Cuantificación de la dinámica del citoesqueleto mediante microscopía dinámica diferencial

Aquí, mostramos ejemplos del análisis realizado con PyDDM a partir de dos conjuntos diferentes de experimentos. En un conjunto de experimentos, las perlas trazadoras submicrométricas se incrustaron en redes que consisten en la proteína de filamento intermedio vimentina y se tomaron imágenes utilizando una lente de objetivo 100x en modo de campo brillante a 100 fotogramas / s (Figura 3A). La vimentina se expresa en células mesenquimales y es un determinante clave de las propiedades mecánicas del citoplasma65 y de la estabilidad mecánica del núcleo en células que realizan migración confinada 66,67. Hasta ahora, las redes de vimentina reconstituidas han sido estudiadas principalmente por reología macroscópica 64,68,69, mientras que la dinámica ha recibido relativamente poca atención 13,70,71. Se pueden encontrar detalles adicionales de estos experimentos en el Archivo Complementario 2. En el otro conjunto de experimentos, se prepararon redes activas de citoesqueletos con actina, microtúbulos y miosina. Las etiquetas fluorescentes espectralmente distintas permitieron que los filamentos de actina y microtúbulos se visualizaran con un microscopio confocal de escaneo láser de dos colores utilizando una lente de objetivo 60x a 2,78 fotogramas/s (Figura 3B, C). Los filamentos de actina y microtúbulos son impulsores importantes de los cambios dinámicos de forma celular, con sus acciones coordinadas por interacciones mecánicas y bioquímicas72. Los detalles adicionales de estos experimentos se pueden encontrar en11. Los fotogramas individuales de las secuencias de imágenes tomadas en estos experimentos se muestran en la Figura 3. Figura 3: Imágenes de las series temporales analizadas. (A) Imagen de campo brillante de perlas de 0,6 μm en una red de vimentina. (B,C) Imagen de los microtúbulos (B) y la actina (C) en un compuesto activo de actina-microtúbulo tomada con un objetivo de 60x en un microscopio confocal de escaneo láser, utilizando luz de excitación de 561 nm para la imagen de microtúbulos y luz de excitación de 488 nm para la imagen de actina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Para imágenes de cuentas trazadoras en redes de vimentina, se grabaron películas de 5000 fotogramas con un tamaño de 512 x 512 píxeles a 100 fotogramas/s. A partir de estos, la matriz DDM se calculó a 60 tiempos de retraso espaciados logarítmicamente entre 1 y 1000 cuadros, o 0,01 s y 10 s. Para estimar el fondo, B, la media de las imágenes transformadas de Fourier al cuadrado, , se calculó y se estableció igual a 55,73. Se asumió que, sobre el mayor 10% de los valores q, esta cantidad es igual a B/2 y que B es independiente de q. Este es el método predeterminado del paquete para estimar B, pero otros métodos son posibles estableciendo el parámetro background_method en un valor diferente. Con los parámetros A(q) y B determinados a partir de , se puede extraer la función de dispersión intermedia (ISF) de la matriz DDM. Los ISF de ejemplo se muestran en la Figura 4. En la Figura 4A, se muestra el ISF a partir de imágenes de perlas de 0,6 μm de diámetro incrustadas en una red con una concentración de vimentina de 19 μM. En la Figura 4B, se muestra el ISF para el mismo tipo de perlas en una red con una concentración de vimentina de 34 μM. Curiosamente, en ninguno de los dos casos la ISF decayó a cero. En grandes tiempos de retraso, el ISF debería acercarse a cero para los sistemas ergódicos. Es decir, en tales sistemas, las fluctuaciones de densidad deben descorrelarse completamente durante grandes tiempos de retraso. El hecho de que el ISF aquí no decayera a cero podría haber sido el resultado de estimaciones inexactas de A (q) y B, que se utilizaron para encontrar el ISF a partir de la matriz DDM calculada. En particular, el método empleado aquí puede sobreestimar B en ciertos escenarios62. Sin embargo, es más probable que la dinámica de las cuentas trazadoras sea verdaderamente no nerviosa, ya que las cuentas tienen un tamaño comparable al tamaño de la malla de la red y, por lo tanto, pueden enjaularse. Otros datos corroboraron el hallazgo de no ser desergodicidad. Es decir, el tamaño de la cuenta, 0,6 μm, fue mayor que el valor medio calculado para los tamaños de malla de 0,4 μm para la concentración de 19 μM y 