Quantificando a Dinâmica do Citoesqueleto usando microscopia dinâmica diferencial

Aqui, mostramos exemplos da análise feita com pyddm de dois conjuntos diferentes de experimentos. Em um conjunto de experimentos, as contas de rastreador submicrícle foram incorporadas em redes que consistem na vimentina de proteína de filamento intermediário e imagens usando uma lente objetiva de 100x no modo brightfield a 100 quadros/s (Figura 3A). A vimentina é expressa em células mesenquimais e é um determinante chave das propriedades mecânicas do citoplasma65 e da estabilidade mecânica do núcleo em células que realizam migração confinada66,67. Até agora, as redes de vimentina reconstituídas têm sido estudadas principalmente pela reologia macroscópica 64,68,69, enquanto a dinâmica recebeu relativamente pouca atenção 13,70,71. Detalhes adicionais desses experimentos podem ser encontrados no Arquivo Suplementar 2. No outro conjunto de experimentos, redes ativas de citoesqueleto foram preparadas com actina, microtúbulos e miosina. Rótulos fluorescentes espectralmente distintos permitiram que os filamentos de actina e microtúbulo fossem imagens com um microscópio confocal de varredura a laser de duas cores usando uma lente objetiva de 60x a 2,78 quadros/s (Figura 3B,C). Filamentos de actina e microtúbulos são ambos importantes condutores de mudanças dinâmicas de forma celular, com suas ações coordenadas por interações mecânicas e bioquímicas72. Detalhes adicionais desses experimentos podem ser encontrados em11. Quadros individuais de sequências de imagem tiradas nesses experimentos são mostrados na Figura 3. Figura 3: Imagens da série temporal analisadas. (A) Imagem brightfield de 0,6 μm contas em uma rede de vimentina. (B,C) Imagem dos microtúbulos (B) e (C) actin em um composto ativo actin-microtúbulo tomado com um objetivo de 60x em um microscópio confocal de varredura a laser, usando luz de excitação de 561 nm para a imagem microtúbula e luz de excitação de 488 nm para a imagem de actin. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Para imagens de contas rastreadoras em redes de vimentina, foram gravados filmes de 5000 quadros com tamanho de 512 x 512 pixels a 100 quadros/s. A partir disso, a matriz DDM foi calculada em 60 tempos de lag logaritmicamente espaçados entre 1 e 1000 quadros, ou 0,01 s e 10 s. Para estimar o fundo, B, a média das imagens endiquadas transformadas por Fourier, foi calculada e fixada em 55,73. Foi pressuposto de que, acima dos maiores 10% dos valores q, essa quantidade é igual a B/2 e que b é independente de q. Este é o método padrão do pacote para estimar B, mas outros métodos são possíveis definindo o parâmetro background_method para um valor diferente. Com os parâmetros A(q) e B determinados a partir de , pode-se extrair a função de dispersão intermediária (ISF) da matriz DDM. Exemplos DE ISFs são mostrados na Figura 4. Na Figura 4A, mostra-se o ISF a partir de imagens de contas de 0,6 μm de diâmetro embutidas em uma rede com concentração de vimentina de 19 μM. Na Figura 4B, mostra-se o ISF para o mesmo tipo de contas em uma rede com concentração de vimentina de 34 μM. Curiosamente, em nenhum dos casos o ISF decaiu para zero. Em grandes momentos de atraso, o ISF deve se aproximar de zero para sistemas ergodicos. Ou seja, nesses sistemas, as flutuações de densidade devem descorretar completamente sobre grandes tempos de defasagem. O fato de que o ISF aqui não decaiu a zero poderia ter resultado de estimativas imprecisas de A(q) e B, que foram usadas para encontrar o ISF a partir da matriz de DDM computada. Notavelmente, o método aqui empregado pode superestimar B em certos cenários62. No entanto, é mais provável que a dinâmica das contas rastreadoras seja verdadeiramente nonergodica, pois as contas têm um tamanho comparável ao tamanho da malha de rede e podem, portanto, ficar enjauladas. Outros dados corroboraram a constatação da nonergodicidade. Ou seja, o tamanho da conta, 0,6 μm, foi maior do que o valor médio calculado para os tamanhos de malha de 0,4 μm para a concentração de 19 μM e 0,3 μm para a concentração de 34 μM. Além disso, os resultados do rastreamento de partículas únicas dessas contas rastreadoras, que são mostradas posteriormente, também mostraram movimento confinado. Figura 4: Funções de dispersão intermediárias em vários números de ondas para redes vimentinas. O ISF é plotado em função do tempo de atraso para valores q de cerca de 1 a 9 μm-1. (A) O ISF a partir de imagens de contas de 0,6 μm em uma rede de vimentina com concentração de vimentina de 19 μM. (B) O ISF a partir de imagens de 0,6 μm contas em uma rede de vimentina com concentração de vimentin de 34 μM. O longo planto de tempo de atraso do ISF em um valor bem acima de zero indica nonergodicidade. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Dado que a dinâmica é provavelmente nonergodica, os ISFs são adequados à forma , onde C é o fator de nonergodicidade 32. Esta forma do ISF tem sido usada em estudos anteriores de dinâmica não eródica, como a dos géis coloidais32,74 ou partículas rastreadoras nas redes actin-microtúbulas 10. As linhas pretas pontilhadas na Figura 4 mostram os ajustes junto com os dados. A partir desses ajustes, pode-se agora olhar para a q-dependência do tempo de decomposição, τ, e do parâmetro de nonergodicidade, C. Figura 5: Tempo de decadência vs. número de ondas para vimentina redes. De ajustes ao ISF, o tempo de decomposição é determinado para uma faixa de valores q . Para clareza, não estamos mostrando o valor de τ para cada q, mas apenas um conjunto logaritmicamente espaçado. Em azul (tan) estão os dados de imagens de contas de 0,6 μm dentro de redes de vimentina com uma concentração de vimentina de 19 μM (34 μM). As barras de erro representam os desvios padrão em vários filmes (quatro filmes para os dados com a rede de 19 μM [azul] e cinco filmes para os dados com a rede de 34 μM [tan]). Linhas pontilhadas vermelhas marcam limites estimados para nossa resolução temporal e espacial, conforme descrito nos resultados. A linha preta sólida mostra escala, o que indicaria movimento difuso. Nenhum conjunto de dados segue esse dimensionamento. Em vez disso, contas na rede 19 μM mostram movimento subdiffusivo (com β > 2), e contas na rede de 34 μM mostram movimento confinado ou enjaulado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Os tempos de decomposição mostraram grande quantidade de incerteza, tanto nos extremos q baixos e altos, como visto na Figura 5. As barras de erro nesta trama mostram o desvio padrão entre quatro vídeos analisados para o caso de concentração de vimentina inferior ou cinco vídeos analisados para maior concentração. Para entender a fonte da grande incerteza nesses extremos, considere tanto a resolução temporal quanto a espacial. Os limites aproximados da resolução são mostrados com três linhas pontilhadas de traço vermelho. As duas linhas horizontais correspondem aos tempos mínimos e máximos de defasagem sondados. Dada a taxa de quadros de 100 quadros/s e o tempo máximo de lag correspondente a 1000 quadros (20% da duração total do vídeo), a precisão foi perdida ao medir a dinâmica que ocorre mais rápido que 0,01 s ou mais lento que 10 s. Nos valores q mais baixos, os valores ajustados para τ foram maiores que 10 s. Portanto, grandes incertezas devem ser esperadas em tempos de decadência maiores do que o tempo máximo de defasagem. Na extremidade superior da faixa q, o tempo de decomposição se aproximou do tempo mínimo de defasagem de 0,01 s, mas permaneceu acima dele. Em vez de ser limitada pela resolução temporal, nesses valores q mais elevados, a resolução espacial pode ser o fator limitante. Dado o tamanho do pixel de 0,13 μm, o maior valor para q foi de cerca de 24 μm-1. No entanto, a resolução limitada à difração não permite necessariamente medições precisas da dinâmica nessas altas frequências espaciais. Aproximar-se da resolução óptica como leva a um limite de número de onda superior de cerca de 16 μm-1, dada a abertura numérica da lente objetiva, NA, de 1,4 e comprimento de onda de luz, . Isto é marcado pela linha vertical vermelha pontilhada na Figura 5. De fato, os dados eram barulhentos em grandes valores de q. Mesmo antes desse limite superior aproximado de q, o aumento da incerteza no τ foi visto, e isso poderia ser de superestimação qmax. Uma resolução óptica mais fraca do que o previsto pode ser porque uma lente de imersão de óleo foi usada para imagem além do deslizamento de tampa em uma amostra aquosa ou porque a lente do condensador estava imperfeitamente alinhada. Para as contas de 0,6 μm incorporadas na rede menos concentrada (19 μM vimentin), pode ser observado a partir do gráfico log-log do tempo de decadência versus número de ondas que o tempo de decadência diminuiu com o número de ondas de uma forma