intensiteitsprojectie (XY) en orthogonale secties (XZ en YZ) van menselijke dermale fibroblasten gekweekt gedurende 24 uur op een patroon (fibronectinelijnen, rode, 5 μm brede en 5 μm openingen) concave semicylinder. Cellen worden gekleurd voor F-actine (magenta), vinculine (groen) en kernen (blauw). Schaalbalk = 100 μm. (B) Inzoomen van een cel die zich hecht aan de multicue-omgeving. Schaalbalken = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Figuur 9: Brightfield timelapse beelden van menselijke dermale fibroblasten op een patroon, concave cilinder. De concave semicylinder (ĸ = 1/250 μm-1) was gemodelleerd met parallelle lijnen (5 μm breed en 5 μm openingen) en geïncubeerd met rhodamine-fibronectine vóór het zaaien van cellen. De timelapse-beeldvorming wordt gestart 1 uur na de eerste celzaaiing (links, 0 min), wanneer cellen nog steeds afgerond en niet-hechtend zijn (pijlen). Na ongeveer 24 uur (midden, 1.420 min) hechtten cellen zich aan het multicue substraat en vertonen ze een uitlijningsrespons volgens het contactgeleidingspatroon. Zowel de uitlijningsrespons als de levensvatbaarheid van de cel blijven gedurende de gehele kweekduur (rechts, 3.180 min) behouden. Schaalbalken = 200 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Video 1: Patroonvoorbeeld op een cilindrische 3D-substraat. 3D-weergave van een bolle cilinder met een patroon van rhodamine-fibronectine (rood). Klik hier om deze video te downloaden. Video 2: 3D-weergave van dermale fibroblasten gekweekt op een patroon, 3D cilindrisch substraat (ĸ = 1/500 μm-1). Dermale fibroblasten gekweekt gedurende 24 uur op een patroon (fibronectinelijnen, rood, 10 μm breed en 10 μm openingen) convexe semicylinder. Cellen worden gekleurd voor F-actine (magenta), vinculine (groen) en kernen (blauw). Klik hier om deze video te downloaden. Video 3: 3D-weergave van menselijke keratocyten gekweekt op een patroon, 3D-put (ĸ = 1/3.750 μm-1). 3D-weergave van menselijke keratocyten gekweekt gedurende 24 uur in een concave, patroonvormige put (gelatinecirkels, groen, 20 μm breed en 20 μm openingen). Cellen zijn gekleurd voor F-actine (rood). Klik hier om deze video te downloaden. Video 4: Brightfield timelapse beeldvorming van menselijke dermale fibroblasten op een patroonvormige, concave cilinder. De concave semicylinder (ĸ = 1/250 μm-1) was gemodelleerd met parallelle lijnen (5 μm breed en 5 μm openingen) en geïncubeerd met rhodamine-fibronectine vóór het zaaien van cellen. De timelapse-beeldvorming wordt 1 uur na de eerste celzaaiing gestart, wanneer cellen initiële therapietrouw aan de multicue-omgeving vertonen. Tijdens de volledige time-lapse oriënteren cellen zich voornamelijk langs de contactbegeleidingssignalen, terwijl de levensvatbaarheid van de cel wordt gehandhaafd. Klik hier om deze video te downloaden.

Discussion

Tegenwoordig wordt celgedrag vaak bestudeerd op platte kweeksubstraten die de complexiteit van de inheemse celmicro-omgeving missen. 3D-omgevingen zoals steigers en hydrogels worden als alternatief gebruikt. Hoewel deze celkweekomgevingen de in vivo relevantie verbeteren, blijven zowel systematische studies van celgedrag als de haalbaarheid van uitleesmethoden een uitdaging. Om systematisch het gedrag van cellen op representatieve kweeksubstraten te onderzoeken, zijn consistente multicue substraten nodig die microscopische uitlezing mogelijk maken. Daarom beschrijven we in dit protocol een methode om multicue celcultuursubstraten te maken met fysiologisch relevante geometrieën en ecm-eiwitten met patronen. De belangrijkste uitdaging bij het combineren van omgevingssignalen zoals weefselgeometrie en contactgeleidingssignalen op in vitro platforms is grotendeels van technologische aard. Conventionele methoden om contactgeleidingssignalen (bijv. Zachte lithografie, diepe UV-patronen en microcontactafdrukken35,36) toe te passen op celkweekmaterialen zijn geoptimaliseerd voor vlakke substraten. De behoefte aan 3D-celkweekmaterialen in combinatie met contactbegeleidingssignalen benadrukte verschillende technologische uitdagingen, zoals slechte patroonuitlijning, resolutie en flexibiliteit. Om deze uitdagingen het hoofd te bieden, kan een high-throughput, maskerloze, op licht gebaseerde patroonmethode worden gebruikt45,49. Hier maakt een optische microscoop een nauwkeurige patroonuitlijning en een resolutie in de orde van micrometers mogelijk (zie figuur 6). Verder stelt het gebruik van een digitaal masker onderzoekers in staat om celgedrag op een breed scala aan patronen te bestuderen zonder de noodzaak om arbeidsintensieve fysieke maskers te fabriceren.