0,3 μm para la concentración de 34 μM. Además, los resultados del seguimiento de una sola partícula de estas cuentas trazadoras, que se muestran más adelante, también mostraron un movimiento confinado. Figura 4: Funciones de dispersión intermedias en varios números de onda para redes de vimentina. El ISF se traza en función del tiempo de retraso para los valores q de aproximadamente 1 a 9 μm-1. (A) El ISF a partir de imágenes de perlas de 0,6 μm en una red de vimentina con concentración de vimentina de 19 μM. (B) El ISF a partir de imágenes de perlas de 0,6 μm en una red de vimentina con concentración de vimentina de 34 μM. La meseta de tiempo de retraso largo de la ISF a un valor muy por encima de cero indica no nerviosismo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Dado que la dinámica es probablemente no nerviosa, los ISF se ajustan a la forma , donde C es el factor de nonergodicidad 32. Esta forma del ISF se ha utilizado en estudios previos de dinámica no ergódica, como la de geles coloidales32,74 o partículas trazadoras en redes actina-microtúbulos 10. Las líneas negras punteadas de la Figura 4 muestran los ajustes junto con los datos. A partir de estos ajustes, ahora se puede observar la q-dependencia del tiempo de desintegración, τ, y del parámetro de nonergodicidad, C. Figura 5: Tiempo de desintegración vs. número de onda para redes de vimentina. Desde los ajustes hasta el ISF, el tiempo de desintegración τ se determina para un rango de valores q . Para mayor claridad, no estamos mostrando el valor de τ para cada q, sino solo un conjunto espaciado logarítmicamente. En azul (bronceado) se encuentran los datos de imágenes de perlas de 0,6 μm dentro de redes de vimentina con una concentración de vimentina de 19 μM (34 μM). Las barras de error representan las desviaciones estándar en τ en varias películas (cuatro películas para los datos con la red de 19 μM [azul] y cinco películas para los datos con la red de 34 μM [tan]). Las líneas punteadas en guiones rojos marcan los límites estimados para nuestra resolución temporal y espacial, como se describe en los resultados. La línea negra sólida muestra la escala, lo que indicaría un movimiento difusivo. Ninguno de los conjuntos de datos sigue esta escala. Más bien, las cuentas en la red de 19 μM muestran un movimiento subdiffusivo (con β > 2), y las cuentas en la red de 34 μM muestran movimiento confinado o enjaulado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Los tiempos de decaimiento mostraron una gran cantidad de incertidumbre, tanto en los extremos q bajo como q alto, como se ve en la Figura 5. Las barras de error en esta gráfica muestran la desviación estándar entre cuatro videos analizados para el caso de menor concentración de vimentina o cinco videos analizados para la concentración más alta. Para comprender la fuente de la gran incertidumbre en estos extremos, considere tanto la resolución temporal como la espacial. Los límites aproximados de la resolución se muestran con tres líneas rojas punteadas por guiones. Las dos líneas horizontales corresponden a los tiempos de retraso mínimos y máximos sondeados. Dada la velocidad de fotogramas de 100 fotogramas/s y el tiempo máximo de retraso correspondiente a 1000 fotogramas (20% de la duración total del vídeo), se perdió precisión al medir dinámicas que se producen más rápido que 0,01 s o más lento que 10 s. En los valores q más bajos, los valores ajustados para τ fueron mayores de 10 s. Por lo tanto, se deben esperar grandes incertidumbres en tiempos de descomposición que sean mayores que el tiempo de retraso máximo. En el extremo superior del rango q, el tiempo de decaimiento se acercó al tiempo de retraso mínimo de 0.01 s, pero se mantuvo por encima de él. En lugar de estar limitado por la resolución temporal, a estos valores q más altos, la resolución espacial puede ser el factor limitante. Dado el tamaño de píxel de 0,13 μm, el mayor valor para q fue de aproximadamente 24 μm-1. Sin embargo, la resolución limitada por difracción no necesariamente permite mediciones precisas de la dinámica a estas altas frecuencias espaciales. Aproximando la resolución óptica como conduce a un límite de número de onda superior de aproximadamente 16 μm-1, dada la apertura numérica de la lente objetivo, NA, de 1.4 y la longitud de onda de la luz, . Esto está marcado por la línea