Biobank for Translational Medicine: Standard Operating Procedures for Optimal Sample Management

Giuseppina Bonizzi; Maria Capra; Cristina Cassi; Giulio Taliento; Oriana Pala; Elham Sajjadi; Konstantinos Venetis; Mariia Ivanova; Massimo Monturano; Giuseppe Renne; Lorenzo Zattoni; Elena Guerini-Rocco; Giuseppe Viale; Roberto Orecchia; Nicola Fusco

doi:10.3791/63950

JoVE Journal > Cancer Research

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Cancer Research

Translasyonel Tıp için Biyobanka: Optimal Numune Yönetimi için Standart Çalışma Prosedürleri

Published: November 30, 2022

doi:

10.3791/63950

Summary

Biyobankalar biyomedikal araştırmalar için çok önemli kaynaklardır ve Avrupa Onkoloji Enstitüsü’ndeki Translasyonel ve Dijital Tıp Birimi için Biyobanka bu alanda bir modeldir. Burada, biyobankaların farklı insan biyolojik numunelerinin yönetimi için standart çalışma prosedürlerinin ayrıntılı bir açıklamasını sunuyoruz.

Abstract

Biyobankalar, yüksek kaliteli insan biyolojik örneklerinin ve araştırma, teşhis ve kişiselleştirilmiş tıp için ilişkili verilerin toplanmasını, depolanmasını, işlenmesini ve paylaşılmasını amaçlayan kilit araştırma altyapılarıdır. Avrupa Onkoloji Enstitüsü’ndeki (IEO) Translasyonel ve Dijital Tıp Birimi için Biyobanka, bu alanda bir dönüm noktasıdır. Biyobankalar, yenilikçi teşhis, biyobelirteç keşfi ve klinik araştırma tasarımı dahil olmak üzere hastaların tedavisini ve bilimsel ilerlemesini destekleyen klinik bölümler, iç ve dış araştırma grupları ve endüstri ile işbirliği yapmaktadır. Biyobankaların modern araştırmalardaki merkezi rolü göz önüne alındığında, biyobankacılık standart çalışma prosedürleri (SÇP’ler) son derece hassas olmalıdır. Sertifikalı uzmanlar tarafından yapılan SÇP’ler ve kontroller, bilime dayalı, tanısal, prognostik ve terapötik kişiselleştirilmiş stratejilerin uygulanması için en yüksek kalitede numuneler alınmasını sağlar. Bununla birlikte, biyobankaları standartlaştırmak ve uyumlu hale getirmek için sayısız çabaya rağmen, etik ve yasal ilkelere dayanan katı kurallar, kalite kontrolleri ve kılavuzlar izleyen bu protokollere kolayca erişilememektedir. Bu yazıda büyük bir kanser merkezinin biyobanka standart çalışma prosedürleri sunulmaktadır.

Introduction

Biyobankalar, insan biyolojik örneklerinin ve araştırma ve teşhis için ilişkili verilerin toplanmasını, depolanmasını, işlenmesini ve paylaşılmasını amaçlayan biyodepolardır. Rolleri sadece biyobelirteçlerin keşfi ve doğrulanması için değil, aynı zamanda yeni ilaçların geliştirilmesi için de çok önemlidir¹. Bu nedenle, translasyonel ve klinik araştırma programlarının büyük çoğunluğu yüksek kaliteli biyoörneklere erişime dayanmaktadır. Bu bakımdan, biyobankalar akademik araştırmalar ile ilaç/biyoteknoloji endüstrisi arasında bir köprü olarak kabul edilmektedir 2,3,4,5. Büyük veri toplama ve yapay zekanın sağladığı benzeri görülmemiş fırsatlar sayesinde, biyobankaların kanser araştırmalarındaki rolü sürekli olarak gelişmektedir⁶.

Biyobankalar tarafından işlenen biyomateryallerin geniş spektrumu, demografik ve çevresel veriler, tümör tipi, histolojik derece, evre, lenfovasküler invazyon varlığı ve biyobelirteçlerin durumu ^7,8 dahil olmak üzere klinikopatolojik bilgilerle birleştirilmiştir. Ne kadar yüksek kaliteli örnekler ve veriler elde edilebilirse, araştırma o kadar hızlı ilerleyecek ve sağlık hizmeti sunumunu etkileyecektir⁹. Yaygın olarak benimsenen SÇP’lere, kalite kontrollerine ve yönergelere (örneğin, ABD Ulusal Kanser Enstitüsü, İngiltere Kanser Biyobankaları Konfederasyonu ve AB Uluslararası Biyolojik ve Çevresel Depolar Derneği) uyması gereken etik ve yasal ilkelere dayanan katı bir düzenleyici çerçeve ^vardır10,11.

Biyobankaların tüm önemli yönleri için SÇP’lerin geliştirilmesi, kalite, izlenebilirlik, tutarlılık, tekrarlanabilirlik ve geri dönüş süreleri açısından çeşitli avantajlar sağlamaktadır^12,13. SÇP uygulamasının bir diğer önemli yönü de biyobanka çalışanları ve araştırmacıları için daha iyi problem çözme ve alternatif prosedürlere olanak tanıyan biyobanka yönetiminin optimizasyonu ile temsil edilmektedir¹⁴. Tüm bu yönler biyobanka iş akışının bir parçasıdır (Şekil 1).

Şekil 1: Biyobankacılığın optimizasyonuna katkıda bulunan farklı faktörler. Kısaltma: LIMS = laboratuvar bilgi yönetim sistemi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Bu son derece spesifik ve hassas veriler, biyobankacılıkta sıkı yönetsel standart prosedürler gerektirir. Biyobanka örneklerine ve verilerine erişmesi gereken tüm araştırmacılara ayrıntılı ve doğrulanmış bir proje formu sunulmalıdır. İstekte verilen bilgiler, çalışma metodolojisini ve tasarımını, amaçlarını, hedeflerini ve bütçesini içermelidir. Araştırma projelerine yapılan başvuruların değerlendirilmesinde sermaye rolü olan bir biyobanka Teknik Bilim Kurulu kurulmalıdır. Bu organ, biyobanka biriminden, klinik bölümlerden, araştırma gruplarından, veri korumadan, hukuk bürosundan ve teknoloji transfer ofisinden üyeleri içermelidir.