consistente com uma lei de poder (Figura 5). No entanto, não parece seguir o que seria esperado para um movimento difusivo normal, onde . Em vez disso, τ diminuiu mais acentuadamente com o aumento q. Isso é um indicativo de movimento subdiffusivo, que muitas vezes ocorre para contas em ambientes lotados como estes. Montagem τ(q) sobre a faixa de 1,4 μm-1 a 12,3 μm-1 a uma lei de potência do formulário τ = 1/Kqβ rende os parâmetros de transporte K = 0,0953 μmβ / s e β = 2,2. Para aqueles mais acostumados a pensar em difusão normal vs. subdiffusão em termos do deslocamento quadrado médio (MSD) de partículas rastreadoras em função do tempo de lag (ou seja, MSD = K’ Δtα), é útil reconhecer que o expoente de escala subdiffusivo na equação de MSD, α, é equivalente a α = 2 / β. Em outras palavras, o valor de β = 2,2 é consistente com um expoente de escala subdiffusiva na equação msd de α = 0,9. Um deles definiria o PyDDM para caber τ(q) sobre esta faixa de valores q especificando os índices do array de q com o parâmetro Good_q_range no arquivo YAML ou passando o argumento opcional forced_qs para a função generate_fit_report. A faixa de q de 1,4 μm-1 a 12,3 μm-1 corresponderia, para os dados aqui, correspondentes aos índices do conjunto de q de 15 a 130. Para as contas de 0,6 μm na rede mais concentrada (34 μM), o tempo de decomposição mostrou pouca dependência de q. Isso é provavelmente devido à nonergodicidade das contas em uma rede com um tamanho de malha menor. Para sondar a nonergodicidade neste sistema, o parâmetro de nonergodicidade, C, deve ser plotado em função de q, como na Figura 6. Para as contas de 0,6 μm na rede de vimentina de 19 μM, C ≈ 0,2 com pouca dependência de q (não mostrado). No entanto, para a rede com vimentina de 34 μM e para uma rede com concentração ainda maior de 49 μM vimentina, o registro de C foi proporcional ao q2, conforme mostrado na Figura 6. Esta relação entre C e q é esperada para movimento confinado. Para contas presas dentro de bolsões da rede, espera-se que o MSD plane em tempos de atraso suficientes (ou seja, onde está o MSD e δ2 é o MSD máximo). Uma vez que o ISF pode ser expresso em termos do MSD como , e uma vez que o ISF não orógodico vai para C em longos tempos de atraso (ou seja, a relação é obtida32,75. Portanto, pode-se usar C(q) para encontrar δ2, e isso rendeu δ2 = 0,017 μm2 e 0,0032 μm2 para as redes de vimentina de 34 e 49 μM, respectivamente (correspondente a δ = 0,13 μm e 0,057 μm). Figura 6: Parâmetro de nonergodicidade vs. número de ondas para redes de vimentina. De ajustes ao ISF, o parâmetro de nonergodicidade C é determinado para uma faixa de valores q . Em bronzeado (vermelho) estão os dados de imagens de contas de 0,6 μm dentro de redes de vimentina com uma concentração de vimentina de 34 μM (49 μM). As barras de erro representam os desvios padrão em vários filmes (cinco filmes para os dados com a rede de 34 μM [tan] e quatro filmes para os dados com a rede 49 μM [vermelho]). O eixo y tem escala logarítmica. Observa-se uma q-dependência de C que se segue , o que permite extrair o deslocamento médio máximo quadrado, δ2. Ajustes para serem mostrados com as linhas sólidas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Pode-se usar outros métodos para extrair o tamanho do confinamento δ dos dados, bem como o expoente subdiffusivo encontrado a partir da análise de τ(q) para contas dentro da rede vimentina de 19 μM. Em primeiro lugar, pode-se usar o método descrito por Bayles et al.76 e Edera et al.77 para extrair o MSD da matriz DDM. Notavelmente, este método não requer nenhum encaixe da matriz DDM. Basta calcular a matriz DDM, D(q, Δt) e (a partir da qual A(q) e B podem ser determinados). Então, para encontrar o MSD, usa-se a relação . Observe que este método para encontrar o MSD pressupõe que a distribuição de deslocamentos de partículas é gaussiana, embora trabalhos anteriores tenham mostrado que, em certos casos, os MSDs derivados do DDM concordam com os MSDs do rastreamento de partículas, mesmo quando os deslocamentos não são gaussianos73. Para este sistema, como esperado78, não há gaussianidade na distribuição de grandes deslocamentos, como visto na Figura S1. No pacote PyDDM, a função extract_MSD deve ser executada, que retorna . Em segundo lugar, pode-se usar rastreamento de partículas únicas para encontrar o MSD. Embora o DDM possa ser usado para analisar imagens onde a alta