vertical de puntos de guión rojo en la Figura 5. De hecho, los datos fueron ruidosos a grandes valores de q. Incluso antes de este límite superior aproximado de q, se observó un aumento de la incertidumbre en τ, y esto podría deberse a la sobreestimación de qmax. Una resolución óptica más pobre de lo previsto puede deberse a que se utilizó una lente de inmersión en aceite para obtener imágenes más allá del la cubierta en una muestra acuosa o porque la lente del condensador estaba imperfectamente alineada. Para las perlas de 0,6 μm incrustadas en la red menos concentrada (vimentina de 19 μM), se puede observar a partir de la gráfica logarítmica del tiempo de desintegración frente al número de onda que el tiempo de desintegración disminuyó con el número de onda de una manera consistente con una ley de potencia (Figura 5). Sin embargo, no parece seguir lo que se esperaría para el movimiento difusivo normal, donde . Más bien, τ disminuyó más abruptamente con el aumento de q. Esto es indicativo de movimiento subdiffusivo, que a menudo ocurre para cuentas en entornos abarrotados como estos. La adaptación de τ(q) sobre el rango de 1,4 μm-1 a 12,3 μm-1 a una ley de potencia de la forma τ = 1/Kqβ produce los parámetros de transporte K = 0,0953 μmβ /s y β = 2,2. Para aquellos más acostumbrados a pensar en la difusión normal frente a la subdifusión en términos del desplazamiento cuadrático medio (MSD) de las partículas trazadoras en función del tiempo de retraso (es decir, MSD = K’ Δtα), es útil reconocer que el exponente de escala subdiffusive en la ecuación MSD, α, es equivalente a α = 2 / β. En otras palabras, el valor de β = 2.2 es consistente con un exponente de escala subdiffusive en la ecuación MSD de α = 0.9. Se establecería PyDDM para que se ajuste a τ(q) sobre este rango de valores q especificando los índices de la matriz de q con el parámetro Good_q_range en el archivo YAML o pasando el argumento opcional forced_qs a la función generate_fit_report. El rango de q de 1,4 μm-1 a 12,3 μm-1 correspondería, para los datos aquí, a índices de la matriz de q de 15 a 130. Para las perlas de 0,6 μm en la red más concentrada (34 μM), el tiempo de desintegración mostró poca dependencia de q. Esto probablemente se deba a la no nerviosidad de las cuentas en una red con un tamaño de malla más pequeño. Para sondear la noergodicidad en este sistema, el parámetro de nonergodicidad, C, debe trazarse en función de q, como en la Figura 6. Para las perlas de 0,6 μm en la red de vimentina de 19 μM, C ≈ 0,2 con poca dependencia de q (no se muestra). Sin embargo, para la red con vimentina de 34 μM y para una red con una concentración aún mayor de vimentina de 49 μM, el log de C fue proporcional a q2 como se muestra en la Figura 6. Esta relación entre C y q se espera para el movimiento confinado. Para las cuentas atrapadas dentro de los bolsillos de la red, se espera que el MSD se estabilice en tiempos de retraso suficientemente largos (es decir, donde es el MSD y δ2 es el MSD máximo). Dado que el ISF se puede expresar en términos del MSD como , y dado que el ISF no ecgódico va a C en tiempos de retraso largos (es decir, ), la relación se obtiene32,75. Por lo tanto, se puede usar C(q) para encontrar δ2, y esto produjo δ2 = 0.017 μm2 y 0.0032 μm2 para las redes de vimentina de 34 y 49 μM, respectivamente (correspondiente a δ = 0.13 μm y 0.057 μm). Figura 6: Parámetro de nonergodicidad vs. número de onda para redes de vimentina. Desde los ajustes hasta el ISF, el parámetro de no nerviosidad C se determina para un rango de valores q . En bronceado (rojo) se encuentran los datos de imágenes de perlas de 0,6 μm dentro de redes de vimentina con una concentración de vimentina de 34 μM (49 μM). Las barras de error representan las desviaciones estándar en τ en varias películas (cinco películas para los datos con la red de 34 μM [tan] y cuatro películas para los datos con la red de 49 μM [rojo]). El eje y tiene escala logarítmica. Se observa una q-dependencia de C que sigue , que permite extraer el desplazamiento cuadrático medio máximo, δ2. Los ajustes se muestran con las líneas sólidas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Se pueden utilizar otros métodos para extraer el tamaño de confinamiento δ de los datos, así como el exponente subdiffusivo encontrado al examinar τ(q) para perlas dentro de la red de vimentina