De UV-fotopatterning-benadering kan worden gebruikt in combinatie met een verscheidenheid aan 3D-geometrieën (bijv. Cilinders, zadels, koepels, putten) geproduceerd uit een reeks materialen48. De 3D-celcultuursubstraten die in dit onderzoek worden gebruikt, zijn gemaakt van PDMS; er kunnen echter ook andere materialen worden gebruikt. Dit kan verschillende stappen vereisen om het uiteindelijke celcultuursubstraat te produceren dat de interessante kenmerken bevat. Aangezien is aangetoond dat cellen gevoelig zijn voor oppervlakteruwheid van celkweekmaterialen, is het belangrijk om de celkweekchips met een glad oppervlak te maken, zodat de reactie van de waargenomen cellen volledig kan worden toegeschreven aan de 3D-geometrie en contactgeleidingssignalen50,51. Meetmethoden zoals optische profilometrie, scanning elektronenmicroscopie of atoomkrachtmicroscopie kunnen worden gebruikt om oppervlakteruwheid te meten. Na fabricage van het celkweekmateriaal kan men een patroonmethode selecteren op basis van een of meerdere brandpuntsvlakken, afhankelijk van de specifieke afmetingen van het interessante kenmerk (zie figuur 3). Meestal wordt een enkel brandpuntsvlak gebruikt om een gebied binnen een Z-bereik van ongeveer 50 μm te modelleren. De patroonresolutie bleek consistent te zijn met behulp van deze vuistregel (zie figuur 6). Een nadeel van deze methode is echter de toegenomen patroontijd met de introductie van meerdere brandpuntsvlakken en patronen. In onze hand, met behulp van meerdere brandpuntsvlakken, zijn 3D geometrische kenmerken tot 16 mm x 16 mm x 0,17 mm (X x Y x Z) met succes gemodelleerd met een hoge patroonkwaliteit.

Daarnaast is het belangrijk om te vermelden dat de hoogte (Z-as) van geometrische kenmerken die in combinatie met dit protocol kunnen worden gebruikt, beperkt is. Omdat zowel de UV-fotopatterning als veel cellulaire uitlezingen afhankelijk zijn van een microscopie-opstelling, bepaalt de werkafstand van de doelstellingen de maximale hoogte van een functie. In onze hand kunnen geometrieën van meer dan 300 μm nog steeds UV-gefotopatterd worden en zijn uitlezingen uitgevoerd met behulp van een confocale microscoop met 40x objectieven. Mechanobiologisch onderzoek, variërend van intracellulaire tot cellulaire en weefselschalen, is dus mogelijk met behulp van het beschreven protocol.

Een andere factor waarmee rekening moet worden gehouden, is het risico dat monsters uitdrogen tijdens of na de UV-fotovertterning49. Dit is vooral relevant bij het gebruik van 3D-geometrieën, omdat convexiteiten vaak buiten celkweekmaterialen worden blootgesteld. Zoals te zien is in figuur 4, kan dit resulteren in ongelijke patronen met eiwitaggregaten die zich bovenop het interessante kenmerk vormen. Het wassen van de celkweekchips na eiwitincubatie en tijdens celkweek is van cruciaal belang voor de juiste coating van 3D-geometrieën. Daarom wordt geadviseerd om altijd kleine volumes van een werkende oplossing (PBS, PLPP, eiwitoplossing, celkweekmedium) bovenop de celkweekchip te laten.

