توليد البيئات الدقيقة الخلوية متعددة الإشارات عن طريق التنميط الضوئي بالأشعة فوق البنفسجية لركائز زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد
Summary
تقليديا ، يتم إجراء زراعة الخلايا على ركائز مستوية تحاكي بشكل سيئ البيئة الطبيعية للخلايا في الجسم الحي. هنا نصف طريقة لإنتاج ركائز زراعة الخلايا مع الهندسة المنحنية ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية والبروتينات خارج الخلية ذات النمط المجهري ، مما يسمح بإجراء تحقيقات منهجية في الاستشعار الخلوي لهذه الإشارات خارج الخلية.
Abstract
المصفوفة خارج الخلية هي منظم مهم لوظيفة الخلية. وقد ثبت بشكل متزايد أن الإشارات البيئية الموجودة في البيئة الدقيقة الخلوية ، مثل توزيع الليغاند وهندسة الأنسجة ، تلعب أدوارا حاسمة في التحكم في النمط الظاهري للخلية وسلوكها. ومع ذلك ، غالبا ما تتم دراسة هذه الإشارات البيئية وآثارها على الخلايا بشكل منفصل باستخدام منصات في المختبر تعزل الإشارات الفردية ، وهي استراتيجية تبالغ في تبسيط الوضع المعقد في الجسم الحي للإشارات المتعددة. يمكن أن تكون النهج الهندسية مفيدة بشكل خاص لسد هذه الفجوة ، من خلال تطوير إعدادات تجريبية تلتقط تعقيد البيئة الدقيقة في الجسم الحي ، مع الحفاظ على درجة الدقة وقابلية التلاعب بالأنظمة في المختبر .
تسلط هذه الدراسة الضوء على نهج يجمع بين نمط البروتين القائم على الأشعة فوق البنفسجية (UV) والتصنيع الدقيق للركيزة القائم على الطباعة الحجرية ، والتي تمكن معا من التحقيق عالي الإنتاجية في سلوكيات الخلايا في بيئات متعددة الإشارات. من خلال التنميط الضوئي للأشعة فوق البنفسجية بدون قناع ، من الممكن إنشاء توزيعات بروتين معقدة ولاصقة على ركائز زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد (3D) على رقائق تحتوي على مجموعة متنوعة من الإشارات الهندسية المحددة جيدا. يمكن استخدام التقنية المقترحة لركائز الاستزراع المصنوعة من مواد بوليمرية مختلفة ودمجها مع مناطق لاصقة منقوشة لمجموعة واسعة من البروتينات. مع هذا النهج ، يمكن أن تخضع الخلايا المفردة ، وكذلك الطبقات الأحادية ، لمجموعات من الإشارات الهندسية وإشارات توجيه الاتصال التي تقدمها الركائز المنقوشة. وبالتالي ، يمكن أن يوفر البحث المنهجي باستخدام مجموعات من مواد الرقائق وأنماط البروتين وأنواع الخلايا رؤى أساسية حول الاستجابات الخلوية للبيئات متعددة الإشارات.
Introduction
في الجسم الحي ، تخضع الخلايا لمجموعة واسعة من الإشارات البيئية التي يمكن أن تكون ذات طبيعة ميكانيكية وفيزيائية وكيميائية حيوية تنشأ من المصفوفة خارج الخلية (ECM). تم تحديد العديد من الإشارات البيئية للعب أدوار حيوية في تنظيم سلوك الخلايا ، مثل الانتشار والتمايز والهجرة1،2،3،4،5. واحدة من أكثر الظواهر التي تم التحقيق فيها على نطاق واسع هي توجيه الاتصال ، حيث تصف محاذاة الخلايا بوساطة الالتصاق على طول الأنماط الكيميائية الحيوية أو الطبوغرافية غير المتجانسة الموجودة على الركيزة خارج الخلية6،7،8،9،10،11. بالإضافة إلى توجيه محاذاة الخلايا ، فقد ثبت أيضا أن إشارات توجيه الاتصال تؤثر على خصائص الخلايا الأخرى مثل هجرة الخلايا ، وتنظيم البروتينات داخل الخلايا ، وشكل الخلية ، ومصير الخلية12،13،14،15. بالإضافة إلى ذلك ، تم الاعتراف أيضا بالبنية الهندسية للبيئة الخلوية ثلاثية الأبعاد لتأثيرها التنظيمي على سلوك الخلية16,17. في جسم الإنسان ، تتعرض الخلايا لمجموعة من الأشكال الهندسية المنحنية ، بدءا من ألياف الكولاجين الدقيقة ، والشعيرات الدموية ، والكبيبات ، وصولا إلى الحويصلات الهوائية المتوسطة والشرايين18،19. ومن المثير للاهتمام أن الدراسات الحديثة في المختبر أظهرت أن الخلايا يمكن أن تستشعر وتستجيب لمثل هذه الإشارات الفيزيائية ، من النانو إلى المقياس المتوسط 20،21،22،23.