de 19 μM. En primer lugar, se puede utilizar el método descrito por Bayles et al.76 y Edera et al.77 para extraer el MSD de la matriz DDM. En particular, este método no requiere el ajuste de la matriz DDM. Solo se necesita calcular la matriz DDM, D(q, Δt), y (a partir de la cual se pueden determinar A(q) y B ). Luego, para encontrar el MSD, se usa la relación . Tenga en cuenta que este método para encontrar el MSD asume que la distribución de los desplazamientos de partículas es gaussiana, aunque trabajos anteriores han demostrado que, en ciertos casos, los MSD derivados de DDM están de acuerdo con los MSD del seguimiento de partículas, incluso cuando los desplazamientos no son gaussianos73. Para este sistema, como se esperaba78, existe no gaussianidad en la distribución de grandes desplazamientos, como se ve en la Figura S1. En el paquete PyDDM, se debe ejecutar la función extract_MSD, que devuelve . En segundo lugar, se puede utilizar el seguimiento de una sola partícula para encontrar el MSD. Aunque DDM se puede utilizar para analizar imágenes donde la alta densidad de partículas o la resolución óptica limitada prohíben la localización precisa de partículas, para las imágenes de perlas de 0,6 μm en redes de vimentina, pudimos localizar y rastrear cuentas utilizando el software trackpy (https://github.com/soft-matter/trackpy)79. Este paquete de software de seguimiento de partículas utiliza los algoritmos descritos por Crocker y Grier80. Figura 7: Desplazamiento cuadrático medio vs. tiempo de retraso para redes de vimentina. El MSD se determinó utilizando dos métodos. Primero, el MSD se calculó a partir de la matriz DDM (que se muestra con símbolos sólidos). A continuación, el MSD se determinó mediante el uso de seguimiento de una sola partícula (SPT) para encontrar trayectorias de partículas (símbolos abiertos). Las barras de error se determinan de la misma manera que se describe en las dos leyendas de figuras anteriores. (A) Los TME para perlas de 0,6 μm en la red de vimentina de 19 μM indican movimiento subdiffusivo, con un buen acuerdo entre los dos métodos de búsqueda del TME. (B) Los TME para perlas de 0,6 μm en la red de vimentina de 49 μM indican movimiento enjaulado, con un buen acuerdo entre los dos métodos de búsqueda del TME y con el MSD máximo encontrado a partir del parámetro de no nerviosismo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Los TME frente al tiempo de retraso para perlas de 0,6 μm en la red de vimentina de 19 μM y en la red de vimentina de 49 μM se muestran en la Figura 7. En ambos casos, el MSD determinado a partir de DDM estuvo de acuerdo con el MSD encontrado a través del seguimiento de una sola partícula (SPT). Además, para la red menos concentrada, el exponente de escala subdiffusive (α en ) fue de aproximadamente 0,9. Esto es consistente con la escala τ(q) de encontrada al ajustar el ISF para determinar τ(q) (es decir, 2/2.2 = 0.9). Para la red más concentrada, el MSD se estanca en tiempos de retraso más largos. El MSD máximo encontrado al analizar la q-dependencia del parámetro de nonergodicidad (mostrado en la Figura 7B con la línea horizontal en δ2 = 0.0032 μm2) fue aproximadamente el mismo valor hacia el que los MSD tanto de SPT como de DDM parecían estar estancando. Existe una discrepancia entre los TME de mayor tiempo de retraso determinados a partir de DDM y SPT en la Figura 7A. Si bien esto puede deberse a un número limitado de trayectorias de tiempo de retraso largo, también puede darse el caso de que una mayor optimización del rango de valores q para los que se utiliza la matriz DDM para estimar cada tiempo de retraso (como lo hacen Bayles et al.76 y Edera et al.77) mejoraría nuestros resultados. y esa optimización será el centro de la labor futura. Estos experimentos en los que se registraron secuencias de imágenes de perlas trazadoras incrustadas en una red de filamentos intermedios de vimentina permitieron realizar análisis independientes: DDM (utilizando el paquete descrito aquí) y SPT (utilizando trackpy). Ambos análisis pueden revelar el grado de subdifusión y la longitud de confinamiento, lo que permite utilizar dos técnicas de análisis de imágenes independientes para proporcionar métricas complementarias. Hay cantidades adicionales que se pueden comparar de SPT y DDM. Por ejemplo, la heterogeneidad en la dinámica de la muestra