Avrupa Onkoloji Enstitüsü’nün (IEO) Translasyonel ve Dijital Tıp Birimi için Biyobanka, sağlanan hizmetlerin kalitesi ve niceliğinin yanı sıra inovasyon açısından biyobankalar için dünya çapında bir referanstır. Bu tam sertifikalı tesis (UNI EN ISO 9001: 2015-Certiquality), BBMRI-ERIC İtalyan düğümünün (yani, Biyobankacılık ve BiyoMoleküler Kaynaklar Araştırma Altyapısı) ayrılmaz bir parçasıdır ve hem klinik birimler hem de araştırma altyapısı ile etkileşime girer.

Biyobankalar tarafından depolanan biyoörnek türlerinde büyük heterojenlik vardır. Bunlar arasında doku örnekleri (taze dondurulmuş veya parafin korunmuş) biyosıvılar (örneğin, plazma, serum, kan, idrar, dışkı), hücre kültürleri ve periferik kan mononükleer hücreleri (PBMC’ler) bulunur. Biyobankamız, Avrupa’nın en büyük biyobanka ağlarından biri olan ve ulusal düğümler tarafından koordine edilen biyobankalara ve biyomoleküler kaynaklara erişim için bir portal sağlayan Avrupa Biyobankacılık Araştırma Altyapısı (BBMRI-ERIC) ile sinerjik bir şekilde faaliyet göstermektedir¹⁵. BBMRI-ERIC’e ek olarak, Uluslararası Biyolojik ve Çevresel Depolar Derneği (ISBER) de biyobankacılık¹⁶ için işletme prosedürlerinin standardizasyonunda önemli bir rol oynamıştır.

Patoloji Bölümü’nün bir parçası olan Biyobanka Birimi, hastanın merkeziliğine, klinik araştırmaların geliştirilmesine destek, sürekli iyileştirme, insan kaynaklarının artırılması, uluslararası işbirliği, eğitim etkinliklerine destek, işyerinde güvenlik ve bilimsel ve teknolojik büyümeye kendini adamıştır. Ortak vizyon, hizmetlerin ve inovasyonun kalitesi ve miktarı açısından biyobankalar için ulusal ve Avrupa simgelerini oluşturmaktır. Toplanan biyolojik örnekler, yeni biyobelirteçleri ve yeni ilaçları tanımlamak (örneğin, giderek daha kişiselleştirilmiş tedaviler geliştirmek) ve araştırmada mükemmellik yoluyla hastalar için mevcut en iyi tedaviyi sağlamak için kullanılır.

Her biyolojik örnek, hasta¹⁵ tarafından ifade edilen Bilimsel Araştırma Katılım Anlaşması’nın varlığı için önceden doğrulandıktan sonra toplanır ve işlenir. Biyolojik olarak toplanan örnekler, araştırma projeleri veya klinik çalışmalar yürütmek için kullanılır ve aşırı (yani, teşhis amacıyla gerekli değildir), patolojik ve patolojik olmayan cerrahi örnekleri, sıvı biyopsileri (örneğin, kan, serum, plazma ve idrar) ve diğer biyolojik örnekleri içerir. Bu biyomateryaller özel kriyoprezervasyon protokollerine göre depolanır. Bu yazıda büyük bir kanser merkezinin biyobanka protokolleri sunulmaktadır.

