Biobank voor translationele geneeskunde: standaard operationele procedures voor optimaal monsterbeheer

Dit protocol richt zich op de SOP’s die worden gebruikt voor borst-, eierstok-, prostaat-, long- en darmkanker. Alle hier beschreven procedures zijn goedgekeurd door de Scientific Technical Committee, Ethics Committee (EC) en de directeuren van borst-, gynaecologie-, urologie-, thoracale chirurgie- en spijsverteringsstelselchirurgieprogramma’s. De studieprocedures volgen de Verklaring van Helsinki van 1964, de Algemene Verordening Gegevensbescherming (AVG) van 2018 en de daaropvolgende wijzigingen. Een institutionele onderzoeksparticipatieovereenkomst (RPA), afgeleid van de GDPR-wet, vertegenwoordigt de geïnformeerde toestemming van alle patiënten om biologische monsters en persoonlijke, klinische en genetische gegevens te verzamelen. De RPA werd verkregen van alle patiënten voor opslag, verwerking en gebruik van de verkregen gegevens voor wetenschappelijke doeleinden. 1. Vereisten voor biologische monsters Controleer of een patiënt voldoet aan de voorwaarden voor inschrijving op basis van het RPA- en projectprotocol en geef een gedetailleerde RPA-beschrijving aan alle patiënten.Verhoog de betrokkenheid van patiënten, bijvoorbeeld door een educatieve cartoonvideo uit te zenden in wachtkamers om de patiënten te informeren over het belang en de impact van RPA. Geef gadgetbladwijzers aan alle patiënten (zie de vrij toegankelijke korte cartoonanimatie op https://www.ieo.it/it/PER-I-PAZIENTI/I-diritti-del-paziente/Consensi-informati/ en https://vimeo.com/679070846). Train het personeel om de toestemmingsadministratie uit te voeren tijdens elke ziekenhuisopnamefase en geef aanvullende informatie als de patiënten deelnemen aan een specifiek onderzoek.OPMERKING: Als de RPA niet is ondertekend, worden biologische monsters niet verzameld. Vermijd het opnemen van gevallen die een infectie door SARS-CoV-2 (COVID-19), hepatitis B (HBV), hepatitis C (HCV) en humaan immunodeficiëntievirus (HIV) hebben gepresenteerd. 2. Biobank software Gebruik LIMS-software (Laboratory Information Management System) om alle biologische monsters te volgen. Zorg voor de beschikbaarheid van een goed besturingssysteem dat automatisch persoonlijke en klinische informatie verkrijgt bij de registratie van patiënten en kan worden geïntegreerd met medische dossiers, administratieve zaken, RPA en pathologische gegevens van patiënten, zoals weergegeven in figuur 2. Zorg voor de registratie van de biologische monsters met behulp van de biobanksoftware.Identificeer patiënten met behulp van codes. Wijs een unieke code toe aan elk individu, die overeenkomt met het medische dossiernummer (individueel bezoek, type patiëntservice).OPMERKING: Tijdens de registratie wordt de Wetenschappelijke RPA elektronisch bijgewerkt in het besturingssysteem. Genereer een aliquot-IDVermeld het jaar en de anatomische plaats of het biofluïde type (tabel 1) waaruit het monster afkomstig is (tabel 2) en voeg een progressief uniek getal per monster toe. Voeg voor bilaterale organen een sequentieel getal toe om de oorsprong van het biologische monster te onderscheiden van het rechter- of linkerorgaan. Wijs de afkorting toe met het achtervoegsel 1 (voor links) of 2 (voor rechts) – twee cijfers.OPMERKING: Een gedetailleerde ID ziet er bijvoorbeeld uit als “12-B-00100-01”, waarbij 12 het jaar aangeeft en B het orgaan = borst. Registreer met een ID voor elke aliquotVolg twee macrotypen biologische monsters: vaste stoffen en vloeistoffen. Verdeel in subcategorieën: verse monsters en bevroren monsters. Figuur 2: Een representatieve interface van biobank LIMS. De wetenschappelijke RPA wordt elektronisch bijgewerkt vanaf de klinische dossierserver. Afkortingen: LIMS = laboratoriuminformatiebeheersysteem; RPA = Overeenkomst voor deelname aan onderzoek. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Tabel 1: Biofluïde types en bijbehorende codes. Klik hier om deze tabel te downloaden. Tabel 2: Soorten weefselmonsters en bijbehorende codes. Klik hier om deze tabel te downloaden. 3. Monsterverzameling Dagelijkse voorbereiding van het operatieplanBepaal of de patiënt de RPA heeft ondertekend of niet en of ze in aanmerking komen. Controleer de volgende voorwaarden:Controleer of de patiënt voldoet aan de inclusiecriteria: meld elk positief geval van HIV, HBV, HCV en COVID-19 in het juiste veld voor infectieus risico “RI” om te voorkomen dat biologische monsters worden verzameld. Controleer of de patiënt is ingeschreven voor een klinisch onderzoek of een specifiek goedgekeurd onderzoeksproject door het veld Studie/Project in elk patiëntenprofiel correct in te vullen. Informeer technici als het risico op infectie onbekend is; specimens met positieve resultaten of onbekende risico’s weggooien. Verwerk en bewaar monsters in de biobank, zoals weergegeven in figuur 3.Verzamel verse en bevroren weefselmonsters met betrekking tot patiënten die een operatie hebben ondergaan. Verzamel cytologische monsters, hetzij door aspiratieve of esfoliatieve technieken, voor chirurgisch verwijderde kleine laesies. Verzamel biologische vloeistoffen (bijv. Bloed, serum, plasma, PBMC, buccaal wattenstaafje, urine, uitwerpselen en ascites) van patiënten in de prehospitalisatiefase, patiënten die zijn ingeschreven in klinische onderzoeken en elke andere proefpersoon die betrokken is bij goedgekeurde screeningsprojecten. Figuur 3: Voorbeeldhiërarchie. Van een enkele patiënt worden verschillende subcategorieën van episodes verwerkt en opgeslagen in de biobank. Afkortingen: PMBC’s = perifere bloed mononucleaire cellen; LIMS = laboratoriuminformatiebeheersysteem. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. 4. Bloedafname Verzamel het bloed van de patiënt in 6 ml vacutainers die het antistollingsmiddel Na2 EDTA bevatten (7,2 mg, gesproeidroogd). Registreer de vacutainers gelabeld met het nummer van het medisch dossier en de afleveringscode en verwerk ze op twee verschillende manieren: vers of bevroren. Voor verse monsters registreert u de bloedmonsters in de biobanksoftware. Label de vacutainers met de biobank ID-code en lever ze aan de geautoriseerde gebruikers. Voor bevroren monsters die in de biobank zijn opgeslagen, bereidt u twee Cryobank 2D-gecodeerde buizen voor, elk van 900 μL bloed (figuur 4). Registreer de aliquots in de biobanksoftware, plaats ze op een specifieke barcodeplaat en bewaar ze in diepvriezers (−80 °C) om een constante temperatuur te garanderen. Figuur 4: Bevroren monstermaterialen. (A) 2D-streepjescodebuizen, (B) barcodelezer voor enkele buis en (C) buisplaat voor registratie en opslag. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. 