حتى الآن ، تم إجراء معظم الدراسات التي تبحث في استجابة الخلايا للإشارات البيئية إلى حد كبير باستخدام الإعدادات التجريبية التي تعزل الإشارات الفردية. في حين أن هذا النهج قد سمح بإحراز تقدم هائل في فهم الآليات الأساسية وراء الاستشعار الخلوي للإشارات البيئية ، إلا أنه يلخص بشكل سيئ البيئة في الجسم الحي التي تقدم في وقت واحد إشارات متعددة. ولسد هذه الفجوة، من المفيد تطوير منصات ثقافية يمكن من خلالها التحكم في إشارات بيئية متعددة بشكل مستقل وفي وقت واحد. اكتسب هذا المفهوم قوة جذب متزايدة في الآونة الأخيرة 24,25 ، مع دراسات تجمع بين صلابة المصفوفة وكثافة الرباط 26,27,28,29 ، وصلابة الركيزة والمسامية 30 ، وصلابة الركيزة وحجم microniche 3D 31 ، وتضاريس السطح وإشارات توجيه الاتصال 32,33,34 ، وإشارات توجيه التلامس النانوية مع إشارات توجيه الانحناء متوسطة الحجم23. ومع ذلك ، لا يزال من الصعب الجمع بين إشارات توجيه الاتصال مع مجموعة متنوعة من الهندسة 3D بطريقة خاضعة للرقابة وعالية الإنتاجية.
يعالج بروتوكول البحث هذا هذا التحدي ويقدم طريقة لإنشاء ركائز زراعة الخلايا مع مزيج خاضع للرقابة من المناطق اللاصقة المنقوشة من بروتينات ECM (إشارات توجيه الاتصال) وانحناء الركيزة (الإشارات الهندسية). يسمح هذا النهج بتشريح استجابة الخلايا في بيئة متعددة الإشارات المحاكاة الحيوية بطريقة منهجية وعالية الإنتاجية. يمكن أن تساعد المعرفة المكتسبة في زيادة فهم سلوك الخلية في البيئات المعقدة ويمكن استخدامها لتصميم مواد مفيدة ذات خصائص توجه استجابات الخلايا إلى النتيجة المرجوة.
3D البروتين الضوئي
يمكن إنشاء مناطق لاصقة من بروتينات ECM (إشارات توجيه الاتصال) على مواد زراعة الخلايا باستخدام مجموعة متنوعة من التقنيات ، على سبيل المثال ، عن طريق نقش الأشعة فوق البنفسجية العميقة (الأشعة فوق البنفسجية العميقة) أو الطباعة الدقيقة35,36. يستخدم نمط الأشعة فوق البنفسجية العميقة ضوء الأشعة فوق البنفسجية الذي يتم إسقاطه من خلال قناع على مادة بوليمرية لتحلل بوليمرات التخميل في مواقع محددة على ركيزة زراعة الخلايا. ثم يتم احتضان الركيزة المنقوشة برباط ذي أهمية ، مما يؤدي إلى مناطق لاصقة تدعم ارتباط الخلايا وثقافتها في مواقع محددة مسبقا12،37،38. هناك طريقة بديلة لإدخال أنماط البروتين عن طريق الطباعة الدقيقة ، حيث يتم طلاء الطوابع المطاطية التي تحتوي على الشكل المطلوب ببروتين من اختيارك ويتم ضغطها على ركيزة مزرعة الخلايا ، وبالتالي نقل طلاء البروتين الذي يمكن للخلايا الالتصاق به35,37,39,40 . لسوء الحظ ، نظرا لأن كلتا التقنيتين تعتمدان على إعداد القناع وطرق الطباعة الحجرية الناعمة ، فإن التجارب تستغرق وقتا طويلا وتتطلب عمالة كثيفة ، فضلا عن أنها محدودة من حيث مرونة الأنماط. بالإضافة إلى ذلك ، فإن كلا من النقش العميق للأشعة فوق البنفسجية والطباعة الدقيقة هي الأكثر ملاءمة للمواد المستوية وهي صعبة تقنيا ، إن لم تكن مستحيلة ، لنقش الأربطة في بيئة 3D.