Protocol

Bu protokol meme, yumurtalık, prostat, akciğer ve kolon kanserlerinde kullanılan SÇP’lere odaklanmaktadır. Burada açıklanan tüm prosedürler Bilimsel Teknik Kurul, Etik Kurul (AK) ve Meme, Jinekoloji, Üroloji, Göğüs Cerrahisi ve Sindirim Sistemi Cerrahisi Programları Direktörleri tarafından onaylanmıştır. Çalışma prosedürleri, 1964 Helsinki Deklarasyonu’nu, 2018 Genel Veri Koruma Yönetmeliği (GDPR) yasasını ve sonraki değişiklikleri takip etmektedir. GDPR yasasından türetilen kurumsal bir Araştırma Katılım Anlaşması (RPA), biyolojik örnekleri ve kişisel, klinik ve genetik verileri toplamak için tüm hastalardan alınan bilgilendirilmiş onamını temsil eder. RPA, elde edilen verilerin depolanması, işlenmesi ve bilimsel amaçlarla kullanılması için tüm hastalardan elde edildi. 1. Biyolojik numunelerin ön koşulları Bir hastanın RPA ve proje protokolüne dayalı kayıt koşullarını karşılayıp karşılamadığını kontrol edin ve tüm hastalara ayrıntılı bir RPA açıklaması sağlayın.Hasta katılımını artırın, örneğin, hastaları RPA’nın önemi ve etkisi hakkında bilgilendirmek için bekleme odalarında eğitici bir çizgi film videosu yayınlayın. Tüm hastalara gadget yer imleri sağlayın (https://www.ieo.it/it/PER-I-PAZIENTI/I-diritti-del-paziente/Consensi-informati/ ve https://vimeo.com/679070846’daki serbestçe erişilebilen kısa çizgi film animasyonuna bakın). Her hastaneye yatış aşamasında rıza uygulamasını gerçekleştirmek için personeli eğitin ve hastalar belirli bir çalışmaya katılırsa ek bilgi sağlayın.NOT: RPA imzalanmazsa, biyolojik örnekler toplanmaz. SARS-CoV-2 (COVID-19), hepatit B (HBV), hepatit C (HCV) ve insan immün yetmezlik virüsü (HIV) ile enfeksiyon geçiren vakaları dahil etmekten kaçının. 2. Biyobanka yazılımı Tüm biyolojik numuneleri izlemek için laboratuvar bilgi yönetim sistemi (LIMS) yazılımını kullanın. Hasta kaydında kişisel ve klinik bilgileri otomatik olarak alan ve Şekil 2’de gösterildiği gibi tıbbi kayıtlar, idari vakalar, RPA ve hasta patolojik verileriyle entegre edilebilen iyi bir işletim sisteminin kullanılabilirliğini sağlayın. Biyobanka yazılımını kullanarak biyolojik örneklerin kaydedilmesini sağlayın.Kodları kullanarak hastaları tanımlayın. Her bireye, tıbbi kayıt numarasıyla (bireysel ziyaret, hastanın hizmet türü) eşleşen benzersiz bir kod atayın.NOT: Kayıt sırasında, Bilimsel RPA işletim sisteminde elektronik olarak güncelleştirilir. Aliquot kimliği oluşturmaNumunenin kaynaklandığı yılı ve anatomik bölgeyi veya biyoakışkan tipini (Tablo 1) belirtin (Tablo 2) ve numune başına ilerici benzersiz bir sayı ekleyin. İki taraflı organlar için, biyolojik numunenin kökenini sağ veya sol organdan ayırt etmek için sıralı bir sayı ekleyin. Kısaltmayı 1 (sol için) veya 2 (sağ için) iki basamaklı sonek ile atayın.NOT: Örneğin, ayrıntılı bir kimlik “12-B-00100-01” gibi görünür, burada 12 yılı gösterir ve B organ = memeyi gösterir. Her aliquot için bir kimlikle kaydolunİki makro biyolojik numune türünü izleyin: katılar ve sıvılar. Alt kategorilere ayırın: taze numuneler ve dondurulmuş numuneler. Şekil 2: Biobank LIMS’in temsili arayüzü. Bilimsel RPA, klinik kayıt sunucusundan elektronik olarak güncellenir. Kısaltmalar: LIMS = laboratuvar bilgi yönetim sistemi; RPA = Araştırma Katılım Anlaşması. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Tablo 1: Biyoakışkan tipleri ve ilgili kodlar. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız. Tablo 2: Doku numune tipleri ve ilgili kodlar. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız. 3. Örnek toplama Günlük ameliyat planı hazırlamaHastanın RPA’yı imzalayıp imzalamadığını ve uygun olup olmadığını belirleyin. Aşağıdaki koşulları kontrol edin:Hastanın dahil etme kriterlerine uygunluğunu doğrulayın: Biyolojik örneklerin toplanmasını önlemek için uygun enfektif risk “RI” alanında herhangi bir pozitif HIV, HBV, HCV ve COVID-19 vakasını bildirin. Her hasta profilindeki Çalışma/Proje alanını doğru bir şekilde tamamlayarak hastanın bir klinik araştırmaya mı yoksa belirli bir onaylanmış araştırma projesine mi kayıtlı olduğunu doğrulayın. Enfeksiyon riski bilinmiyorsa teknisyenleri bilgilendirin; olumlu sonuçları veya bilinmeyen riskleri olan örnekleri atın. Örnekleri Şekil 3’te gösterildiği gibi biyobankada işleyin ve saklayın.Ameliyat olan hastalarla ilgili taze ve dondurulmuş doku örnekleri toplayın. Cerrahi olarak çıkarılan küçük lezyonlar için aspiratif veya esfoliyatif tekniklerle sitolojik örnekler toplayın. Hastaneye yatış öncesi aşamadaki hastaların, klinik çalışmalara kayıtlı hastaların ve onaylanmış tarama projelerinde yer alan diğer kişilerin biyolojik sıvılarını (örneğin, kan, serum, plazma, PBMC, bukkal sürüntü, idrar, dışkı ve asit) toplayın. Şekil 3: Örnek hiyerarşi. Tek bir hastadan, birkaç bölüm alt kategorisi işlenir ve biyobankada saklanır. Kısaltmalar: PMBC’ler = periferik kan mononükleer hücreleri; LIMS = laboratuvar bilgi yönetim sistemi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. 4. Kan örneği toplama Hastanın kanını antikoagülan Na 2 EDTA (7.2 mg, spreyle kurutulmuş) içeren 6 mL vakumlayıcılarda toplayın. Tıbbi kayıt numarası ve bölüm kodu ile etiketlenmiş vakumlayıcıları kaydedin ve bunları iki farklı şekilde işleyin: taze veya dondurulmuş. Taze örnekler için, kan örneklerini biyobanka yazılımına kaydedin. Vakumlayıcıları biyobanka kimlik kodu ile etiketleyin ve yetkili kullanıcılara teslim edin. Biyobankta depolanan dondurulmuş örnekler için, her biri 900 μL kan içeren iki Cryobank 2D kodlu tüp hazırlayın (Şekil 4). Alikotları biyobanka yazılımına kaydedin, belirli bir barkod plakasına yerleştirin ve sabit bir sıcaklık sağlamak için dondurucularda (-80 ° C) saklayın. Şekil 4: Dondurulmuş numune malzemeleri . (A) 2D barkod tüpleri, (B) tek tüp için barkod okuyucu ve (C) kayıt ve depolama için tüplerin plakası. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. 5. Serum numunesi toplama Pıhtılaşmayı indüklemek için sprey kaplı silika içeren 6 mL vakumlayıcı “plastik serum tüpleri” içinde hastanın kanını toplayın. Pıhtılaşmayı indüklemek için vakumlayıcıları oda sıcaklığında (RT) 3 saat bekletin ve ardından 20 ° C’de 10 dakika boyunca 828 x g’de santrifüj yapın. Serumu (450 μL) 0,5 mL Cryobank 2D kodlu tüplerde saklayın ve her numune için toplam 3-4 alikot alın. Son alikotun serum hacmi 450 μL’den azsa, dondurulmuş doğru serum miktarını izlemek için kayıt sırasında “LEFTOVER” olarak belirtin. Alikotları biyobanka yazılımına kaydedin, belirli bir barkod plakasına yerleştirin ve sabit bir sıcaklık sağlamak için dondurucularda (-80 ° C) saklayın.NOT: Alikot sayısı, alınan ilk tam kan miktarına ve elde edilen serum miktarına bağlıdır. 