Tot nu toe zijn verschillende eiwitcoatings (fibronectine, collageen type I en IV, gelatine, FNC) en celtypen (menselijke beenmergstromale cellen, menselijke myofibroblasten, menselijke endotheelcellen, menselijke keratocyten en dermale fibroblasten) gebruikt in combinatie met de beschreven fotopatterningbenadering op gestructureerde celkweekmaterialen. Zoals aangetoond in een eerdere studie48, is de optimalisatie van eiwitincubatieparameters de sleutel voor het systematische onderzoek in nieuwe celtypen. Daarom wordt geadviseerd om, voordat u een nieuw experiment met nieuwe eiwitten of cellen uitvoert, een reeks eiwitconcentraties, incubatietemperaturen en incubatietijden te testen. Door celmorfologie na initiële adhesie op homogene, patroonvormige vlakke gebieden te vergelijken met celmorfologie onder ‘normale’ celkweekomstandigheden, kan een geoptimaliseerde set experimentele parameters worden verkregen. Bovendien kan elk celtype na het zaaien een andere hoeveelheid tijd nodig hebben om een herkenbare adhesiemorfologie op een specifieke multicue-omgeving weer te geven (zie figuur 5). Hiertoe is het van cruciaal belang om de tijd te optimaliseren die per celtype nodig is om contactgebeurtenissen op het patroongebied te presenteren tijdens het wassen in stap 8.4. We hebben bijvoorbeeld waargenomen dat online patronen menselijke keratocyten langwerpige morfologieën vertonen binnen de eerste 30 minuten na het zaaien, terwijl endotheelcellen en dermale fibroblasten meerdere uren nodig hebben voordat ze een verandering in adhesiemorfologie vertonen. De experimentele parameters die nodig zijn voor eiwitincubatie (stap 7) en celzaaien (stap 8) kunnen dus afhankelijk zijn van het eiwit en het celtype van keuze.

De gepresenteerde aanpak om contactbegeleidingssignalen toe te passen op 3D-geometrieën kan helpen bij het creëren van een dieper inzicht in celgedrag in complexe multicue-omgevingen. Dit kan onderzoek omvatten naar intracellulaire componenten, zoals focale verklevingen en kernen, en kan ook experimenten omvatten die worden uitgevoerd op een grotere, cel- of weefselschaal met behulp van de voorgestelde methode. Uiteindelijk wordt verwacht dat de opgedane kennis kan worden gebruikt bij het ontwerpen van tissue engineering-toepassingen, waarbij complexe cellulaire omgevingen worden ontworpen om celgedrag naar een gewenst resultaat te sturen.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We bedanken Dr. Nello Formisano (MERLN Institute for Technology-Inspired Regenerative Medicine) voor het leveren van menselijke primaire keratocyten. Dit werk is ondersteund door de Chemelot InSciTe (project BM3.02); de Europese Onderzoeksraad (subsidie 851960); en het Ministerie van Onderwijs, Cultuur en Wetenschap voor het Zwaartekrachtprogramma 024.003.013 “Materials Driven Regeneration”. De auteurs willen Alvéole bedanken voor hun correspondentie, hulp en probleemoplossing.