لتحسين هذه الطرق التقليدية ، قام Waterkotte et al. بدمج الطباعة الحجرية بدون قناع ، وترسب البخار الكيميائي ، والتشكيل الحراري لتوليد ركائز بوليمرية 3D 3D ذات الأنماط الدقيقة41. ومع ذلك ، تعتمد هذه التقنية على استخدام أفلام البوليمر القابلة للتشكيل الحراري وتوفر دقة منخفضة لنمط البروتين (7.5 ميكرومتر) ، في حين تم الإبلاغ عن استجابة الخلايا لأنماط البروتين الهندسية الصغيرة مثل 0.1 ميكرومتر 2,42. وصف Sevcik et al. طريقة واعدة أخرى لروابط ECM النانوية على ركائز تحتوي على طبوغرافيات نانوية وميكرومتر43. باستخدام الطباعة المتناغمة الدقيقة ، تم نقل بروتينات ECM من طوابع polydimethylsiloxane (PDMS) إلى ركيزة متعددة الاستجابة للحرارة (N-isopropylacrylamide) (pNIPAM). في وقت لاحق ، سمحت خاصية الاستجابة الحرارية لشبكة pNIPAM لهم بنقل نمط البروتين ثنائي الأبعاد (2D) إلى ركيزة PDMS الطبوغرافية (الأخاديد العميقة 10-100 ميكرومتر) ، وبالتالي التحكم في توطين مواقع الالتصاق على الميزات الطبوغرافية. ومع ذلك ، لا يمكن نقش جميع الطوبوغرافيات المجهرية الممكنة لأن انخفاض مشكلات قابلية البلل يجعل من الصعب تصميم ركائز طبوغرافية أعمق. تم الإبلاغ عن أن الخنادق ذات نسبة العرض إلى الارتفاع من العمق إلى العرض 2.4 هي الحد النهائي لنقل النمط بنجاح إلى الركيزة الطبوغرافية43. بالإضافة إلى ذلك ، فإن مرونة الأنماط المختلفة ودقة الأنماط التي تم إنشاؤها ضعيفة بسبب متطلبات الطباعة الدقيقة.
تصف هذه الورقة طريقة تتغلب على الاختناقات المذكورة أعلاه وتقدم طريقة مرنة وعالية الإنتاجية لإنشاء ركائز متعددة الإشارات يمكن استخدامها لزراعة الخلايا (انظر الشكل 1). الهندسة ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية (الأسطوانات والقباب والقطع الناقص وأسطح السرج) مع الانحناءات التي تتراوح من ĸ = 1/2500 إلى ĸ = 1/125 μm-1 مصممة مسبقا ودقيقة في رقائق PDMS. في وقت لاحق ، يتم إنشاء إشارات توجيه الاتصال على رأس الهندسة ثلاثية الأبعاد باستخدام مجموعة متنوعة من تصميمات الأنماط الرقمية من خلال استخدام تقنية التنميط الضوئي بدقة صغيرة تصل إلى 1.5 ميكرومتر44. تحقيقا لهذه الغاية ، يتم تخميل رقائق PDMS في البداية لمنع الخلايا والبروتينات من الالتصاق ؛ يمكن بعد ذلك إزالة طبقة التخميل هذه عن طريق الجمع بين البادئ الضوئي 4-benzoylbenzyl-trimethylammonium chloride (PLPP) والتعرض للأشعة فوق البنفسجية45. تم تصميم قناع رقمي لتحديد مواقع التعرض للأشعة فوق البنفسجية ، وبالتالي المنطقة التي تتم فيها إزالة طبقة التخميل. يمكن للبروتينات أن تلتصق لاحقا بهذه المناطق ، مما يتيح ربط الخلايا. نظرا لأن النقش يتم باستخدام قناع رقمي (بدلا من قناع مادي) ، يمكن إنشاء مجموعة متنوعة من الأنماط بسرعة دون المتاعب والتكلفة المرتبطة بتصميم وتصنيع أقنعة ضوئية إضافية. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تصميم مجموعة متنوعة من بروتينات ECM (على سبيل المثال ، الكولاجين من النوع الأول والجيلاتين والفيبرونيكتين) على الركيزة. على الرغم من أن هذا البروتوكول يتم تنفيذه باستخدام رقائق زراعة الخلايا المصنوعة من PDMS ، إلا أنه يمكن تطبيق المبدأ على أي مادة أخرى ذات أهمية46.