puede revelarse como no gaussianidad en la distribución de desplazamientos de partículas (es decir, la distribución de van Hove) determinada a partir de SPT, así como en un ISF determinado a partir de DDM que se ajusta a un exponencial estirado34,35. La Figura S1 muestra la distribución de van Hove para las partículas de 0,6 μm en las redes de vimentina y analiza el exponente de estiramiento encontrado al ajustar los ISF, métricas utilizadas en conjunto en estudios anteriores para demostrar la dinámica heterogénea de partículas dentro de sistemas biomiméticos 9,10,47 u otros entornos concurridos 34 . Como otro ejemplo, el ISF se puede calcular a partir de trayectorias de partículas medidas con SPT y comparadas con los ISF adquiridos por DDM. Si bien los desplazamientos cuadráticos medios y las distribuciones de desplazamiento son las métricas que se extraen con mayor frecuencia del análisis SPT, también se puede calcular el ISF a partir de trayectorias de partículas, utilizando (ver Figura S2). Este ISF se puede comparar con los ISF generados por DDM y se utiliza para revelar dinámicas no aparentes en el MSD59. Si bien la adquisición de imágenes de partículas trazadoras dentro de una red puede permitir que se utilicen los métodos de análisis complementarios de SPT y DDM, es importante tener en cuenta que una ventaja de DDM sobre SPT es que no requiere imágenes de cuentas (u otras características) que se puedan localizar y rastrear fácilmente. Para demostrar este punto, a continuación destacamos el análisis de redes activas de filamentos de actina y microtúbulos, donde el etiquetado fluorescente de actina y tubulina permite la obtención de imágenes de ambos tipos de filamentos, distinguidos entre sí a través de diferentes fluoróforos, con un microscopio confocal de escaneo láser multicolor. Las imágenes se adquirieron con un microscopio confocal de barrido láser de redes actina-microtúbulos con actividad impulsada por la miosina (miosina II del músculo esquelético del conejo; Citoesqueleto #MY02). Los detalles de los experimentos y resultados se han descrito previamente11, y los resultados representativos que se muestran aquí son del análisis de dos películas proporcionadas en los materiales complementarios (películas S1 y S4) para11. Ambas secuencias de imágenes se grabaron a 2,78 fotogramas/s durante 1000 fotogramas. Para analizar estas imágenes, se calculó la matriz DDM para 50 tiempos de retraso que van desde 0,4 s a 252 s (1 fotograma a 700 fotogramas). La matriz DDM se ajustó entonces al modelo , siendo la función de dispersión intermedia . Hay, por lo tanto, cuatro parámetros de ajuste: A, τ, s y B. Los resultados de estos ajustes se muestran en la Figura 8. Se observó que la matriz DDM para un valor q particular tenía una meseta en tiempos de retraso bajos, aumentada con el tiempo de retraso y luego estancada (o mostraba signos de comenzar a estabilizarse) en grandes tiempos de retraso. La matriz DDM para los valores más bajos de q no alcanzó una meseta en tiempos de retraso largo. Por lo tanto, uno debe esperar una precisión deficiente en la medición del tiempo de desintegración para estas dinámicas bajas q (gran escala de longitud). Los tiempos de desintegración característicos, τ, desde los ajustes a la matriz DDM se muestran en la Figura 9. Los resultados se presentan para una red compuesta activa de actina-microtúbulos (similar a la película S111) y para una red activa de actina (similar a la película S411). Ambas redes se prepararon con las mismas concentraciones de actina y miosina, pero la red de solo actina se creó sin tubulina, como se describe en11. Para estos dos tipos de redes activas, la relación de ley de potencia observada fue . Esta escala indica movimiento balístico y que la contracción y el flujo impulsados por la miosina dominan sobre el movimiento térmico de los filamentos. A partir de τ = (vq)-1, se pudo encontrar una velocidad característica, v, de aproximadamente 10 nm/s para la red activa actina-microtúbulo y de 75 nm/s para la red activa de actina. Estos valores son consistentes con el análisis de velocimetría de imagen de partículas de los mismos videos mostrados en11. La escala no se mantuvo en los valores q más bajos para la red compuesta activa de actina-microtúbulo. Esto es probable porque los verdaderos tiempos de desintegración para esta red