5. Verzameling van serummonsters Verzamel het bloed van de patiënt in 6 ml vacutainer “plastic serumbuizen” met gespoten silica om stolling te induceren. Laat de vacutainers gedurende 3 uur bij kamertemperatuur (RT) staan om stolling te induceren en centrifugeer vervolgens bij 828 x g gedurende 10 minuten bij 20 °C. Bewaar serum (450 μL) in 0,5 ml Cryobank 2D-gecodeerde buizen met een totaal van 3-4 aliquots voor elk monster. Als het serumvolume van de laatste aliquot minder dan 450 μL is, specificeer het dan als “LEFTOVER” tijdens de registratie om de juiste hoeveelheid bevroren serum te volgen. Registreer de aliquots in de biobanksoftware, plaats ze op een specifieke barcodeplaat en bewaar ze in diepvriezers (−80 °C) om een constante temperatuur te garanderen.OPMERKING: Het aantal aliquots hangt af van de initiële hoeveelheid volbloed en de hoeveelheid serum die wordt verkregen. 6. Perifere mononucleaire celisolatie in het bloed Open de laminaire stromingskap en reinig deze met 70% ethanol. Bereid de zak voor biologisch afval, steriele 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) en een lege steriele 50 ml conische buis. Giet het bloed (uit EDTA-verzamelbuizen) in de lege steriele conische buis van 50 ml en verdun het 1: 1 met steriele 1x PBS (bijv. 15 ml bloed + 15 ml 1x PBS). Gebruik de PBS om de bloedbuis te spoelen. Centrifugeer de buizen bij 400 x g gedurende 30 minuten bij 20 °C en verwerk de buizen onder een biohazard kap. Herstel de middelste witte laag met PBMC’s met behulp van een Pasteur-pipet en plaats deze in een nieuwe steriele conische buis van 50 ml. Voeg tot 45 ml PBS toe om de PBMC’s te wassen, meng en centrifugeer op 400 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Herstel de pellet, resuspendeer het in PBS en tel de cellen met behulp van wegwerp Burker-kamers.OPMERKING: Het volume van PBS is afhankelijk van de pellet. Zorg vanaf 15 ml bloed voor een resuspensievolume van 2-3 ml en vervolgens een verdunning van 1:10 om te tellen. Gebruik vergelijking (1):Gemiddelde van 3 vierkanten × 10.000 × verdunningsfactoren × ml resuspensievolume = aantal totale cellen (1) Was de PBMC’s opnieuw met PBS, meng en centrifugeer op 400 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Verdun de PBMC’s op 2-3 x 106 cellen /ml in vriesmedium (foetaal runderserum (FBS) + 10% dimethylsulfoxide [DMSO]). Bereid Cryobank 2D-gecodeerde buizen voor door 1 ml geresuspendeerde cellen in elke cryobuis over te brengen, plaats ze in een specifieke cryobox en bewaar ze zo snel mogelijk bij −80 °C.OPMERKING: Vriesmedium bestaat uit FBS met steriele 10% DMSO en wordt gedurende maximaal 6 maanden bewaard in aliquots bij −20 °C. Eenmaal langzaam ontdooid bij 4 °C, moet het binnen 2 weken worden gebruikt. 7. Verzameling van plasmamonsters Verzamel het bloed van de patiënt in 6 ml vacutainers die het antistollingsmiddel Na2 EDTA bevatten (7,2 mg, gesproeidroogd). Centrifugeer het vacutainer met het volbloed bij 2.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C om het plasma te scheiden. Verwijder de bovenste laag van het plasma met behulp van een Pasteur-pipet van 3 ml, breng over in een steriele conische steriele buis van 15 ml en centrifugeer bij 16.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C om verontreinigende bloedcellen te elimineren. Breng het plasma over in 1 ml Cryobank 2D gecodeerde buizen. Registreer de aliquots in de biobanksoftware, plaats ze op een specifieke barcodeplaat en bewaar ze in een vriezer (−80 °C) om een constante temperatuur te garanderen. 8. Verzameling van ontlasting en buccale swabmonsters Verzamel uitwerpselen en buccale swabs in buizen van 15 ml met de volgende specifieke oplossing: 50 mM Tris-HCl, 10 mM NaCl en 10 mM EDTA, pH 7,5. Registreer de buizen in de biobanksoftware. Label de buizen met de biobankcodes. Bewaar de uitwerpselen en buccale swabs bij 4 °C in de biobankkoelkast. 