Protocol
Representative Results
Discussion
في الوقت الحاضر ، غالبا ما يتم دراسة سلوك الخلية على ركائز المزارع المسطحة التي تفتقر إلى تعقيد البيئة الدقيقة للخلية الأصلية. يتم استخدام بيئات 3D مثل السقالات والمواد الهلامية المائية كبديل. على الرغم من أن بيئات زراعة الخلايا هذه تحسن من أهمية الجسم الحي ، إلا أن كل من الدراسات المنهجية لسلوك الخلية وجدوى طرق القراءة لا تزال صعبة. للتحقيق بشكل منهجي في سلوك الخلية على ركائز الثقافة التمثيلية ، هناك حاجة إلى ركائز متعددة الإشارات متسقة تسمح بالقراءة المجهرية. لذلك ، في هذا البروتوكول ، نصف طريقة لإنشاء ركائز زراعة الخلايا متعددة الإشارات مع الهندسة ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية وبروتينات ECM المنقوشة. التحدي الرئيسي في الجمع بين الإشارات البيئية مثل هندسة الأنسجة وإشارات توجيه الاتصال على منصات المختبر هو إلى حد كبير ذو طبيعة تكنولوجية. تم تحسين الطرق التقليدية لتطبيق إشارات توجيه التلامس (مثل الطباعة الحجرية الناعمة ، والنقش العميق للأشعة فوق البنفسجية ، والطباعة الدقيقة 35,36) على مواد زراعة الخلايا للركائز المستوية. أبرزت الحاجة إلى مواد زراعة الخلايا 3D جنبا إلى جنب مع إشارات توجيه الاتصال العديد من التحديات التكنولوجية ، مثل سوء محاذاة النمط والدقة والمرونة. للتغلب على هذه التحديات ، يمكن استخدام طريقة نقش عالية الإنتاجية وغير مقنعة وقائمة على الضوء45,49. هنا ، يتيح المجهر الضوئي محاذاة دقيقة للنمط ودقة في ترتيب الميكرومتر (انظر الشكل 6). علاوة على ذلك ، فإن استخدام قناع رقمي يمكن الباحثين من دراسة سلوك الخلايا على مجموعة واسعة من الأنماط دون الحاجة إلى تصنيع أقنعة جسدية كثيفة العمالة.
يمكن استخدام نهج التصوير الضوئي بالأشعة فوق البنفسجية مع مجموعة متنوعة من الهندسة 3D (على سبيل المثال ، الأسطوانات والسروج والقباب والحفر) المنتجة من مجموعة من المواد48. الركائز زراعة الخلايا 3D المستخدمة في هذه الدراسة مصنوعة من PDMS. ومع ذلك ، يمكن استخدام مواد أخرى أيضا. قد يتطلب ذلك خطوات مختلفة لإنتاج الركيزة النهائية لزراعة الخلايا التي تحتوي على الميزات المثيرة للاهتمام. نظرا لأن الخلايا قد ثبت أنها حساسة لخشونة سطح مواد زراعة الخلايا ، فمن المهم إنشاء رقائق زراعة الخلايا بسطح أملس بحيث يمكن أن تعزى استجابة الخلايا المرصودة بالكامل إلى الهندسة ثلاثية الأبعاد وإشارات توجيه الاتصال50,51. يمكن استخدام طرق القياس مثل التنميط البصري أو المجهر الإلكتروني الماسح أو مجهر القوة الذرية لقياس خشونة السطح. بعد تصنيع مادة زراعة الخلايا ، يمكن للمرء اختيار طريقة نقش تستند إلى مستوى بؤري واحد أو عدة مستويات تعتمد على الأبعاد المحددة للميزة ذات الاهتمام (انظر الشكل 3). عادة ، يتم استخدام مستوى بؤري واحد لنمط منطقة داخل نطاق Z يبلغ حوالي 50 ميكرومتر. وتبين أن دقة النمط متسقة باستخدام هذه القاعدة الأساسية (انظر الشكل 6). ومع ذلك ، فإن الجانب السلبي لهذه الطريقة هو زيادة وقت التنميط مع إدخال مستويات وأنماط بؤرية متعددة. في أيدينا ، باستخدام مستويات بؤرية متعددة ، تم تصميم الميزات الهندسية ثلاثية الأبعاد التي تصل إلى 16 مم × 16 مم × 0.17 مم (X x Y × Z) بنجاح بجودة عالية النمط.
بالإضافة إلى ذلك ، من المهم الإشارة إلى أن الارتفاع (Z-axis) للميزات الهندسية التي يمكن استخدامها مع هذا البروتوكول محدود. نظرا لأن كلا من النمط الضوئي للأشعة فوق البنفسجية والعديد من القراءات الخلوية تعتمد على إعداد الفحص المجهري ، فإن مسافة العمل للأهداف تحدد الحد الأقصى لارتفاع الميزة. في أيدينا ، لا يزال من الممكن أن تكون الأشكال الهندسية التي يتجاوز ارتفاعها 300 ميكرومتر منقوشة بالأشعة فوق البنفسجية ، وقد تم إجراء القراءات باستخدام مجهر متحد البؤرة بأهداف 40x. وبالتالي ، فإن البحوث الميكانيكية البيولوجية التي تتراوح من داخل الخلايا إلى المقاييس الخلوية والأنسجة ممكنة باستخدام البروتوكول الموصوف.
