세포내 소포 파열의 기능을 연구하기 위한 광역학적 접근
Summary
AlPcS2a 매개 발색단 보조 레이저 비활성화(CALI)는 살아있는 세포에서 세포내 소포(IV)의 시공간 손상을 연구하기 위한 강력한 도구입니다.
Abstract
세포내 소포(IV)는 소포가 세포질로 세포내로 세포내이입되는 것을 통해 형성됩니다. IV 형성은 IV 막의 투과화와 엔도솜 및 리소좀의 형성을 통해 다양한 신호 경로를 활성화하는 데 관여합니다. 발색단 보조 레이저 비활성화(CALI)라는 방법이 IV 형성과 IV 조절을 제어하는 재료를 연구하는 데 적용됩니다. CALI는 막 투과화에 의해 유도된 신호 전달 경로를 연구하기 위한 이미징 기반 광역학 방법론입니다. 이 방법을 사용하면 선택된 세포 기관의 시공간 조작이 세포에서 투과될 수 있습니다. CALI 방법은 엔도솜과 리소좀의 투과를 통해 특정 분자를 관찰하고 모니터링하는 데 적용되었습니다. IV의 막 파열은 갈렉틴-3과 같은 글리칸 결합 단백질을 선택적으로 모집하는 것으로 알려져 있습니다. 여기에서 프로토콜은 AlPcS2a 에 의한 IV 파열 유도와 손상된 리소좀을 표지하기 위한 마커로 갈렉틴-3의 사용을 설명하며, 이는 IV 막 파열의 다운스트림 효과와 다양한 상황에서 다운스트림 효과를 연구하는 데 유용합니다.
Introduction
세포내 소포(IV)의 일종인 엔도솜은 엔도사이토시스에 의해 형성되고 리소좀으로 성숙합니다. 다양한 세포 내 신호 경로가 IV의 형성에 관여합니다. 또한, 상이한 내인성 및 외인성 자극이 IV를 손상시킬 수 있습니다(예: 병원체는 감염 중에 경계막에서 빠져나와 세포질1로 들어갈 수 있음). 이것은 일반적으로 endocytotic vesicle의 파열을 동반합니다2. 따라서 IV를 표적화하고 손상시키는 기술은 관련 연구에서 사용될 수 있다3.
광역학 치료(Photodynamic therapy, PDT)는 종양이나 병원체를 죽임으로써 질병을 퇴치하기 위한 빛 의존 요법이다4. PDT에서, 표적 세포는 광감작제라고 불리는 비독성 발색단으로 표지되며, 이는 광 조명 5,6에 의해 국소적으로 활성화될 수 있다. 감광제는 빛에서 에너지를 흡수하여 여기된 일중항 상태로 변환되어 수명이 긴 여기된 삼중항 상태로 이어집니다. 삼중항 상태의 광감작제는 전자 또는 에너지 전달을 겪을 수 있고, 산소의 존재 하에서 반응성 산소종(ROS)을 형성할 수 있으며, 조명 영역(7) 내에서 표지된 세포를 공간적으로 파괴할 수 있다. 결과는 빛의 힘에 따라 달라진다8. 감광제의 농도와 조명 강도를 제어함으로써 표적 생체 분자를 세포 용해 없이 선택적으로 비활성화할 수 있으며, 이를 발색단 보조 광 비활성화(CALI)라고 합니다9. 다양한 세포 내 표적을 선택적으로 표지할 수 있는 광감작제가 크게 개발됨에 따라 CALI는 미토콘드리아및 엔도-리소좀과 같은 세포 기관뿐만 아니라 뉴클레오티드 및 단백질과 같은 작은 생체 분자에 대한 생체 분자의 빛 매개 불활성화를 제어하는 귀중한 도구가 되었습니다 3,10,11,12,13.