Materials

Anti-vinculin antibody, mouse monoclonal IgG1 Sigma V9131 Dilution: 1/600
Bovine Serum albumin, Fraction V Roche 10735086001
DMEM, high glucose, pyruvate Gibco 41966029
DMEM/F-12 + GlutaMAX (1x) Gibco 10565018
DMi8 epifluorescent microscope Leica Microsystems
Ethanol Biosolve 0005250210BS
Fetal Bovine Serum Serana 758093
Fiji/ImageJ, version v1.53k www.imageJ.nih.gov
Fluorescent highlighter Stabilo 4006381333627
Fluorescin-labeled gelatin Invitrogen G13187 Concentration: 0.01%
Formaldehyde solution Merck F8775
Glass coverslips 24 x 60 mm, #1 VWR 631-1575
Glass coverslips, ø = 32 mm, #1 Menzel-Gläser
HCX PL fluotar L 20X/0.40na microscope objective Leica 11506242
HEPES Gibco 15630080
Human dermal fibroblasts Lonza CC-2511
Human primary keratocytes MERLN Institute for Technology-Inspired Regenerative Medicine
Illustrator, Version 26.0.1 Adobe
Laboratory oven Carbolite
L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate Sigma-Aldrich A8960
Leica Application Suite X software, version 3.5.7.23225 Leica Microsystems
Leonardo software, version 4.16 Alvéole
Micro-manager, version 1.4.23 Open imaging
Mowiol 4-88 Sigma-Aldrich 81381 mounting medium
mPEG-succinimidyl valerate MW 5,000 Da Laysan Bio MPEG-SVA-5000 Concentration: 50 mg/mL
Negative glass mold FEMTOprint
NucBlue Live Readyprobes Reagent (Hoechst 33342) Invitrogen R37605 2 drops/mL
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Gibco 15140163
Petri dish (ø=100 mm) Greiner Bio-one 664160
Phalloidin Atto 647N Sigma 65906 Dilution: 1/250
Phosphate Buffered Saline Sigma P4417
Plasma asher Emitech K1050X
PLPP (photoinitiator) Alvéole
Poly-L-lysine, sterile-filtered Sigma-Aldrich P4707 Concentration: 0.01%
PRIMO Alvéole
Rhodamine-labeled fibronectin Cytoskeletn, Inc. FNR01 Concentration: 10 µg/mL
Secondary antibody with Alexa 488, Goat anti-mouse IgG1 (H) Molecular Probes A21121 Dilution: 1/300
Secondary antibody with Alexa 555, Goat anti-mouse IgG1 (H) Molecular Probes A21127 Dilution: 1/300
Spin coater Leurell Technologies Corporation model WS-650MZ-23NPPB
SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit DOW 1673921
TCS SP8X confocal microscope Leica Microsystems
tridecafluoro(1,1,2,2-tetrahydrooctyl)trichlorosilane ABCR AB111444
TrypLE Express Enzyme (1x), no phenol red Gibco 12604013
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red Gibco 25300054
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wang, Y., Wang, G., Luo, X., Qiu, J., Tang, C. Substrate stiffness regulates the proliferation, migration, and differentiation of epidermal cells. Burns. 38, 414-420 (2012).
  2. Viswanathan, P., et al. 3D surface topology guides stem cell adhesion and differentiation. Biomaterials. 52, 140-147 (2015).
  3. Peyton, S. R., et al. Marrow-derived stem cell motility in 3D synthetic scaffold is governed by geometry along with adhesivity and stiffness. Biotechnology and Bioengineering. 108 (5), 1181-1193 (2011).
  4. Vining, K. H., Mooney, D. J. Mechanical forces direct stem cell behaviour in development and regeneration. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (12), 728-742 (2017).
  5. Chaudhuri, O., Cooper-White, J., Janmey, P. A., Mooney, D. J., Shenoy, V. B. Effects of extracellular matrix viscoelasticity on cellular behaviour. Nature. 584, 535-546 (2020).
  6. Guido, S., Tranquillo, R. T. A methodology for the systematic and quantitative study of cell contact guidance in oriented collagen gels. Correlation of fibroblast orientation and gel birefringence. Journal of Cell Science. 105 (2), 317-331 (1993).
  7. Teixeira, A. I., Abrams, G. A., Bertics, P. J., Murphy, C. J., Nealey, P. F. Epithelial contact guidance on well-defined micro- and nanostructured substrates. Journal of Cell Science. 116, 1881-1892 (2003).
  8. Driscoll, M. K., Sun, X., Guven, C., Fourkas, J. T., Losert, W. Cellular contact guidance through dynamic sensing of nanotopography. ACS Nano. 8 (4), 3546-3555 (2014).
  9. Buskermolen, A. B. C., et al. Cellular contact guidance emerges from gap avoidance. Cell Reports Physical Science. 1 (5), 100055 (2020).