عامل آخر يجب مراعاته هو خطر جفاف العينات أثناء أو بعد التصوير الضوئي للأشعة فوق البنفسجية49. هذا مهم بشكل خاص عند استخدام هندسات 3D ، حيث غالبا ما تتعرض التحدبات خارج مواد زراعة الخلايا. كما هو موضح في الشكل 4 ، قد يؤدي ذلك إلى أنماط غير متساوية مع تشكل مجاميع البروتين فوق ميزة الاهتمام. غسل رقائق زراعة الخلايا بعد حضانة البروتين وأثناء زراعة الخلايا أمر بالغ الأهمية للطلاء السليم للهندسة 3D. لذلك ، ينصح دائما بترك كميات صغيرة من محلول العمل (PBS ، PLPP ، محلول البروتين ، وسط زراعة الخلايا) فوق شريحة زراعة الخلايا.
حتى الآن ، تم استخدام العديد من طلاءات البروتين (الفيبرونيكتين ، الكولاجين من النوع الأول والرابع ، الجيلاتين ، FNC) وأنواع الخلايا (الخلايا اللحمية لنخاع العظم البشري ، الخلايا الليفية العضلية البشرية ، الخلايا البطانية البشرية ، الخلايا القرنية البشرية ، والخلايا الليفية الجلدية) بالاقتران مع نهج التنميط الضوئي الموصوف على مواد زراعة الخلايا المنظمة. كما هو موضح في دراسة سابقة48 ، فإن تحسين معلمات حضانة البروتين هو المفتاح للتحقيق المنهجي في أنواع الخلايا الجديدة. لذلك ، قبل إجراء تجربة جديدة مع بروتينات أو خلايا جديدة ، ينصح باختبار مجموعة من تركيزات البروتين ودرجات حرارة الحضانة وأوقات الحضانة. من خلال مقارنة مورفولوجيا الخلية بعد الالتصاق الأولي في مناطق مسطحة متجانسة ومنقوشة مع مورفولوجيا الخلية في ظل ظروف زراعة الخلايا “الطبيعية” ، يمكن الحصول على مجموعة محسنة من المعلمات التجريبية. بالإضافة إلى ذلك ، قد يتطلب كل نوع من الخلايا فترة زمنية مختلفة بعد البذر لإظهار مورفولوجيا التصاق يمكن التعرف عليها في بيئة محددة متعددة الإشارات (انظر الشكل 5). تحقيقا لهذه الغاية ، من الأهمية بمكان تحسين الوقت اللازم لكل نوع خلية لتقديم أحداث الاتصال على المنطقة المنقوشة أثناء الغسيل في الخطوة 8.4. على سبيل المثال ، لاحظنا أنه على أنماط الخط ، تظهر الخلايا القرنية البشرية مورفولوجيا ممدودة خلال أول 30 دقيقة بعد البذر ، في حين تتطلب الخلايا البطانية والخلايا الليفية الجلدية عدة ساعات قبل إظهار تغيير في مورفولوجيا الالتصاق. وبالتالي فإن المعلمات التجريبية المطلوبة لحضانة البروتين (الخطوة 7) وبذر الخلايا (الخطوة 8) قد تعتمد على البروتين ونوع الخلية المختارة.
يمكن أن يساعد النهج المقدم لتطبيق إشارات توجيه الاتصال على هندسة 3D في خلق فهم أعمق لسلوك الخلية في بيئات معقدة متعددة الإشارات. يمكن أن يشمل ذلك التحقيقات في المكونات داخل الخلايا ، مثل الالتصاقات البؤرية والنوى ، ويمكن أن يشمل أيضا تجارب أجريت على نطاق أكبر أو خلية أو نسيج باستخدام الطريقة المقترحة. في نهاية المطاف، من المتوقع أن المعرفة المكتسبة يمكن استخدامها في تصميم تطبيقات هندسة الأنسجة، حيث تم تصميم البيئات الخلوية المعقدة لتوجيه سلوك الخلايا نحو النتيجة المرجوة.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر الدكتور نيلو فورميسانو (معهد MERLN للطب التجديدي المستوحى من التكنولوجيا) على توفير خلايا القرنية الأولية البشرية. وقد تم دعم هذا العمل من قبل Chemelot InSciTe (المشروع BM3.02)؛ مجلس البحوث الأوروبي (منحة 851960)؛ ووزارة التربية والتعليم والثقافة والعلوم لبرنامج الجاذبية 024.003.013 “التجديد المدفوع بالمواد”. يود المؤلفون أن يشكروا Alvéole على مراسلاتهم ومساعدتهم واستكشاف الأخطاء وإصلاحها.
