Количественная оценка динамики цитоскелетов с помощью дифференциальной динамической микроскопии

Здесь мы покажем примеры анализа, проведенного с помощью PyDDM из двух разных наборов экспериментов. В одной серии экспериментов субмикронные трассирующие шарики были встроены в сети, состоящие из промежуточного белка нити виментина, и визуализированы с использованием объектива 100x в режиме яркого поля со скоростью 100 кадров / с (рисунок 3A). Виментин экспрессируется в мезенхимальных клетках и является ключевым фактором, определяющим механические свойства цитоплазмы65 и механическую стабильность ядра в клетках, выполняющих замкнутую миграцию 66,67. До сих пор восстановленные виментиновые сети изучались в основном макроскопической реологией 64,68,69, тогда как динамике уделялось сравнительно мало внимания 13,70,71. Дополнительные сведения об этих экспериментах можно найти в Дополнительном файле 2. В другой серии экспериментов активные сети цитоскелетов были получены с актином, микротрубочками и миозином. Спектрально различимые флуоресцентные метки позволяли визуализировать нити актина и микротрубочек с помощью двухцветного лазерно-сканирующего конфокального микроскопа с использованием объектива 60x со скоростью 2,78 кадра/ с (рисунок 3B, C). Актиновые и микротрубочки являются важными факторами динамических изменений формы клеток, причем их действия координируются механическими и биохимическими взаимодействиями72. Дополнительные подробности этих экспериментов можно найти в11. Отдельные кадры из последовательностей изображений, сделанных в этих экспериментах, показаны на рисунке 3. Рисунок 3: Проанализированные изображения из временных рядов. (A) Изображение Брайтфилда бусин размером 0,6 мкм в виментиновой сети. (В,С) Изображение микротрубочек (B) и актина (C) в активном композите актин-микротрубочка, сделанное с помощью 60-кратного объектива на лазерно-сканирующем конфокальном микроскопе, с использованием света возбуждения 561 нм для визуализации микротрубочек и 488 нм света возбуждения для визуализации актина. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Для изображений трассирующих бусин в виментиновых сетях записывались фильмы по 5000 кадров размером 512 х 512 пикселей при 100 кадрах/с. Из них матрица DDM была вычислена с 60 логарифмически интервальными временами задержки между 1 и 1000 кадрами, или 0,01 с и 10 с. Для оценки фона было вычислено B, среднее значение преобразованных в квадрате изображений Фурье, равное 55,73. Было сделано предположение, что при наибольших 10% q-значений эта величина равна B/2 и что B не зависит от q. Это метод пакета по умолчанию для оценки B, но другие методы возможны, установив для параметра background_method другое значение. С параметрами A(q) и B , определенными из , можно извлечь промежуточную функцию рассеяния (ISF) из матрицы DDM. Примеры ISF показаны на рисунке 4. На фиг.4А показан ISF из изображений шариков диаметром 0,6 мкм, встроенных в сеть с концентрацией виментина 19 мкм. На фиг.4В показан ISF для однотипных шариков в сети с концентрацией виментина 34 мкМ. Интересно, что ни в том, ни в другом случае ISF не снизились до нуля. При больших задержках ISF должен приближаться к нулю для эргодических систем. То есть в таких системах флуктуации плотности должны полностью относиться к большим временам задержки. Тот факт, что ISF здесь не распался до нуля, мог быть результатом неточных оценок A(q) и B, которые были использованы для поиска ISF из вычисляемой матрицы DDM. Примечательно, что метод, используемый здесь, может переоценить B в некоторых сценариях62. Тем не менее, более вероятно, что динамика шариков индикатора действительно неэргодична, поскольку бусины имеют сопоставимый размер с размером сетевой сетки и, следовательно, могут стать клетками. Другие данные подтверждают вывод о неэргодичности. А именно, размер шарика, составляющий 0,6 мкм, был больше расчетного среднего значения для размеров ячеек 0,4 мкм для концентрации 19 мкМ и 0,3 мкм для концентрации 34 мкМ. Кроме