  10. Thrivikraman, G., et al. Cell contact guidance via sensing anisotropy of network mechanical resistance. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (29), 1-11 (2021).
  11. Buskermolen, A. B. C., et al. Entropic forces drive cellular contact guidance. Biophysical Journal. 116 (10), 1994-2008 (2019).
  12. Vignaud, T., et al. Reprogramming cell shape with laser nano-patterning. Journal of Cell Science. 125 (9), 2134-2140 (2012).
  13. Pouthas, F., et al. In migrating cells, the Golgi complex and the position of the centrosome depend on geometrical constraints of the substratum. Journal of Cell Science. 121 (14), 2406-2414 (2008).
  14. Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. Geometric control of cell life and death. Science. 276 (5317), 1425-1428 (1997).
  15. Théry, M., et al. Anisotropy of cell adhesive microenvironment governs cell internal organization and orientation of polarity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (52), 19771-19776 (2006).
  16. Huang, G., et al. Functional and biomimetic materials for engineering of the three-dimensional cell microenvironment. Chemical Reviews. 117 (20), 12764-12850 (2017).
  17. Callens, S. J. P., Uyttendaele, R. J. C., Fratila-Apachitei, L. E., Zadpoor, A. A. Substrate curvature as a cue to guide spatiotemporal cell and tissue organization. Biomaterials. 232, 119739 (2020).
  18. Yilmaz, C. O., Xu, Z. S., Gracias, D. H. Curved and Folded Micropatterns in 3D Cell Culture and Tissue Engineering. Methods in Cell Biology. 121, (2014).
  19. Silver, F. H., Freeman, J. W., Seehra, G. P. Collagen self-assembly and the development of tendon mechanical properties. Journal of Biomechanics. 36 (10), 1529-1553 (2003).
  20. Werner, M., Kurniawan, N. A., Bouten, C. V. C. Cellular geometry sensing at different length scales and its implications for scaffold design. Materials. 13 (4), 963 (2020).
  21. Di Cio, S., Bøggild, T. M. L., Connelly, J., Sutherland, D. S., Gautrot, J. E. Differential integrin expression regulates cell sensing of the matrix nanoscale geometry. Acta Biomaterialia. 50, 280-292 (2017).
  22. Fioretta, E. S., Simonet, M., Smits, A. I. P. M., Baaijens, F. P. T., Bouten, C. V. C. Differential response of endothelial and endothelial colony forming cells on electrospun scaffolds with distinct microfiber diameters. Biomacromolecules. 15 (3), 821-829 (2014).
  23. Werner, M., Kurniawan, N. A., Korus, G., Bouten, C. V. C., Petersen, A. Mesoscale substrate curvature overrules nanoscale contact guidance to direct bone marrow stromal cell migration. Journal of The Royal Society Interface. 15 (145), 20180162 (2018).
  24. Ruprecht, V., et al. How cells respond to environmental cues – insights from bio-functionalized substrates. Journal of Cell Science. 130 (1), 51-61 (2017).
  25. Bao, M., Xie, J., Huck, W. T. S. Recent advances in engineering the stem cell microniche in 3D. Advanced Science. 5 (1800448), 1-16 (2018).
  26. Zhan, X. Effect of matrix stiffness and adhesion ligand density on chondrogenic differentiation of mesenchymal stem cells. Journal of Biomedical Materials Research – Part A. 108 (3), 675-683 (2020).
  27. Jiang, T., et al. Untangling the response of bone tumor cells and bone forming cells to matrix stiffness and adhesion ligand density by means of hydrogels. Biomaterials. 188, 130-143 (2019).
  28. Choi, J. S., Harley, B. A. C. The combined influence of substrate elasticity and ligand density on the viability and biophysical properties of hematopoietic stem and progenitor cells. Biomaterials. 33, 4460-4468 (2012).
  29. Rape, A. D., Zibinsky, M., Murthy, N., Kumar, S. A synthetic hydrogel for the high-throughput study of cell-ECM interactions. Nature Communications. 6 (8129), 1-9 (2015).
  30. Camarero-Espinosa, S., et al. 3D printed dual-porosity scaffolds: the combined effect of stiffness and porosity in the modulation of macrophage polarization. Advanced Healthcare Materials. 11 (2101415), 1-16 (2022).
  31. Bao, M., et al. Cellular volume and matrix stiffness direct stem cell behavior in a 3D microniche. ACS Applied Materials and Interfaces. 11 (2), 1754-1759 (2019).
  32. Charest, J. L., Eliason, M. T., García, A. J., King, W. P. Combined microscale mechanical topography and chemical patterns on polymer cell culture substrates. Biomaterials. 27, 2487-2494 (2006).