Materials
| Anti-vinculin antibody, mouse monoclonal IgG1 | Sigma | V9131 | Dilution: 1/600 |
| Bovine Serum albumin, Fraction V | Roche | 10735086001 | |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Gibco | 41966029 | |
| DMEM/F-12 + GlutaMAX (1x) | Gibco | 10565018 | |
| DMi8 epifluorescent microscope | Leica Microsystems | ||
| Ethanol | Biosolve | 0005250210BS | |
| Fetal Bovine Serum | Serana | 758093 | |
| Fiji/ImageJ, version v1.53k | www.imageJ.nih.gov | ||
| Fluorescent highlighter | Stabilo | 4006381333627 | |
| Fluorescin-labeled gelatin | Invitrogen | G13187 | Concentration: 0.01% |
| Formaldehyde solution | Merck | F8775 | |
| Glass coverslips 24 x 60 mm, #1 | VWR | 631-1575 | |
| Glass coverslips, ø = 32 mm, #1 | Menzel-Gläser | ||
| HCX PL fluotar L 20X/0.40na microscope objective | Leica | 11506242 | |
| HEPES | Gibco | 15630080 | |
| Human dermal fibroblasts | Lonza | CC-2511 | |
| Human primary keratocytes | MERLN Institute for Technology-Inspired Regenerative Medicine | ||
| Illustrator, Version 26.0.1 | Adobe | ||
| Laboratory oven | Carbolite | ||
| L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A8960 | |
| Leica Application Suite X software, version 3.5.7.23225 | Leica Microsystems | ||
| Leonardo software, version 4.16 | Alvéole | ||
| Micro-manager, version 1.4.23 | Open imaging | ||
| Mowiol 4-88 | Sigma-Aldrich | 81381 | mounting medium |
| mPEG-succinimidyl valerate MW 5,000 Da | Laysan Bio | MPEG-SVA-5000 | Concentration: 50 mg/mL |
| Negative glass mold | FEMTOprint | ||
| NucBlue Live Readyprobes Reagent (Hoechst 33342) | Invitrogen | R37605 | 2 drops/mL |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140163 | |
| Petri dish (ø=100 mm) | Greiner Bio-one | 664160 | |
| Phalloidin Atto 647N | Sigma | 65906 | Dilution: 1/250 |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma | P4417 | |
| Plasma asher | Emitech | K1050X | |
| PLPP (photoinitiator) | Alvéole | ||
| Poly-L-lysine, sterile-filtered | Sigma-Aldrich | P4707 | Concentration: 0.01% |
| PRIMO | Alvéole | ||
| Rhodamine-labeled fibronectin | Cytoskeletn, Inc. | FNR01 | Concentration: 10 µg/mL |
| Secondary antibody with Alexa 488, Goat anti-mouse IgG1 (H) | Molecular Probes | A21121 | Dilution: 1/300 |
| Secondary antibody with Alexa 555, Goat anti-mouse IgG1 (H) | Molecular Probes | A21127 | Dilution: 1/300 |
| Spin coater | Leurell Technologies Corporation | model WS-650MZ-23NPPB | |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit | DOW | 1673921 | |
| TCS SP8X confocal microscope | Leica Microsystems | ||
| tridecafluoro(1,1,2,2-tetrahydrooctyl)trichlorosilane | ABCR | AB111444 | |
| TrypLE Express Enzyme (1x), no phenol red | Gibco | 12604013 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300054 |
References
- Wang, Y., Wang, G., Luo, X., Qiu, J., Tang, C. Substrate stiffness regulates the proliferation, migration, and differentiation of epidermal cells. Burns. 38, 414-420 (2012).
- Viswanathan, P., et al. 3D surface topology guides stem cell adhesion and differentiation. Biomaterials. 52, 140-147 (2015).
- Peyton, S. R., et al. Marrow-derived stem cell motility in 3D synthetic scaffold is governed by geometry along with adhesivity and stiffness. Biotechnology and Bioengineering. 108 (5), 1181-1193 (2011).
- Vining, K. H., Mooney, D. J. Mechanical forces direct stem cell behaviour in development and regeneration. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (12), 728-742 (2017).
- Chaudhuri, O., Cooper-White, J., Janmey, P. A., Mooney, D. J., Shenoy, V. B. Effects of extracellular matrix viscoelasticity on cellular behaviour. Nature. 584, 535-546 (2020).