того, результаты отслеживания одиночных частиц этих трассирующих шариков, которые показаны позже, также показали ограниченное движение. Рисунок 4: Промежуточные функции рассеяния при нескольких волновых числах для виментиновых сетей. ISF строится как функция времени задержки для значений q примерно от 1 до 9 мкм-1. (A) ISF из изображений шариков 0,6 мкм в виментиновой сети с концентрацией виментина 19 мкм. (B) ISF из изображений шариков 0,6 мкм в виментиновой сети с концентрацией виментина 34 мкм. Длительное временное плато задержки ISF при значении значительно выше нуля указывает на неэргодичность. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Учитывая, что динамика, вероятно, неэргодична, ISF соответствуют форме , где C — коэффициент неэргодичности 32. Эта форма ISF использовалась в предыдущих исследованиях неэргодической динамики, таких как коллоидные гели32,74 или индикаторные частицы в актин-микротрубочных сетях 10. Пунктирные черные линии на рисунке 4 показывают совпадения вместе с данными. Из этих припадков теперь можно посмотреть на q-зависимость времени распада, τ, и параметра неэргодичности, C. Рисунок 5: Время распада в сравнении с волновым числом для виментиновых сетей. От припадков к ISF время распада τ определяется для диапазона значений q . Для ясности мы показываем не значение τ для каждого q, а просто логарифмически распределенное множество. Синим (коричневым) являются данные из изображений шариков размером 0,6 мкм в сетях виментина с концентрацией виментина 19 мкМ (34 мкМ). Полосы ошибок представляют стандартные отклонения в τ для нескольких фильмов (четыре фильма для данных с сетью 19 мкМ [синий] и пять фильмов для данных с сетью 34 мкМ [tan]). Красные пунктирные линии обозначают предполагаемые границы нашего временного и пространственного разрешения, как описано в результатах. Сплошная черная линия показывает масштабирование, которое указывает на диффузное движение. Ни один из наборов данных не следует этому масштабированию. Скорее, бусины в сети 19 мкМ показывают субдиффузивное движение (с β > 2), а бусины в сети 34 мкМ показывают ограниченное или заключенное в клетку движение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Время распада показало большую неопределенность, как на низком q , так и на высоком q экстремумах, как показано на рисунке 5. Полосы ошибок на этом графике показывают стандартное отклонение среди четырех видео, проанализированных для случая более низкой концентрации виментина, или пяти видео, проанализированных для более высокой концентрации. Чтобы понять источник большой неопределенности на этих крайностях, рассмотрите как временное, так и пространственное разрешение. Приблизительные пределы разрешения показаны тремя красными пунктирными линиями. Две горизонтальные линии соответствуют минимальному и максимальному времени задержки. Учитывая частоту кадров 100 кадров/с и максимальное время задержки, соответствующее 1000 кадрам (20% от общей продолжительности видео), точность была потеряна при измерении динамики, происходящей быстрее 0,01 с или медленнее 10 с. При более низких значениях q установленные значения для τ были больше 10 с. Поэтому следует ожидать больших неопределенностей во время распада, которое превышает максимальное время задержки. В верхней части q-диапазона время распада приблизилось к минимальному времени задержки 0,01 с, но оставалось выше него. Вместо того, чтобы быть ограниченным временным разрешением, при этих более высоких значениях q , пространственное разрешение может быть ограничивающим фактором. Учитывая размер пикселя 0,13 мкм, наибольшее значение для q составляло около 24 мкм-1. Однако дифракционное ограниченное разрешение не обязательно позволяет точно измерять динамику на этих высоких пространственных частотах. Аппроксимация оптического разрешения приводит к верхнему пределу волнового числа около 16 мкм-1, учитывая числовую диафрагму объектива, NA, 1,4 и длину волны света. Это обозначено вертикальной красной пунктирной линией на рисунке 