CALI와 비교하여 화학적 또는 물리적 방법은 박테리아 독소 14,15 및 리소좀 손상에 대한 Leu-Leu-OMe16 치료와 같은 막을 손상시키는 데에도 사용됩니다. 그러나 이러한 방법은 세포 내에서 IV의 대량 손상을 표시합니다. 강력한 감광제(즉, Al(III) 프탈로시아닌 클로라이드 디설폰산(AlPcS2a))가 CALI에 사용됩니다. 엔도사이토시스(endocytosis)를 통해 리소좀을 표적으로 하는AlPcS2a는 제어 영역(17)에서 엔도솜 또는 리소좀을 파열시키는 데 사용된다. AlPcS2a는 세포막 불투과성 프탈로시아닌 기반 발색단으로 원형질막의 지질에 결합하고 엔도사이토시스를 통해 내재화되어 결국 내세포 경로18을 통해 리소좀 내에 축적됩니다. 근적외선 스펙트럼 영역 내에서 빛을 흡수하고 여기된 AlPcS2a18에 의해 생성되는 주요 ROS인 일중항 산소를 생성합니다. 일중항 산소 붕괴는 세포의 작은 영역(약 10-20nm) 내에서 확산 및 반응 거리를 빠르게 제한합니다19. AlPcS2a 배양 기간 및 광 조명을 조정함으로써 세포 내 영역 내에서 IV의 손상에 대한 시공간 제어가 허용됩니다. 따라서 CALI는 IV 손상의 결과와 IV의 형성 및 조절을 조사하는 강력한 도구가 됩니다.
본 연구에서는 AlPcS2a를 광감작제로 사용하는 CALI의 특정 프로토콜을 다룬다. 이 프로토콜은 엔도솜 및 리소좀을 포함한 다양한 유형의 IV에 적용할 수 있으며 막 파열 후 후속 반응을 검사하는 데 사용할 수 있습니다. 리소좀 파열 후 밝혀진 형광단 접합 갈렉틴-316,20을 발현하는 HeLa 세포는 이 프로토콜을 입증하는 데 사용됩니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
AlPcS2a는 원형질막에 결합한 다음 엔도사이토시스에 의해 내재화되어 결국 리소좀에 축적됩니다. 따라서 AlPcS2a는 배양 기간을 조정하여 세포하 구획에 국한시킬 수 있습니다. 이 방법론의 한계는 ER 및 골지체와 같은 IV의 다른 막 공급원이 많기 때문에 엔도사이토시스를 통해 IV의 하위 집단만 AlPcS2a에 의해 표지될 수 있다는 것입니다. 또한, AlPcS2a를 초기 또는 후기…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 연구 지원을 위해 Academia Sinica Inflammation Core Facility, IBMS에 감사드립니다. 핵심 시설은 Academia Sinica Core Facility and Innovative Instrument Project (AS-CFII-111-213)의 자금 지원을 받습니다. 저자는 이미지 획득을 지원해 준 IBMS(Institute of Biomedical Sciences), AS(Academia Sinica)의 Common Equipment Core Facility에 감사드립니다.
Materials
| Reagent | |||
| Al(III) Phthalocyanine Chloride Disulfonic acid (AlPcS2a) | Frontier Scientific | P40632 | |
| Culture dish | ibidi | 812128-200 | |
| Culture Medium | DMEM supplemented with 10% FBS and 100 U/mL penicillin G and 100 mg/mL Streptomycin | ||
| DMEM | Gibco | 11965092 | |
| FBS | Thermo Fisher Scientific | A4736301 | |
| Gal3-GFP plasmid | addgene | ||
| Lipofectamine 3000 kit | Thermo Fisher Scientific | L3000008 | |
| LysoTracker Green DND-26 | Thermo Fisher Scientific | L7526 | green fluorescent dye |
| Multiwall plate | perkinelmer | PK-6005550 | |
| NaOH | Thermo Fisher Scientific | Q15895 | |
| OptiMEM | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140163 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco | 21600-069 | 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4 |
| Cell line | |||
| HeLa Cell Line | ATCC | CCL-2 | The methods are applicable for most of the attached cell lines. Conditions must be determined individually. |
| Equipments | |||
| 0.22 µm Filter | Merck | SLGV013SL | |
| Collimated LED Light (660nm) | Thorlabs | M660L3-C1 and DC2100 | Near-infared light is ideal base on the excitation spectrum of AlPcS2a. |
| Confocal microscopy | Carl Zeiss | LSM 780 | An incubation system is required for long-term imaging. |
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers | Thermo Fisher Scientific | ||
| Red LED light | Tholabs | M660L4-C1 |
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