6. Periferik kan mononükleer hücre izolasyonu Laminer davlumbaz açın ve% 70 etanol ile temizleyin. Torbayı biyolojik atıklar, steril 1x fosfat tamponlu salin (PBS) ve bir adet boş steril 50 mL konik tüp için hazırlayın. Kanı (EDTA toplama tüplerinden) boş steril 50 mL konik tüpe dökün ve steril 1x PBS (örneğin, 15 mL kan + 15 mL 1x PBS) kullanarak 1: 1 seyreltin. Kan tüpünü durulamak için PBS’yi kullanın. Tüpleri 20 ° C’de 30 dakika boyunca 400 x g’da santrifüj edin ve tüpleri biyolojik tehlike başlığı altında işleyin. PBMC’leri içeren orta beyaz tabakayı bir Pasteur pipet kullanarak geri kazanın ve yeni steril 50 mL konik tüpe yerleştirin. PBMC’leri yıkamak için 45 mL’ye kadar PBS ekleyin, 400 x g’de karıştırın ve santrifüjü 4 °C’de 10 dakika boyunca karıştırın. Pelet’i geri kazanın, PBS’de yeniden askıya alın ve tek kullanımlık Burker odalarını kullanarak hücreleri sayın.NOT: PBS’nin hacmi pelet üzerine bağlıdır. 15 mL kandan, 2-3 mL’lik bir yeniden süspansiyon hacmi ve daha sonra saymak için 1:10’luk bir seyreltme sağlayın. Denklemi (1) kullanın:3 karelik ortalama 10.000 × seyreltme faktörü × mL resüspansiyon hacmi = toplam hücre sayısı × (1) PBMC’leri PBS ile tekrar yıkayın, 4 ° C’de 10 dakika boyunca 400 x g’de karıştırın ve santrifüj yapın. PBMC’leri dondurucu ortamda 2-3 x 106 hücre / mL’de seyreltin (fetal sığır serumu (FBS) +% 10 dimetil sülfoksit [DMSO]). Her kriyotüpe 1 mL resuspended hücre aktararak Cryobank 2D kodlu tüpler hazırlayın, bunları belirli bir kriyo kutusuna yerleştirin ve mümkün olan en kısa sürede -80 ° C’de saklayın.NOT: Dondurucu ortam, steril% 10 DMSO’lu FBS’den oluşur ve 6 aya kadar -20 ° C’de alikotlarda saklanır. 4 °C’de yavaşça çözüldükten sonra, 2 hafta içinde kullanılmalıdır. 7. Plazma numunesi toplama Hastanın kanını antikoagülan Na 2 EDTA (7.2 mg, spreyle kurutulmuş) içeren 6 mL vakumlayıcılarda toplayın. Plazmayı ayırmak için 2.000 x g’de tam kan içeren vakumlayıcıyı 4 ° C’de 10 dakika boyunca santrifüj edin. 3 mL Pasteur pipet kullanarak plazmanın üst tabakasını çıkarın, steril 15 mL konik steril tüpe aktarın ve kirletici kan hücrelerini ortadan kaldırmak için 4 °C’de 10 dakika boyunca 16.000 x g’de santrifüj yapın. Plazmayı 1 mL Cryobank 2D kodlu tüplere aktarın. Alikotları biyobanka yazılımına kaydedin, belirli bir barkod plakasına yerleştirin ve sabit bir sıcaklık sağlamak için bir dondurucuda (-80 ° C) saklayın. 8. Dışkı ve bukkal sürüntü numunesi toplama Aşağıdaki spesifik çözeltiyi içeren 15 mL tüplerde dışkı ve bukkal çubukları toplayın: 50 mM Tris-HCl, 10 mM NaCl ve 10 mM EDTA, pH 7.5. Tüpleri biyobanka yazılımına kaydedin. Tüpleri biyobanka kodlarıyla etiketleyin. Dışkı ve bukkal çubukları biyobank buzdolabında 4 ° C’de saklayın. 9. Doku işleme Teşhis prosedürleri için gerekli olmayan materyalin araştırma amaçları için yeterli olup olmadığını belirlemek için doku örneklerini bir patolog tarafından muayene ettirin.NOT: Doku hacmi 1,5mm3’ten az olduğunda, ya OCT’de saklanır ya da belirli bir araştırma talebine bağlı taze bir örnek (A) olarak sağlanır. Mümkün olduğunda, patolojik dokunun (P) patolojik olmayan karşılığını (NP) bile toplayın. Numuneleri P ve NP olarak etiketlenmiş steril hücre kültürü Petri kaplarına yerleştirin (Şekil 5). Dokuyu buz üzerinde 4 ° C’de tutun ve yeterli malzeme varsa her biri üç parçaya (A, B ve C) bölün.Taze doku örnekleri (A): P ve NP dokusunun taze alikotlarını, her bir spesifik protokolde tanımlanan uygun kültür ortamına sahip tüplere yerleştirin ve bunları harici araştırma birimlerine (örneğin, araştırma laboratuvarları) gönderin. OCT doku örnekleri (B): Kriyomoldlara taze P ve NP doku alikotları yerleştirin, OCT reçinesi (% 10.24 polivinil alkol,% 4.26 polietilen glikol ve% 85.5 reaktif olmayan bileşenler) ile doldurun ve hemen -80 ° C’de bir flaş dondurma aparatına yerleştirin.NOT: −80 °C’de, OCT’ye gömülü dokunun donması 60-150 s sürer. Doku örnekleri (C): Kalan doku örneklerini flaş dondurma aparatındaki Cryobank 2D kodlu tüplere yerleştirin. Plakaları -80 °C’de saklayın.NOT: Her dondurulmuş OCT aliquot için, bölüm 11’de açıklandığı gibi, dağıtımdan ve histolojik bir değerlendirmeye sahip olmak için kullanımından önce bir kalite kontrol testi gerçekleştirin. Şekil 5: Doku örnekleri için biyobanka iş akışı. Kısaltmalar: LIMS = laboratuvar bilgi yönetim sistemi; OCT = optimum kesme sıcaklığı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. 10. Doku dondurma Bir flaş dondurma aparatı kullanarak dokuyu isopentan buharlarında hızlı bir şekilde dondurun. Doku örneklerini 3 dakika boyunca -120 ° C’de isopentan içine koyun ve -80 ° C’de kriyoprezervasyon odalarında saklayın.NOT: Nükleik asitlerin bütünlüğünü korumak için flaş dondurma kullanarak tümör ve sağlıklı doku örneklerini dondurmak için iki metodoloji kullanılır. 11. Doku kalite kontrolü Kriyostat cihazını soğutulmuş bir kapta -20 ° C ile -40 ° C arasındaki bir sıcaklıkta saklayın ve OCT blok17’den birkaç kriyoseksiyon kesin. Kriyoseksiyon18 numaralı doku üzerinde hematoksilin ve eozin (H&E) boyama işlemini gerçekleştirin. Optik mikroskop altında dokunun morfolojisini analiz edin19.NOT: Kesitler 3-12 μm arasında uygun bir kalınlığa sahiptir.Belirli bir formu doldurun (Tablo 3). Tablo 3: OCT-gömülü ve dondurulmuş doku kesitlerinin kalite kontrol formu. Kısaltma: OCT = optimum kesme sıcaklığı. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız. 12. Araştırma amacıyla örneklerin talep edilmesi ve alınması İstek saklanan aliquots:Araştırma projesi adı, baş araştırmacı (PI), teslim alma tarihi ve kısa bir açıklama içeren tamamlanmış bir form edinin. Yazılım veritabanında (DB) bir sorgu çalıştırın, aliquot’u seçin, teknisyenler için bir alım listesi oluşturun ve alınan her aliquot için barkodu kontrol edin.NOT: Biyobankadan numune almak için, enstitümüzden araştırmacılar veya harici işbirlikçiler (kar amacı gütmeyen veya kar amacı gütmeyen) belirli bir form kullanarak başvurmalıdır ve proje teknik-bilimsel bir komite ve Etik Kurul tarafından değerlendirilir.