5. Действительно, данные были шумными при больших значениях q. Еще до этого приблизительного верхнего предела q наблюдалась повышенная неопределенность в τ, и это могло быть связано с переоценкой qmax. Более низкое оптическое разрешение, чем прогнозировалось, может быть связано с тем, что масляная иммерсионная линза использовалась для изображения за пределами крышки в водный образец или потому, что конденсаторная линза была неидеально выровнена. Для шариков размером 0,6 мкм, встроенных в менее концентрированную сеть (виментин 19 мкМ), можно наблюдать на логарифмическом графике времени распада против волнового числа, что время распада уменьшалось с волновым числом таким образом, чтобы это соответствовало степенному закону (рисунок 5). Однако он, по-видимому, не следует тому, что можно было бы ожидать для нормального диффузного движения, где . Скорее, τ уменьшался более круто с увеличением q. Это свидетельствует о субдиффузивном движении, которое часто происходит для бусин в переполненных средах, таких как эти. Подгонка τ(q) в диапазоне от 1,4 мкм-1 до 12,3 мкм-1 к степенному закону вида τ = 1/Kqβ дает параметры переноса K = 0,0953 мкмβ /с и β = 2,2. Для тех, кто более привык думать о нормальной диффузии и субдиффузии в терминах среднего квадратного смещения (MSD) частиц индикатора как функции времени задержки (т. Е. MSD = K’ Δtα), полезно признать, что субдиффузивная экспонента масштабирования в уравнении MSD, α, эквивалентна α = 2 / β. Другими словами, значение β = 2,2 согласуется с субдиффузной экспонентой масштабирования в уравнении MSD α = 0,9. Можно было бы установить PyDDM так, чтобы он соответствовал τ(q) в этом диапазоне q-значений, указав индексы массива q либо с параметром, Good_q_range в файле YAML, либо передав необязательный аргумент forced_qs функции generate_fit_report. Диапазон q от 1,4 мкм-1 до 12,3 мкм-1 для приведенных здесь данных будет соответствовать индексам массива q от 15 до 130. Для шариков размером 0,6 мкм в более концентрированной сети (34 мкМ) время распада показало небольшую зависимость от q. Вероятно, это связано с неэргодичностью бусин в сети с меньшим размером ячеек. Чтобы исследовать неэргодичность в этой системе, параметр nonergodicity, C, должен быть построен как функция q, как показано на рисунке 6. Для шариков 0,6 мкм в виментиновой сети 19 мкМ C ≈ 0,2 с небольшой зависимостью от q (не показано). Однако для сети с 34 мкМ виментина и для сети с еще более высокой концентрацией виментина 49 мкМ логарифм C был пропорционален q2, как показано на фиг.6. Эта связь между C и q ожидается для ограниченного движения. Для бусин, захваченных в карманах сети, MSD, как ожидается, будет плато в достаточно длительное время задержки (т. Е. , Где – MSD и δ2 – максимальный MSD). Поскольку ISF может быть выражен в терминах MSD как , и поскольку неэргодический ISF переходит в C с длительным временем задержки (т.е. ), соотношение получается32,75. Поэтому можно использовать C(q) для поиска δ2, и это дало δ2 = 0,017 мкм2 и 0,0032 мкм2 для 34 и 49 мкМ виментиновых сетей соответственно (что соответствует δ = 0,13 мкм и 0,057 мкм). Рисунок 6: Параметр неэргодичности в сравнении с волновым числом для виментиновых сетей. От соответствия к ISF параметр неэргодичности C определяется для диапазона значений q. В загаре (красный) приведены данные из изображений шариков 0,6 мкм в виментиновых сетях с концентрацией виментина 34 мкМ (49 мкМ). Полосы ошибок представляют собой стандартные отклонения в τ для нескольких фильмов (пять фильмов для данных с сетью 34 мкМ [tan] и четыре фильма для данных с сетью 49 мкМ [красный]). Ось Y имеет логарифмическое масштабирование. Далее следует q-зависимость от C, которая позволяет извлечь максимальное среднее квадратическое смещение, δ2. Подходит к показанным сплошным линиям. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Можно использовать другие методы для извлечения размера удержания δ из данных, а также субдиффузной экспоненты, найденной при исследовании τ(q) для шариков в сети виментина 19 мкМ. Во-первых, можно использовать метод, описанный Bayles et al.76 и Edera et al.77 для извлечения MSD из матрицы DDM. Примечательно, что этот метод не требует подгонки матрицы DDM. Нужно только вычислить матрицу DDM, D(q, Δt) и (из которой можно определить A(q) и B ). Затем, чтобы найти MSD, используется связь . Обратите внимание, что этот метод поиска MSD предполагает, что распределение перемещений частиц является гауссовским, хотя предыдущая работа показала, что в некоторых случаях MSD, полученные из DDM, согласуются с MSD из отслеживания частиц, даже если смещения не являются гауссовскими73. Для этой системы, как и ожидалось78, в распределении больших перемещений существует негауссовская негауссианность, как показано на рисунке S1. В пакете PyDDM должна быть выполнена функция extract_MSD, которая возвращает . Во-вторых, можно использовать отслеживание отдельных частиц, чтобы найти MSD. Хотя DDM можно использовать для анализа изображений, где либо высокая плотность частиц, либо ограниченное оптическое разрешение запрещают точную локализацию частиц, для изображений бусин 0,6 мкм в виментиновых сетях мы смогли локализовать и отслеживать бусины с помощью программного обеспечения trackpy (https://github.com/soft-matter/trackpy)79. Этот программный пакет для отслеживания частиц использует алгоритмы, описанные Крокером и Гриером80. Рисунок 7: Среднее квадратичное смещение по сравнению со временем задержки для виментиновых сетей. MSD был определен с использованием двух методов. Во-первых, MSD был вычислен из матрицы DDM (показанной с твердыми символами). Затем MSD был определен с использованием отслеживания одной частицы (SPT) для поиска траекторий частиц (открытые символы). Полосы ошибок определяются таким же образом, как описано в предыдущих двух условных обозначениях. (A) MSD для шариков 0,6 мкм в виментиновой сети 19 мкМ указывают на субдиффузивное движение, с хорошим согласием между двумя методами нахождения MSD. (B) MSD для шариков 0,6 мкм в виментиновой сети 49 мкМ указывают на движение в клетке, с хорошим согласованием между двумя методами нахождения MSD и с максимальным MSD, найденным по параметру неэргодичности. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. MsD и время задержки для шариков 0,6 мкм в сети виментиновой сети 19 мкМ и в виментиновой сети 49 мкМ показаны на рисунке 7. В обоих случаях MSD, полученный из DDM, хорошо согласуется с MSD, обнаруженным с помощью отслеживания одной частицы (SPT). Кроме того, для менее концентрированной сети субдиффузивная экспонента масштабирования (α в ) составляла около 0,9. Это согласуется с τ(q) масштабированием найденного путем подгонки ISF для определения τ(q) (то есть 2/2.2 = 0,9). Для более концентрированной сети MSD плато с более длительным временем задержки. Максимальный MSD, полученный путем анализа q-зависимости параметра неэргодичности (показанный на рисунке 7B с горизонтальной линией при δ2 = 0,0032 мкм2), был примерно тем же значением, к которому MSD из SPT и DDM, по-видимому, плато. На рисунке 7А существует расхождение между msD с самым длительным временем задержки, определенным по DDM и SPT. Хотя это может быть связано с ограниченным числом длинных траекторий времени задержки, также может быть так, что дальнейшая оптимизация диапазона значений q, для которых матрица DDM используется для оценки каждого времени задержки (как это сделано Bayles et al.76 и Edera et al.77), улучшит наши результаты, и такая оптимизация будет в центре внимания будущей работы. Эти эксперименты, в которых были записаны последовательности изображений трассирующих шариков, встроенных в сеть промежуточных нитей виментина, позволили провести независимый анализ: DDM (с использованием пакета, описанного здесь) и SPT (с использованием trackpy). Оба анализа могут выявить степень субдиффузии и длины удержания, что позволяет использовать два независимых метода анализа изображений для обеспечения дополнительных показателей. Существуют дополнительные количества, которые можно сравнить по SPT и DDM. Например, неоднородность в динамике образца может проявляться как негауссовская негауссовость в распределении перемещений частиц (т.