9. Weefselverwerking Laat weefselmonsters onderzoeken door een patholoog om te bepalen of het materiaal dat niet nodig is voor diagnostische procedures voldoende is voor onderzoeksdoeleinden.OPMERKING: Wanneer het volume weefsel minder dan 1,5 mm3 bedraagt, wordt het ofwel opgeslagen in LGO of verstrekt als een vers monster (A) gekoppeld aan een specifiek onderzoeksverzoek. Verzamel waar mogelijk zelfs de niet-pathologische tegenhanger (NP) van het pathologische weefsel (P). Plaats de monsters in steriele celkweek petrischalen met het label P en NP (figuur 5). Houd het weefsel op het ijs op 4 °C en verdeel het in drie delen (A, B en C) als er voldoende materiaal beschikbaar is.Verse weefselmonsters (A): plaats verse aliquots P- en NP-weefsel in buizen met het juiste kweekmedium dat in elk specifiek protocol is gedefinieerd en stuur ze naar externe onderzoekseenheden (bijv. onderzoekslaboratoria). OCT-weefselmonsters (B): plaats verse aliquots van P – en NP-weefsel in cryomolds, vul ze met OCT-hars (10,24% polyvinylalcohol, 4,26% polyethyleenglycol en 85,5% niet-reactieve ingrediënten) en plaats ze onmiddellijk in een flash-freeze-apparaat bij −80 °C.OPMERKING: Bij −80 °C duurt oct-ingebed weefsel van 60-150 s om te bevriezen. Weefselmonsters (C): plaats de resterende weefselmonsters in Cryobank 2D-gecodeerde buizen in het flash-freeze-apparaat. Bewaar de platen bij −80 °C.OPMERKING: Voer voor elke bevroren LGO-aliquot een kwaliteitscontroletest uit vóór distributie en het gebruik ervan om een histologische evaluatie te hebben, zoals beschreven in rubriek 11. Figuur 5: Biobankworkflow voor weefselmonsters. Afkortingen: LIMS = laboratoriuminformatiebeheersysteem; OCT = optimale snijtemperatuur. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. 10. Invriezen van weefsel Vries weefsel snel in isopentaandampen met behulp van een flash-freeze-apparaat. Doe de weefselmonsters in isopentaan bij −120 °C gedurende 3 min en bewaar ze in de cryopreservatiekamers bij −80 °C.OPMERKING: Twee methodologieën worden gebruikt voor het bevriezen van monsters van tumor en gezond weefsel met behulp van flash freeze om de integriteit van de nucleïnezuren te behouden. 11. Kwaliteitscontrole van het weefsel Huisvest het cryostaatinstrument in een gekoelde container bij een temperatuur tussen −20 °C en −40 °C, en snijd enkele cryosecties uit het OCT-blok17. Voer hematoxyline en eosine (H &E) kleuring uit op het weefsel cryosectie18. Analyseer de morfologie van het weefsel onder een optische microscoop19.OPMERKING: De secties hebben een geschikte dikte van 3-12 μm.Vul een specifiek formulier in (tabel 3). Tabel 3: Vorm van kwaliteitscontrole van oct-embedded en bevroren weefselsecties. Afkorting: OCT = optimale snijtemperatuur. Klik hier om deze tabel te downloaden. 12. Aanvragen en ophalen van specimens voor onderzoeksdoeleinden Verzoek opgeslagen aliquots:Verkrijg een ingevuld formulier met de naam van het onderzoeksproject, hoofdonderzoeker (PI), ophaaldatum en een korte beschrijving. Voer een query uit op de softwaredatabase (DB), selecteer de aliquot, genereer een ophaallijst voor de technici en controleer de streepjescode voor elke opgehaalde aliquot.OPMERKING: Om monsters van de biobank te verkrijgen, moeten onderzoekers van ons instituut of externe medewerkers (for-profit of not-for-profit) een aanvraag indienen met behulp van een specifiek formulier, en het project wordt geëvalueerd door een technisch-wetenschappelijke commissie en de ethische commissie.