Representative Results

Yukarıda açıklanan SÇP’leri takiben, Nisan 2012’den Aralık 2021’e kadar toplam 38.446 açıklamalı biyolojik sıvı biyopsi ve toplam 10.205 doku örneği topladık (Şekil 6A). Ek olarak, Üroloji, Jinekoloji, Senoloji Bölümlerinin yanı sıra Baş ve Boyun, Abdominal-Pelvik ve Göğüs Cerrahisi Bölümlerinden toplanan örnekleri ayrıntılı olarak analiz ettik. Topladığımız en fazla doku örneği meme tümörlerindendi (Şekil 6B,C). 2019’dan bu yana, yıllar içinde önemli ölçüde artan talebi takiben, idrar, dışkı ve bukkal çubuklar gibi diğer biyolojik örnekleri de toplamaya başladık (Şekil 6D). Şekil 6A’da gösterildiği gibi, 2020-2021 döneminde toplanan örneklerin, özellikle dokuların miktarı, COVID-19 pandemisi ve buna bağlı olarak onkolojik prosedürlerdeki azalma nedeniyle zarar görmüştür. Daha da önemlisi, önceki yıllarda toplanan uygun şekilde depolanmış ve açıklamalı biyobanka örneklerinin kullanımı nedeniyle bilimsel çalışmalar bu dönemde azalmamıştır. Biyolojik örneklerin ve ilişkili klinikopatolojik verilerin uygun şekilde toplanması, iyi yapılandırılmış ve rekabetçi bir retrospektif ve prospektif biyobankaya sahip olmamızı sağlamıştır. Bu amaçla, cerrahi numunenin seçimi, hem doğru tanıyı sağlamak hem de uygun doku örnekleri ile araştırma yapma fırsatına sahip olmak için patolog tarafından yapılmalıdır. Biyobankamızda, belirli çalışma prosedürleri sıkı bir şekilde belirlenmiş ve takip edilmiştir, böylece araştırma için biyobankalar bağlamında ISO 9001 sertifikasına uygun standartlaştırılmış prosedürler uygularız. Şekil 6: 2012’den 2021’e kadar Avrupa Onkoloji Enstitüsü’nde biyoörneklerin biyobanka kümülatif koleksiyonu. (A) doku örneklerinin (turuncu eğri) ve kanın serum örnekleri (mavi eğri) ile kümülatif toplanması; (B) meme dokusu örneklerinin kümülatif toplanması (kırmızı eğri); (C) yumurtalık dokusu örneklerinin (yeşil eğri), prostatın (gri eğri), akciğerin (açık mavi eğri) ve kolon dokusu örneklerinin (sarı eğri) kümülatif toplanması. 2019’dan 2021’e kadar, (D) ek biyolojik örneklerin kümülatif koleksiyonu: dışkı (mavi çizgi), bukkal çubuk (pembe çizgi), plazma (açık yeşil çizgi) ve idrar (menekşe çizgisi). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

Onkoloji çok büyük ilerlemeler kaydetmiş olsa da, kanser dünya çapında önde gelen bir morbidite ve mortalite nedeni olmaya devam etmektedir²⁰. Tümör heterojenliğini, zaman içindeki zamansal evrimini ve hedefe yönelik tedavinin sonuçlarını anlamak, rutin klinik bakım bağlamında doğru veri toplanmasına kesinlikle bağlıdır²¹. Bu bakımdan onkolojik prediktif patolojide “multiomik” yaklaşım ivme kazanmaktadır²². Geleneksel doku bazlı biyobelirteç değerlendirmesi, kan, plazma, idrar, tükürük ve dışkı^23,24,25,26 gibi çoklu yeni biyoanalitler kullanılarak entegre edilmektedir. Bu nedenle, biyobankalar artık klinik uygulamaları geliştirmek için çok önemli altyapılar olarak kabul edilmektedir. Kanser araştırmalarının tarihine baktığımızda, en etkileyici ve çığır açan keşiflerin, kanser dokusunun veya sıvı biyopsilerin doğrudan incelenmesi olmadan asla mümkün olamayacağını anlıyoruz. Zamanla, kanser dokusunun kaynağı ve incelenecek sıvı biyopsi türü, ham diseksiyonlardan, rastgele “şans eseri karşılaşmalardan” ve bazı durumlarda yasadışı kaçakçılıktan organize kanser koleksiyonlarına ve stratejik modern onkoloji bankalarına dönüşmüştür. Birçok etik konunun dikkate alınması hem pratikte hem de modern onkoloji bankalarını geçmişin onkoloji koleksiyonlarından ayıran temel faktörlerde önemli ölçüde değişmiştir.