е. распределении Ван Хоува), определяемом из SPT, а также в ISF, определяемом из DDM, который подходит к растянутой экспоненциальной34,35. На рисунке S1 показано распределение Ван Хоува для частиц 0,6 мкм в виментиновых сетях и обсуждается показатель растяжения, обнаруженный при подгонке ISF — метрики, используемые в тандеме в предыдущих исследованиях для демонстрации гетерогенной динамики частиц в биомиметических системах 9,10,47 или других переполненных средах 34 . В качестве другого примера, ISF можно рассчитать на основе траекторий частиц, измеренных с помощью SPT, и сравнить с полученными DDM ISF. В то время как средние квадратные смещения и распределения смещений являются метриками, которые чаще всего извлекаются из анализа SPT, можно также вычислить ISF по траекториям частиц, используя (см. Рисунок S2). Этот ISF можно сравнить с DDM-генерируемыми ISF и использовать для выявления динамики, не очевидной в MSD59. Хотя получение изображений индикаторных частиц в сети может позволить использовать дополнительные методы анализа SPT и DDM, важно отметить, что преимущество DDM перед SPT заключается в том, что он не требует изображений бусин (или других признаков), которые могут быть легко локализованы и отслежены. Чтобы продемонстрировать этот момент, мы далее выделим анализ активных сетей нитей актина и микротрубочек, где флуоресцентная маркировка актина и тубулина позволяет визуализировать оба типа нитей, отличающихся друг от друга с помощью различных флуорофоров, с помощью многоцветного лазерно-сканирующего конфокального микроскопа. Изображения были получены с помощью лазерно-сканирующего конфокального микроскопа сетей актин-микротрубочек с активностью, обусловленной миозином (миозин скелетных мышц кролика II; Цитоскелет #MY02). Подробности экспериментов и результатов были ранее описаны11, а репрезентативные результаты, показанные здесь, взяты из анализа двух фильмов, представленных в дополнительных материалах (фильмы S1 и S4) для11. Обе последовательности изображений были записаны со скоростью 2,78 кадра/с в течение 1000 кадров. Для анализа этих изображений матрица DDM была рассчитана на 50 лагов в диапазоне от 0,4 с до 252 с (1 кадр на 700 кадров). Затем матрица DDM была адаптирована к модели , при этом промежуточной функцией рассеяния была . Таким образом, существует четыре параметра соответствия: A, τ, s и B. Результаты этих припадков показаны на рисунке 8. Было отмечено, что матрица DDM для конкретного значения q имела плато при низком времени задержки, увеличивалась со временем задержки, а затем стабилизировалась (или показывала признаки начала плато) в большие промежутки времени задержки. Матрица DDM для более низких значений q не достигла плато при длительном времени задержки. Поэтому следует ожидать низкой точности в измерении времени распада для этой низкой динамики q (масштаб большой длины). Характерное время распада, τ, от прилегания к матрице DDM показано на рисунке 9. Результаты представлены для активной актин-микротрубочки композитной сети (аналогично фильму S111) и для активной актиновой сети (аналогично фильму S411). Обе сети были получены с одинаковыми концентрациями актина и миозина, но сеть только актина была создана без тубулина, как описано в11. Для этих двух типов активных сетей наблюдаемое соотношение степенного закона было . Это масштабирование указывает на баллистическое движение и на то, что сокращение и поток, управляемые миозином, доминируют над тепловым движением нитей. Из τ = (vq)-1 можно найти характерную скорость, v, около 10 нм/с для активной сети актин-микротрубочек и 75 нм/с для активной актиновой сети. Эти значения согласуются с анализом велоциметрии изображения частиц тех же видео, показанных в11. Масштабирование не соответствовало нижним значениям q для активной композитной сети актин-микротрубочки. Вероятно, это связано с тем, что истинное время