- Guido, S., Tranquillo, R. T. A methodology for the systematic and quantitative study of cell contact guidance in oriented collagen gels. Correlation of fibroblast orientation and gel birefringence. Journal of Cell Science. 105 (2), 317-331 (1993).
- Teixeira, A. I., Abrams, G. A., Bertics, P. J., Murphy, C. J., Nealey, P. F. Epithelial contact guidance on well-defined micro- and nanostructured substrates. Journal of Cell Science. 116, 1881-1892 (2003).
- Driscoll, M. K., Sun, X., Guven, C., Fourkas, J. T., Losert, W. Cellular contact guidance through dynamic sensing of nanotopography. ACS Nano. 8 (4), 3546-3555 (2014).
- Buskermolen, A. B. C., et al. Cellular contact guidance emerges from gap avoidance. Cell Reports Physical Science. 1 (5), 100055 (2020).
- Thrivikraman, G., et al. Cell contact guidance via sensing anisotropy of network mechanical resistance. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (29), 1-11 (2021).
- Buskermolen, A. B. C., et al. Entropic forces drive cellular contact guidance. Biophysical Journal. 116 (10), 1994-2008 (2019).
- Vignaud, T., et al. Reprogramming cell shape with laser nano-patterning. Journal of Cell Science. 125 (9), 2134-2140 (2012).
- Pouthas, F., et al. In migrating cells, the Golgi complex and the position of the centrosome depend on geometrical constraints of the substratum. Journal of Cell Science. 121 (14), 2406-2414 (2008).
- Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. Geometric control of cell life and death. Science. 276 (5317), 1425-1428 (1997).
- Théry, M., et al. Anisotropy of cell adhesive microenvironment governs cell internal organization and orientation of polarity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (52), 19771-19776 (2006).
- Huang, G., et al. Functional and biomimetic materials for engineering of the three-dimensional cell microenvironment. Chemical Reviews. 117 (20), 12764-12850 (2017).
- Callens, S. J. P., Uyttendaele, R. J. C., Fratila-Apachitei, L. E., Zadpoor, A. A. Substrate curvature as a cue to guide spatiotemporal cell and tissue organization. Biomaterials. 232, 119739 (2020).
- Yilmaz, C. O., Xu, Z. S., Gracias, D. H. Curved and Folded Micropatterns in 3D Cell Culture and Tissue Engineering. Methods in Cell Biology. 121, (2014).
- Silver, F. H., Freeman, J. W., Seehra, G. P. Collagen self-assembly and the development of tendon mechanical properties. Journal of Biomechanics. 36 (10), 1529-1553 (2003).
- Werner, M., Kurniawan, N. A., Bouten, C. V. C. Cellular geometry sensing at different length scales and its implications for scaffold design. Materials. 13 (4), 963 (2020).
- Di Cio, S., Bøggild, T. M. L., Connelly, J., Sutherland, D. S., Gautrot, J. E. Differential integrin expression regulates cell sensing of the matrix nanoscale geometry. Acta Biomaterialia. 50, 280-292 (2017).
- Fioretta, E. S., Simonet, M., Smits, A. I. P. M., Baaijens, F. P. T., Bouten, C. V. C. Differential response of endothelial and endothelial colony forming cells on electrospun scaffolds with distinct microfiber diameters. Biomacromolecules. 15 (3), 821-829 (2014).
- Werner, M., Kurniawan, N. A., Korus, G., Bouten, C. V. C., Petersen, A. Mesoscale substrate curvature overrules nanoscale contact guidance to direct bone marrow stromal cell migration. Journal of The Royal Society Interface. 15 (145), 20180162 (2018).
- Ruprecht, V., et al. How cells respond to environmental cues – insights from bio-functionalized substrates. Journal of Cell Science. 130 (1), 51-61 (2017).
- Bao, M., Xie, J., Huck, W. T. S. Recent advances in engineering the stem cell microniche in 3D. Advanced Science. 5 (1800448), 1-16 (2018).
- Zhan, X. Effect of matrix stiffness and adhesion ligand density on chondrogenic differentiation of mesenchymal stem cells. Journal of Biomedical Materials Research – Part A. 108 (3), 675-683 (2020).
- Jiang, T., et al. Untangling the response of bone tumor cells and bone forming cells to matrix stiffness and adhesion ligand density by means of hydrogels. Biomaterials. 188, 130-143 (2019).
- Choi, J. S., Harley, B. A. C. The combined influence of substrate elasticity and ligand density on the viability and biophysical properties of hematopoietic stem and progenitor cells. Biomaterials. 33, 4460-4468 (2012).