Kanser araştırmalarındaki ilerlemeler ve günümüzde modern teknolojiler tarafından sağlanan çok miktarda moleküler bilgi nedeniyle, biyobankaların, özellikle de kanser merkezlerindekilerin, çeşitli metodolojik sorunlarla karşı karşıya kalabileceği giderek daha belirgin hale gelmektedir. Bunlar arasında teknoloji, SÇP standardizasyonunu ve uyumunu hala engelleyen evrensel bir zorluk haline gelmiştir. Temel biyobanka faaliyetlerini sürdürmenin bir diğer kritik yönü, tüm hastane kimliklerini ve hastanenin yazılımından gelen tüm kodlanmış klinik verileri alabilen ve otomatik olarak koruyabilen entegre bir LIMS yazılımına sahip olmaktır. Biyobankaları yönetmek için kullanılan diğer değerli yazılımların ve bazı ücretsiz yazılımların biyobanka yönetimi için 27,28,29,30,31 elde edilebilmesi dikkat çekicidir. Biyobankalardaki bir diğer kritik adım, tüm hastalar için katılım paktının uygulanması ve klinik verilerin ve biyoörneklerin depolanması için gerekli yasal ve etik anlaşmadır^10,32.

Bu bağlamda, bu protokol, rıza olmadan biyoörneklerin toplanmasına ve depolanmasına izin vermeyen iyi tanımlanmış kılavuzlara sahiptir. Bu aynı zamanda kritik bir konudur, çünkü hastalar numuneleri saklandıktan sonra bile katılımlarını geri çekebilirler; Böylece, bu tür örnekleri biyobankacılık sisteminden hızla çıkarmak için yöntemler uygulanmıştır. Biyobankamız tarafından işe alınan hastalardan gelen biyoörnekler, toplama ve depolama için katı protokoller izler. Bu bağlamda, bu süreci izlemek için birkaç önemli husus değerlendirilmiş ve sürekli olarak geliştirilmektedir. Özellikle, ISO9001 sertifikası, dokunun kaynağına bağlı olarak 30 dakika veya 60 dakikanın altında tutulması gereken sıcak iskemik zaman gibi çeşitli performans göstergeleri gerektirir. Ek olarak, sıvı biyopsiler ve biyolojik sıvılar, sıkı zaman prosedürleri 15,33,34,35,36 uyarınca standartlaştırılmış protokoller kullanılarak toplanır.

Biyobankaların iş akışlarında belirli özellikler büyük önem taşımaktadır. Bunlar, tanısal nedenlerle dokunun örneklenmesini garanti eden sertifikalı bir patologun varlığını ve yüksek kaliteli numunelerle uyumlu bir zaman diliminde biyobankacılık için doku toplanmasını içerir (iskemik zaman, daha az sıcak iskemik zaman gerektiren RNA’ya bağımlı tahliller gibi bazı araştırma türleri için önemli bir göstergedir). Ayrıca, biyobankalarda numune depolama için gerekli alanın yönetilmesi büyük önem taşımaktadır. Toplanan sıvı biyopsilerin sayısı, çalışma tasarımı tarafından yönlendirilebilir. Sıvı biyopsiler, her çalışma tasarımında tanımlandığı gibi, hem preoperatif hem de takip döneminde sıklıkla toplanabilir.

Kanser önleme ve tümörlerin erken teşhisi için tarama kampanyaları sayesinde, yani gelişimin erken aşamalarında küçük boyutlu meme tümörleri ve minimal invaziv cerrahi tekniklerin mevcudiyeti, araştırma için mevcut doku örneklerinin sayısını azaltmıştır (çoğu doku örneği her zaman teşhis amacıyla kullanıldığından). Biyolojik örnekleri toplama ve depolama kapasitesi son birkaç yılda önemli ölçüde artmıştır. Bu, biyolojik sıvılar için gözlemlenebilir ve bu biyobankanın, bu enstitünün araştırma gruplarını hasta kaynaklı açıklamalı materyale olan artan talepte desteklemek için artan kapasitesini yansıtmaktadır. Bu gelişmelere rağmen, dünyanın farklı yerlerinden biyobankalar arasında koordinasyon gerektiren ve ancak benzer prosedürlerin uygulanmasıyla entegre edilebilen çok merkezli çalışmalar için bazı sınırlamalar yaşadık.

Tüm klinik ve demografik bilgilerin toplanması da dahil olmak üzere biyobankacılıkla ilgili etik ve teknik konuların çoğunu dışladıktan sonra, bir sonraki hedef, tanı ve araştırma amacıyla kullanılan tüm histolojik preparatların ve boyamanın dijitalleştirilmesini uygulamaktır. Bu, geleceğin standardı haline gelecek olan tamamen entegre bir dijital patoloji ve biyobankadan büyük ölçüde yararlanacak yeni nesil çalışmalar için temel öneme sahiptir. Entegre veri ve dijital görüntülere sahip çok sayıda hasta, kanser hastası bakımının iyileştirilmesi için çok merkezli, büyük yapay zeka (AI) çalışmalarını tetikleyebilir. Sonuç olarak, iyi sağlık hizmetlerinin tanı ve tedavi ile bitmediğine inanıyoruz. En iyi uygulamalar, herhangi bir hastalık için, özellikle de yaşam beklentisini veya kalitesini ciddi şekilde etkileyenler için sürekli tanı ve tedavi iyileştirme yollarını bulmayı içerir.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Yazarlar, son on yılda araştırma programlarımıza biyoörneklerinin bağışı yoluyla aktif olarak katılan tüm hastalara teşekkür eder. Onlar olmadan, bu araştırma mümkün olmazdı. IEO’da çalışan tüm personele, hemşirelere, teknisyenlere, biyologlara, doktorlara ve tüm klinik ve araştırma birimlerinin yöneticilerine de minnettarız. Yazarlar, Prof. Pier Paolo Di Fiore ve Prof. Giancarlo Pruneri’ye rehberlikleri için minnettardır. Son olarak, bu çalışmayı IEO’nun kurucusu Prof. Umberto Veronesi’ye ve kanser araştırmalarını ve hasta bakımını entegre etme konusundaki öncü yaklaşımına ithaf ediyoruz.