распада для этой композитной сети актин-микротрубочки при более низких значениях q больше, чем максимальное время задержки вычисляемой матрицы DDM. Максимальное время задержки обозначено горизонтальной красной линией на рисунке 9, а время распада отклоняется от ожидаемого масштабирования вблизи этих более длительных времен. Рисунок 8: Матрица DDM и время задержки для активной композитной сети актин-микротрубочки. Матрица DDM для нескольких значений q строится как функция времени задержки из пленки композитной сети, состоящей из 2,9 мкМ актиновых мономеров, димеров тубулина 2,9 мкМ и миозина 0,24 мкМ. Эти данные показывают анализ как раз микротрубочкового канала многоцветного временного ряда изображений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 9: Время распада в сравнении с волновым числом для активных сетей актин-микротрубочек. Из соответствия матрицы DDM обнаруживается время распада , τ, как функция волнового числа, q. График τ vs q для изображений активной сети актин-микротрубочек (анализируя только канал микротрубочек) коричневого цвета и для изображений активной актиновой сети зеленым цветом. Обе сети имеют одинаковые концентрации актина и миозина (2,9 мкМ и 0,24 мкМ соответственно); актин-микротрубочка имеет 2,9 мкМ димеров тубулина. Время распада для активной актиновой сети намного меньше, чем время распада для активной сети актин-микротрубочек, что указывает на более быстрое движение активной актиновой сети. В обоих случаях динамика является баллистической, поскольку данные следуют за тенденцией. Вставка: график ISF против времени задержки, масштабируемого по волновому числу (Δt × q), показывает коллапс ISF в диапазоне значений q . Это также указывает на баллистическое движение. ISF, показанные в этой вставке, взяты из активной сети актинов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Для этих данных активных сетей мы выбрали DDM-матрицу, . Это контрастирует с тем, что было сделано для данных шариков в виментиновой сети, где A (q) и B были оценены без какой-либо подгонки для изоляции ISF, f (q, Δt). В этом случае для активных сетевых данных A и B были оставлены в качестве подходящих параметров, поскольку методы, используемые для оценки B , не приводили к хорошим соответствиям. Метод оценки B по умолчанию заключается в вычислении и предположении, что в целом q это относится к B/2. Однако этот метод переоценил B для этих данных, что проявилось в том, что при расчете ISF из B , оцененных таким образом (не показанных), ISF были больше 1 в ранние времена задержки (тогда как они должны были идти от максимума 1 до нуля или некоторого неэргодичного параметра с увеличением времени задержки). Другие методы оценки B можно выбрать, используя параметр background_method. Одним из этих других методов является оценка B как минимума матрицы DDM в раннее время задержки (установленное с background_method = 1). Аналогичный метод был использован Bayles et al.76, хотя они не предполагали, что B является постоянным с q. Другой вариант заключается в том, чтобы оценить B как среднее значение за все время задержки матрицы DDM при максимальном q (заданном с background_method = 2). Эти различные методы оценки фона, а также результаты, позволяющие B быть параметром свободного подгонки, показаны на рисунке 10. Из этих графиков видно, что амплитуда, A, не достигала нуля при наибольших значениях q , так как не плато на большом q (рисунок 10B), а поскольку D(qmax, Δt) перешла от более низкого плато времени задержки к некоторому более высокому плато времени задержки (т.