compuesta de actina-microtúbulos en los valores q más bajos son más largos que el tiempo de retraso máximo de la matriz DDM calculada. El tiempo máximo de retraso se indica con la línea roja horizontal en la Figura 9, y los tiempos de desintegración se desviaron de la escala esperada cerca de estos tiempos más largos. Figura 8: Matriz DDM vs. tiempo de retraso para una red compuesta activa de actina-microtúbulos. La matriz DDM para varios valores de q se traza en función del tiempo de retraso de una película de una red compuesta por monómeros de actina de 2,9 μM, dímeros de tubulina de 2,9 μM y miosina de 0,24 μM. Estos datos muestran el análisis de solo el canal de microtúbulos de una serie temporal multicolor de imágenes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 9: Tiempo de desintegración vs. número de onda para redes activas actina-microtúbulos. A partir de la adaptación de la matriz DDM, se encuentra el tiempo de desintegración, τ, en función del número de onda, q. El gráfico es τ vs q para imágenes de una red activa de actina-microtúbulos (analizando solo el canal de microtúbulos) en marrón y para imágenes de una red activa de actina en verde. Ambas redes tienen las mismas concentraciones de actina y miosina (2,9 μM y 0,24 μM, respectivamente); el compuesto actina-microtúbulo tiene 2,9 μM de dímeros de tubulina. Los tiempos de desintegración para la red de actina activa son mucho más pequeños que los tiempos de desintegración para la red activa de actina-microtúbulo, lo que indica un movimiento más rápido de la red de actina activa. En ambos casos, la dinámica es balística ya que los datos siguen una tendencia. Recuadro: la gráfica de los ISF vs. el tiempo de retraso escalado por el número de onda (Δt × q) muestra un colapso de los ISF en un rango de valores q . Esto también indica movimiento balístico. Los ISF que se muestran en este recuadro son de la red de actina activa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Para estos datos de redes activas, elegimos ajustar la matriz DDM, . Esto contrasta con lo que se hizo para los datos de cuentas en la red de vimentina, donde A (q) y B se estimaron sin ningún ajuste para aislar el ISF, f (q, Δt). En este caso, para los datos de red activos, A y B se dejaron como parámetros de ajuste porque los métodos utilizados para estimar B no dieron como resultado buenos ajustes. El método predeterminado para estimar B es calcular y asumir que, en general q, esto va a B/2. Sin embargo, este método sobreestimó B para estos datos, lo que se vio en el hecho de que, al calcular los ISF a partir de B estimados de esta manera (no se muestra), los ISF fueron mayores que 1 en los primeros tiempos de retraso (mientras que deberían pasar de un máximo de 1 a cero o algún parámetro de no nerviosicidad con un tiempo de retraso creciente). Se pueden seleccionar otros métodos para estimar B utilizando el parámetro background_method. Uno de estos otros métodos es estimar B como el mínimo de la matriz DDM en tiempos de retraso temprano (establecido con background_method = 1). Un método similar fue utilizado por Bayles et al.76, aunque no asumieron que B fuera constante con q. Otra opción es estimar B como el valor promedio en todos los tiempos de retraso de la matriz DDM en el máximo q (establecido con background_method = 2). Estos diferentes métodos para estimar el fondo, así como los resultados para permitir que B sea un parámetro de ajuste libre, se muestran en la Figura 10. A partir de esas gráficas, se puede ver que la amplitud, A, no alcanzó cero en los valores q más grandes sondeados, ya que no se estabilizó en gran q (Figura 10B), y dado que D(qmax, Δt) pasó de una meseta de tiempo de retraso más baja a una meseta de tiempo de retraso más alta (es decir, en qmax, hubo una A distinta de cero; Figura 10D). Por lo tanto, ni estimar B como ni como sería apropiado. Uno debe inspeccionar vs. q y D(qmax, Δt) vs. Δt antes de decidir cómo (o si) estimar B. Figura 10: Fondo vs. número de onda para redes activas de actina-microtúbulos. Al ajustar la matriz DDM, se puede encontrar el fondo, B, en función del número de onda, q.   