Materials

Blue Max Con Tubes 15 mL	Falcon B.D	352096
Blue Max Con Tubes 50 mL	Euroclone Spa	FLC352070
Box with 81 position for tissue storage	Ettore Pasquali Srl.	06.0945.00
cf-DNA/cf-RNA Preservative Tubes	Norgen Biotek	63950	Preservation and isolation of both cf-DNA and cf-RNA from a single tube and in particular preserve cf-DNA/ct-DNA for 30 days at ambient temperature and for up to 8 days at 37 °C
Cryomold Standard (25 X 20 X 5 mm)	Olympus Italia S.r.l.	4557	Disposable plastic Cryomold molds create a uniformly shaped, flat-surface specimen block when used with O.C.T
Dimethyl Sulfoxide Plastic Bottle – 1 L	Vwr International S.R.L.	MFCD00002089	It acts to preserve the reconstitution of the medium for the storage of frozen cells
Dpbs 1x W/o Ca And Mg – 500 mL	Microtech Srl	TL1006-500ML	Washing Buffer cell
Dualfilter T.I.P.S 1,000 µL	Euroclone Spa	4809
Dualfilter T.I.P.S 200 µL	Euroclone Spa	4823
Easytrack Barcode Reader for single tube datamatrix	Twin Helix Srl	TH-ETR4400	2D barcode tubes reader with USB connection
Fetal Bovine Serum Origin Brazileu S/fil	Microtech S.R.L	RM10532-500ML	Defrost at +4 °C, usually for two days, and once melted, start decomplementation at 56 °C for 45 min Let it cool down to room temperature, and aliquot it. Refroze them to -20 °C, and remember to defrost them every time the aliquots are needed
Ficoll Paque Plus (ge) 6 x 500 mL	Euroclone Spa	GEH17144003	Ficoll is a medium for density gradient, It is sterile and ready for use. It alloes to get peripheral blood mononuclear cells, bone marrow and umbilical cord blood
Fixing solution Killik of 100 mL (OCT)	Bio-optica Milano S.p.a.	05-9801	Gel inclusion medium that solidifies at cold the water-soluble tissue (e.g., biopsies, frustules)
FLASH-FREEZE	Milestone	n.a.	Freezing appliance
Forma 8600 Series Chest Freezers (Temperature Range: -50 °C to -86 °C) 85 liters	Thermo Fisher Scientific Srl	803CV	Orizzontal freezer
Isopentane 500 mL	Vwr International S.R.L.	24872260	Liquid included in theFLASH-FREEZE camera for freezing
Nautilus Lims Software	Thermo Scientific™	n.a.	The software implementation is able to track all patients’ biological samples. Receives Personal and Clinical information automatically during registration due to the integration with IEO operating systems. Nautilus is integrated with the web service through three IEO operative systems: BAC – IEO central registry with personal information, wHospital – medical record
Pasteur pipette 10 mL	Euroclone Spa	CC4488
Pasteur pipette 3 mL	Euroclone Spa	APT1502
PATHOX	Dedalus ItaliTesi Elettronica e Sistemi Informativi S.p.A.a S.p.A.	n.a.	PATHOX – management system for the Pathology unit where several factors are registered for the Biobank, such as the histological samples, the related diagnoses, and biomarkers
Petri dishes, polystyrene – size 100 mm x 20 mm, slippable	Euroclone Spa	FLC353003
Set of 4 adapters 19 x 5/7 mL vac	Thermo Fisher Scientific Srl	75003680
Set of 4 adapters 4 x 50 conical	Thermo Fisher Scientific Srl	75003683
Set of 4 adapters 9 x 15 mL conical	Thermo Fisher Scientific Srl	75003682
Single-use slide for counting cell	Biosigma S.P.A.	347143/001	Specifically used for individual cell count
Stamps Freezerbondz for tissue boxes, nitrogen-liquid proof , H 9,53 mm x L 25,40 mm	Twin Helix Srl	THT-152-492-3
Thermo Scientific TSX Series Ultra-Low Freezers (-50 °C to -86 °C) 949 liters	Thermo Fisher Scientific Srl	TSX70086V	Vertical freezer
Thermo Scientific Refrigerated Centrifuge SL16R	Thermo Fisher Scientific Srl	75004030
Tissue box labels in Permanent	Twin Helix Srl	THT-199-482-3
Tuerks Solution	Merck Life Science S.R.L.	1092770100	In light microscopy, it is specifically used as stain for leukocyte
TX-400 Rotor TX-400 swinging bucket hol	Thermo Fisher Scientific Srl	75003181
White box for storage	Bio Optica	07-7300
wHospital Software	wHealth Lutech Group	n.a.	wHospital – medical record management system with personal information, administrative cases, and the informed consent of the patients