е. при qmax было ненулевое A; Рисунок 10D). Поэтому не было бы целесообразно ни оценивать В как , ни как . Следует проверить q и D(qmax, Δt) и Δt , прежде чем принимать решение о том, как (или если) оценивать B. Рисунок 10: Фоновое и волновое число для активных сетей актин-микротрубочек. Подгоняя матрицу DDM, можно найти фон, B, как функцию волнового числа, q. ПоказанB   против q для изображений активной сети актин-микротрубочек (анализируя только канал микротрубочек), определенных по этим соответствиям фиолетовым символам. Три сплошные линии в (А) показывают оценки фона, найденного без какой-либо подгонки. Верхняя, самая темная линия в (A) показывает предполагаемый фон с использованием , что может быть уместно, если плато до постоянного значения при большом q. Из (B) обратите внимание, что еще не достигло постоянного значения при наибольшем исследованном q. Поэтому использование этого метода переоценивает фон. Нижняя строка в (A) показывает предполагаемый фон с использованием . Если матрица DDM показывает низкое плато времени задержки, как показано в (C) с красной линией, то этот метод может быть подходящим для оценки фона. Средняя, самая светлая линия в (A) показывает предполагаемый фон от . Этот метод может быть целесообразным, если при qmax амплитуда A достигла нуля. Из (D) видно, что амплитуда не равна нулю и, следовательно, этот метод переоценивает фон. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Дополнительный рисунок S1: Вероятностные распределения смещений частиц. Вероятностные распределения перемещений частиц показывают негауссовскую величину для концентраций виментина 34 мкМ и 49 мкМ. Отслеживание одиночных частиц диаметром 0,6 мкм в виментиновых сетях различных концентраций проводилось. Различное время задержки показано в распределениях смещения для трех условий. (A) Распределение смещений частиц в виментиновой сети 19 мкМ соответствует функции Гаусса. Ширина гаусса увеличивается с увеличением времени задержки. (B) Распределение перемещений частиц в виментиновой сети 34 мкМ показывает большую негауссовскую степень, особенно при больших смещениях, чем в случае 19 мкМ. (C) Распределение смещений частиц в виментиновой сети 49 мкМ также показывает негауссовость. Кроме того, ширина распределений не увеличивается со временем задержки так же значительно, как в образцах с более низкими концентрациями виментина, что указывает на замкнутое движение. Негауссовские распределения Ван Хоува (наблюдаемые для всех образцов виментина, но наиболее очевидные в более высоких концентрациях) связаны с гетерогенной динамикой, как это часто наблюдается при переносе частиц в переполненных и замкнутых средах. Другим показателем гетерогенного переноса, который определяется из DDM-анализа, является экспонента растяжения, используемая для соответствия промежуточной функции рассеяния (параметр s в уравнении для ISF используется здесь: + ). Средние показатели растяжения в q-диапазоне от 0,4 мкм-1 до 9,4 мкм-1 составляют, от самой высокой концентрации виментина до самой низкой, 0,53 ± 0,07, 0,64 ± 0,02 и 0,86 ± 0,04 (среднее ± стандартное отклонение). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл. Дополнительный рисунок S2: Промежуточные функции рассеяния от DDM и SPT. Показаны промежуточные функции рассеяния (ISF) для пяти различных волновых чисел. Время ISF против лага, найденное через DDM, строится с помощью круговых маркеров, а ISF вычисляется из траекторий одной частицы с открытыми квадратами. Пунктирные черные линии показывают соответствие приобретенным DDM ISF. ISF рассчитывается по траекториям одиночных частиц, используя . В (A) ISF показан для частиц 0,6 мкм в виментиновых сетях 19 мкМ. В (B) ISF показан для частиц 0,6 мкм в виментиновых сетях 34 мкМ. Расхождения в ISF, обнаруженные в DDM и SPT, вероятно, обусловлены ограниченным числом длительных траекторий времени задержки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл. Дополнительный файл 1: Протокол для использования DDM. Представлены входные и выходные шаги, показанные в протоколе. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл. Дополнительный файл 2: Сведения о подготовке образцов и примеры файлов параметров для сетей виментина. Приведены подробные этапы подготовки образцов и получения изображений на виментиновых сетях. Кроме того, приводится пример файла параметров для анализа данных, представленных в разделе репрезентативных результатов по сетям виментина. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.