  33. Bilem, I., et al. Interplay of Geometric Cues and RGD/BMP-2 crosstalk in directing stem cell fate. ACS Biomaterials Science and Engineering. 3 (10), 2514-2523 (2017).
  34. Nam, K. -. H., et al. Multiscale cues drive collective cell migration. Scientific Reports. 6, 29749 (2016).
  35. Alom Ruiz, S., Chen, C. S. Microcontact printing: A tool to pattern. Soft Matter. 3 (2), 168-177 (2007).
  36. Azioune, A., Carpi, N., Tseng, Q., Théry, M., Piel, M. Protein Micropatterns. A Direct Printing Protocol Using Deep UVs. Methods in Cell Biology. 97, (2010).
  37. Kane, R. S., Takayama, S., Ostuni, E., Ingber, D. E., Whitesides, G. M. Patterning proteins and cells using soft lithography. Biomaterials. 20 (23-24), 2363-2376 (1999).
  38. Azioune, A., Storch, M., Bornens, M., Théry, M., Piel, M. Simple and rapid process for single cell micro-patterning. Lab on a Chip. 9 (11), 1640 (2009).
  39. Offenhäusser, A., et al. Microcontact printing of proteins for neuronal cell guidance. Soft Matter. 3 (3), 290-298 (2007).
  40. Ricoult, S. G., Sanati Nezhad, A., Knapp-Mohammady, M., Kennedy, T. E., Juncker, D. Humidified microcontact printing of proteins: universal patterning of proteins on both low and high energy surfaces. Langmuir. 30 (40), 12002-12010 (2014).
  41. Waterkotte, B., et al. Biofunctional Micropatterning of Thermoformed 3D Substrates. Advanced Functional Materials. 24 (4), 442-450 (2014).
  42. Lehnert, D., et al. Cell behaviour on micropatterned substrata: Limits of extracellular matrix geometry for spreading and adhesion. Journal of Cell Science. 117 (1), 41-52 (2004).
  43. Sevcik, E. N., Szymanski, J. M., Jallerat, Q., Feinberg, A. W. Patterning on topography for generation of cell culture substrates with independent nanoscale control of chemical and topographical extracellular matrix cues. Current Protocols in Cell Biology. 75, 1-25 (2017).
  44. Micropatterning: Surface functionalization. Alvéole Available from: https://www.alveolelab.com/technology/micropatterning-surface-functionalization/ (2022)
  45. Strale, P. O., et al. Multiprotein printing by light-induced molecular adsorption. Advanced Materials. 28 (10), 2024-2029 (2016).
  46. van Gaal, R. C., Miltenburg, R. P. R. S., Kurniawan, N. A., Bouten, C. V. C., Dankers, P. Y. W. Renal epithelial cell responses to supramolecular thermoplastic elastomeric concave and convex structures. Advanced Materials Interfaces. 8 (1), 2001490 (2021).
  47. Foster, J. W., Gouveia, R. M., Connon, C. J. Low-glucose enhances keratocyte-characteristic phenotype from corneal stromal cells in serum-free conditions. Scientific Reports. 5, 1-16 (2015).
  48. Van Der Putten, C., et al. Protein micropatterning in 2.5D: an approach to investigate cellular responses in multi-cue environments. ACS Applied Materials and Interfaces. 13 (22), 25589-25598 (2021).
  49. Melero, C., et al. Light-induced molecular adsorption of proteins using the primo system for micro-patterning to study cell responses to extracellular matrix proteins. Journal of Visualized Experiments. (152), e60092 (2019).
  50. Hou, Y., et al. Surface roughness gradients reveal topography-specific mechanosensitive responses in human mesenchymal stem cells. Small. 16 (10), 1905422 (2020).
  51. Bourkoula, A., et al. Roughness threshold for cell attachment and proliferation on plasma micro-nanotextured polymeric surfaces: The case of primary human skin fibroblasts and mouse immortalized 3T3 fibroblasts. Journal of Physics D: Applied Physics. 49 (30), 304002 (2016).

Tags

UV-photopatterning3D Cell Culture SubstratesMulticue MicroenvironmentsContact Guidance PatternsPDMSFemtosecond Laser Direct WritingSubstrate PassivationPoly-L-lysine

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
van der Putten, C., D’Urso, M., Bril, M., Woud, T. E., Bouten, C. V. C., Kurniawan, N. A. Generation of Multicue Cellular Microenvironments by UV-Photopatterning of Three-Dimensional Cell Culture Substrates. J. Vis. Exp. (184), e63988, doi:10.3791/63988 (2022).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image