- Rape, A. D., Zibinsky, M., Murthy, N., Kumar, S. A synthetic hydrogel for the high-throughput study of cell-ECM interactions. Nature Communications. 6 (8129), 1-9 (2015).
- Camarero-Espinosa, S., et al. 3D printed dual-porosity scaffolds: the combined effect of stiffness and porosity in the modulation of macrophage polarization. Advanced Healthcare Materials. 11 (2101415), 1-16 (2022).
- Bao, M., et al. Cellular volume and matrix stiffness direct stem cell behavior in a 3D microniche. ACS Applied Materials and Interfaces. 11 (2), 1754-1759 (2019).
- Charest, J. L., Eliason, M. T., García, A. J., King, W. P. Combined microscale mechanical topography and chemical patterns on polymer cell culture substrates. Biomaterials. 27, 2487-2494 (2006).
- Bilem, I., et al. Interplay of Geometric Cues and RGD/BMP-2 crosstalk in directing stem cell fate. ACS Biomaterials Science and Engineering. 3 (10), 2514-2523 (2017).
- Nam, K. -. H., et al. Multiscale cues drive collective cell migration. Scientific Reports. 6, 29749 (2016).
- Alom Ruiz, S., Chen, C. S. Microcontact printing: A tool to pattern. Soft Matter. 3 (2), 168-177 (2007).
- Azioune, A., Carpi, N., Tseng, Q., Théry, M., Piel, M. Protein Micropatterns. A Direct Printing Protocol Using Deep UVs. Methods in Cell Biology. 97, (2010).
- Kane, R. S., Takayama, S., Ostuni, E., Ingber, D. E., Whitesides, G. M. Patterning proteins and cells using soft lithography. Biomaterials. 20 (23-24), 2363-2376 (1999).
- Azioune, A., Storch, M., Bornens, M., Théry, M., Piel, M. Simple and rapid process for single cell micro-patterning. Lab on a Chip. 9 (11), 1640 (2009).
- Offenhäusser, A., et al. Microcontact printing of proteins for neuronal cell guidance. Soft Matter. 3 (3), 290-298 (2007).
- Ricoult, S. G., Sanati Nezhad, A., Knapp-Mohammady, M., Kennedy, T. E., Juncker, D. Humidified microcontact printing of proteins: universal patterning of proteins on both low and high energy surfaces. Langmuir. 30 (40), 12002-12010 (2014).
- Waterkotte, B., et al. Biofunctional Micropatterning of Thermoformed 3D Substrates. Advanced Functional Materials. 24 (4), 442-450 (2014).
- Lehnert, D., et al. Cell behaviour on micropatterned substrata: Limits of extracellular matrix geometry for spreading and adhesion. Journal of Cell Science. 117 (1), 41-52 (2004).
- Sevcik, E. N., Szymanski, J. M., Jallerat, Q., Feinberg, A. W. Patterning on topography for generation of cell culture substrates with independent nanoscale control of chemical and topographical extracellular matrix cues. Current Protocols in Cell Biology. 75, 1-25 (2017).
- Micropatterning: Surface functionalization. Alvéole Available from: https://www.alveolelab.com/technology/micropatterning-surface-functionalization/ (2022)
- Strale, P. O., et al. Multiprotein printing by light-induced molecular adsorption. Advanced Materials. 28 (10), 2024-2029 (2016).
- van Gaal, R. C., Miltenburg, R. P. R. S., Kurniawan, N. A., Bouten, C. V. C., Dankers, P. Y. W. Renal epithelial cell responses to supramolecular thermoplastic elastomeric concave and convex structures. Advanced Materials Interfaces. 8 (1), 2001490 (2021).
- Foster, J. W., Gouveia, R. M., Connon, C. J. Low-glucose enhances keratocyte-characteristic phenotype from corneal stromal cells in serum-free conditions. Scientific Reports. 5, 1-16 (2015).
- Van Der Putten, C., et al. Protein micropatterning in 2.5D: an approach to investigate cellular responses in multi-cue environments. ACS Applied Materials and Interfaces. 13 (22), 25589-25598 (2021).
- Melero, C., et al. Light-induced molecular adsorption of proteins using the primo system for micro-patterning to study cell responses to extracellular matrix proteins. Journal of Visualized Experiments. (152), e60092 (2019).
- Hou, Y., et al. Surface roughness gradients reveal topography-specific mechanosensitive responses in human mesenchymal stem cells. Small. 16 (10), 1905422 (2020).
- Bourkoula, A., et al. Roughness threshold for cell attachment and proliferation on plasma micro-nanotextured polymeric surfaces: The case of primary human skin fibroblasts and mouse immortalized 3T3 fibroblasts. Journal of Physics D: Applied Physics. 49 (30), 304002 (2016).