References

Pagni, F., et al. Targeting immune-related biological processes in solid tumors: We do need biomarkers. International Journal of Molecular Sciences. 20 (21), 5452 (2019).
Braun, K. L., et al. Cancer patient perceptions about biobanking and preferred timing of consent. Biopreservation and Biobanking. 12 (2), 106-112 (2014).
Bycroft, C., et al. The UK Biobank resource with deep phenotyping and genomic data. Nature. 562 (7726), 203-209 (2018).
Saifuddin, S. R., et al. King’s Health Partners’ Prostate Cancer Biobank (KHP PCaBB). BMC Cancer. 17 (1), 784 (2017).
Lopez, G., et al. Molecular insights into the classification of luminal breast cancers: The genomic heterogeneity of progesterone-negative tumors. International Journal of Molecular Sciences. 20 (3), 510 (2019).
Kinkorová, J. Biobanks in the era of personalized medicine: Objectives, challenges, and innovation: Overview. The EPMA Journal. 7 (1), 4 (2015).
Luo, J., et al. Intravital biobank and personalized cancer therapy: The correlation with omics. International Journal of Cancer. 135 (7), 1511-1516 (2014).
Invernizzi, M., et al. Quality of life interventions in breast cancer survivors: State of the art in targeted rehabilitation strategies. Anticancer Agents in Medicinal Chemistry. 22 (4), 801-810 (2021).
Roux, J., Zeghidi, M., Villar, S., Kozlakidis, Z. Biosafety and biobanking: Current understanding and knowledge gaps. Biosafety and Health. 3 (5), 244-248 (2021).
Sanchini, V., et al. A trust-based pact in research biobanks. From theory to practice. Bioethics. 30 (4), 260-271 (2016).
Vaught, J., Kelly, A., Hewitt, R. A review of international biobanks and networks: Success factors and key benchmarks. Biopreservation and Biobanking. 7 (3), 143-150 (2009).
Ferrin, I., et al. Isolation, culture, and expansion of mesenchymal stem cells. Methods in Molecular Biology. 1590, 177-190 (2017).
Hermansen, J. U., et al. The Norwegian childhood cancer biobank. Cancer Reports. , 1555 (2021).
Schmelz, M., et al. A plan for emergency shutdown and reopening for a consortium of biobanks. Biopreservation and Biobanking. 19 (5), 394-398 (2021).
Salvaterra, E., Corfield, J. . Advances in Biobanking Practice Through Public and Private Collaborations. , (2017).
Snapes, E., Simeon-Dubach, D. ISBER best practices for repositories, moving toward the fifth edition. Biopreservation and Biobanking. 20 (1), 107-108 (2022).
Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Cryosectioning tissues. Cold Spring Harbour Protocols. (8), 4991 (2008).
Staining methods in frozen section: Best lab practices. Laboratory Best Practice Blog. UC Davis Health Available from: https://health.ucdavis.edu/blog/lab-best-practice/staining-methods-in-frozen-section-best-lab-practices/2020/03 (2020)
Craciun, L., et al. Tumor banks: A quality control scheme proposal. Frontiers in Medicine. 6, 225 (2019).
Ma, X., Yu, H. Global burden of cancer. The Yale Journal of Biology and Medicine. 79 (3-4), 85-94 (2006).
Angerilli, V., et al. The role of the pathologist in the next-generation era of tumor molecular characterization. Diagnostics. 11 (2), 339 (2021).
Correa-Aguila, R., Alonso-Pupo, N., Hernández-Rodríguez, E. W. Multi-omics data integration approaches for precision oncology. Molecular Omics. , (2022).
Salati, M., et al. ctDNA analysis in the personalized clinical management of gastroesophageal adenocarcinoma: Turning hope into reality. Future Oncology. 17 (33), 4607-4618 (2021).
Mirzayi, C., et al. Reporting guidelines for human microbiome research: The STORMS checklist. Nature Medicine. 27 (11), 1885-1892 (2021).
Cortvrindt, C., Speeckaert, R., Delanghe, J. R., Speeckaert, M. M. Urinary epidermal growth factor: A promising "next generation" biomarker in kidney disease. American Journal of Nephrology. , (2022).
Fusco, N., Fumagalli, C., Guerini-Rocco, E. Looking for sputum biomarkers in lung cancer secondary prevention: Where are we now. Journal of Thoracic Disease. 9 (11), 4277-4279 (2017).
Im, K., Gui, D., Yong, W. H. An introduction to hardware, software, and other information technology needs of biomedical biobanks. Methods in Molecular Biology. 1897, 17-29 (2019).
Paul, S., Gade, A., Mallipeddi, S. The state of cloud-based biospecimen and biobank data management tools. Biopreservation and Biobanking. 15 (2), 169-172 (2017).
Fthenou, E., et al. implementation, and integration of heterogenous information technology infrastructures in the Qatar biobank. Biopreservation and Biobanking. 17 (6), 494-505 (2019).
Tukacs, E., et al. Model requirements for Biobank Software Systems. Bioinformation. 8 (6), 290-292 (2012).
Willers, C., et al. A versatile, secure, and sustainable all-in-one biobank-registry data solution: The A3BC REDCap model. Biopreservation and Biobanking. , (2021).
D’Abramo, F., Schildmann, J., Vollmann, J. Research participants’ perceptions and views on consent for biobank research: A review of empirical data and ethical analysis. BMC Medical Ethics. 16, 60 (2015).
Policiuc, L., et al. The foundation of personalized medicine is the establishment of biobanks and their standardization. Journal of BUON. 23 (3), 550-560 (2018).
Lygirou, V., Makridakis, M., Vlahou, A. Biological sample collection for clinical proteomics: Existing SOPs. Methods in Molecular Biology. 1243, 3-27 (2015).
Pisapia, P., Malapelle, U., Troncone, G. Liquid biopsy and lung cancer. Acta Cytologica. 63 (6), 489-496 (2019).
Spruessel, A., et al. Tissue ischemia time affects gene and protein expression patterns within minutes following surgical tumor excision. Biotechniques. 36 (6), 1030-1037 (2004).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite This Article

Bonizzi, G., Capra, M., Cassi, C., Taliento, G., Pala, O., Sajjadi, E., Venetis, K., Ivanova, M., Monturano, M., Renne, G., Zattoni, L., Guerini-Rocco, E., Viale, G., Orecchia, R., Fusco, N. Biobank for Translational Medicine: Standard Operating Procedures for Optimal Sample Management. J. Vis. Exp. (189), e63950, doi:10.3791/63950 (2022).

Automatically Generated