Se muestraB vs. q para imágenes de una red activa de actina-microtúbulo (analizando solo el canal de microtúbulos) determinada a partir de estos ajustes con los símbolos púrpura. Las tres líneas sólidas en (A) muestran estimaciones del fondo encontrado sin ningún ajuste. La línea superior más oscura en (A) muestra el fondo estimado usando , que puede ser apropiado si se estanca a un valor constante en gran q. A partir de (B), tenga en cuenta que aún no ha alcanzado un valor constante en el q más grande sondeado. Por lo tanto, el uso de este método sobreestima el fondo. La línea inferior en (A) muestra el fondo estimado usando . Si la matriz DDM muestra una meseta de tiempo de retraso bajo como se muestra en (C) con la línea roja, entonces este método puede ser apropiado para estimar el fondo. La línea media más clara de (A) muestra el fondo estimado de . Este método puede ser apropiado si, a qmax, la amplitud, A, ha alcanzado cero. De (D), se ve que la amplitud es distinta de cero y, por lo tanto, este método sobreestima el fondo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura suplementaria S1: Distribuciones de probabilidad de desplazamientos de partículas. Las distribuciones de probabilidad de los desplazamientos de partículas muestran no gaussianidad para concentraciones de vimentina de 34 μM y 49 μM. El seguimiento de una sola partícula de perlas de 0,6 μm de diámetro se realizó en redes de vimentina de diferentes concentraciones. Los diferentes tiempos de retraso se muestran en las distribuciones de desplazamiento para las tres condiciones. (A) La distribución de los desplazamientos de partículas en una red de vimentina de 19 μM se ajusta a una función gaussiana. El ancho del gaussiano aumenta con el aumento del tiempo de retraso. (B) La distribución de los desplazamientos de partículas en una red de vimentina de 34 μM muestra más no gaussianidad, especialmente en grandes desplazamientos, que para el caso de 19 μM. (C) La distribución de los desplazamientos de partículas en una red de vimentina de 49 μM también muestra no gaussianidad. Además, los anchos de las distribuciones no aumentan con el tiempo de retraso tan significativamente como en las muestras con concentraciones de vimentina más bajas, lo que indica un movimiento confinado. Las distribuciones de van Hove no gaussianas (observadas para todas las muestras de vimentina, pero más evidentes en las concentraciones más altas) se asocian con dinámicas heterogéneas como se ve a menudo en el transporte de partículas en ambientes abarrotados y confinados. Otro indicador de transporte heterogéneo que se determina a partir del análisis DDM es el exponente de estiramiento utilizado para ajustarse a la función de dispersión intermedia (el parámetro s en la ecuación para el ISF utilizado aquí: + ). Los exponentes de estiramiento promedio en el rango q de 0.4 μm-1 a 9.4 μm-1 son, desde la concentración de vimentina más alta hasta la más baja, 0.53 ± 0.07, 0.64 ± 0.02 y 0.86 ± 0.04 (desviación estándar media ±). Haga clic aquí para descargar este archivo. Figura suplementaria S2: Las funciones de dispersión intermedias de DDM y SPT. Se muestran las funciones de dispersión intermedia (ISF) para cinco números de onda diferentes. El ISF versus el tiempo de retraso encontrado a través de DDM se traza con marcadores circulares, y el ISF se calcula a partir de trayectorias de una sola partícula con cuadrados abiertos. Las líneas negras punteadas muestran los ajustes a los ISF adquiridos por DDM. El ISF se calcula a partir de trayectorias de una sola partícula, , utilizando . En (A), el ISF se muestra para partículas de 0,6 μm en las redes de vimentina de 19 μM. En (B), el ISF se muestra para partículas de 0,6 μm en las redes de vimentina de 34 μM. Las discrepancias en el ISF encontradas en DDM y SPT probablemente se deban a un número limitado de trayectorias de tiempo de retraso prolongado. Haga clic aquí para descargar este archivo. Archivo complementario 1: Protocolo para el uso de DDM. Se presentan la entrada y salida de los pasos mostrados en el protocolo. Haga clic aquí para descargar este archivo. Archivo complementario 2: Detalles de la preparación de muestras y archivos de parámetros de ejemplo para redes de vimentina. Se proporcionan pasos detallados para la preparación de muestras y la adquisición de imágenes en redes de vimentina. Además, también se proporciona un archivo de parámetros de ejemplo para el análisis de los datos presentados en la sección de resultados representativos sobre redes de vimentina. Haga clic aquí para descargar este archivo.