densidade de partículas ou a resolução óptica limitada proíbe a localização precisa de partículas, para as imagens de contas de 0,6 μm em redes vimentinas, fomos capazes de localizar e rastrear contas usando o software trackpy (https://github.com/soft-matter/trackpy)79. Este pacote de software de rastreamento de partículas usa os algoritmos descritos por Crocker e Grier80. Figura 7: Deslocamento médio ao quadrado versus tempo de atraso para redes vimentadas. O MSD foi determinado utilizando dois métodos. Primeiro, o MSD foi computado a partir da matriz DDM (mostrado com símbolos sólidos). Em seguida, o MSD foi determinado usando o rastreamento de partículas únicas (SPT) para encontrar trajetórias de partículas (símbolos abertos). As barras de erro são determinadas da mesma forma descritas nas duas legendas de figuras anteriores. (A) MsDs para contas de 0,6 μm na rede de vimentina de 19 μM indicam movimento subdiffusivo, com boa concordância entre os dois métodos de encontrar o MSD. (B) MsDs para contas de 0,6 μm na rede de vimentina de 49 μM indicam movimento enjaulado, com boa concordância entre os dois métodos de encontrar o MSD e com o máximo de MSD encontrado no parâmetro de nonergodicidade. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. O tempo de defasagem MSDs vs. lag para contas de 0,6 μm na rede vimentina de 19 μM e na rede vimentina de 49 μM são mostrados na Figura 7. Em ambos os casos, o MSD determinou da DDM um bom acordo com o MSD encontrado através do rastreamento de partículas únicas (SPT). Além disso, para a rede menos concentrada, o expoente de escala subdiffusiva (α em ) foi de cerca de 0,9. Isso é consistente com o dimensionamento τ(q) encontrado por montagem do ISF para determinar τ(q) (ou seja, 2/2,2 = 0,9). Para a rede mais concentrada, o MSD planalto em tempos de atraso mais longos. O DMM máximo encontrado analisando a q-dependência do parâmetro de nonergodicidade (mostrado na Figura 7B com a linha horizontal em δ2 = 0,0032 μm2) foi aproximadamente o mesmo valor que os MSDs tanto do SPT quanto do DDM pareciam estar em patamar. Há uma discrepância entre os MSDs de tempo de atraso mais longos determinados a partir de DDM e SPT na Figura 7A. Embora isso possa ser devido a um número limitado de trajetórias de tempo de atraso longo, também pode ser o caso de que otimizar ainda mais a gama de valores q para os quais a matriz DDM é usada para estimar cada tempo de atraso (como feito por Bayles et al.76 e Edera et al.77) melhoraria nossos resultados, e essa otimização será o foco do trabalho futuro. Esses experimentos em que foram registradas sequências de imagens de contas rastreadoras embutidas em uma rede de filamentos intermediários vimentin permitiram análises independentes: DDM (usando o pacote descrito aqui) e SPT (usando trackpy). Ambas as análises podem revelar o grau de subdiffusão e comprimento de confinamento, permitindo que se use duas técnicas independentes de análise de imagem para fornecer métricas complementares. Existem quantidades adicionais que se pode comparar de SPT e DDM. Por exemplo, a heterogeneidade na dinâmica da amostra pode revelar-se como não-gaussianidade na distribuição de deslocamentos de partículas (ou seja, a distribuição van Hove) determinada a partir de SPT, bem como em um ISF determinado a partir de DDM que se encaixa em um exponencialesticado 34,35. A Figura S1 mostra a distribuição van Hove para as partículas de 0,6 μm em redes vimentinas e discute o expoente de alongamento encontrado a partir da montagem dos ISFs — métricas usadas em conjunto em estudos anteriores para demonstrar a dinâmica heterogênea de partículas dentro de sistemas biomiméticos 9,10,47 ou outros ambientes lotados 34 . Como outro exemplo, o ISF pode ser calculado a partir de trajetórias de partículas medidas com SPT e comparadas com os ISFs adquiridos pelo DDM. Embora os deslocamentos médios e distribuições de deslocamento sejam as métricas mais frequentemente retiradas da análise SPT, pode-se também calcular o ISF a partir de trajetórias de partículas, usando (ver Figura S2). Este ISF pode ser comparado com ISFs gerados pelo DDM e usado para revelar dinâmicas não aparentes no MSD59. Embora a aquisição de imagens de partículas rastreadoras dentro de uma rede possa permitir que se use os métodos de análise complementar do SPT e DDM, é importante notar que uma vantagem do DDM sobre o SPT é que ele não requer imagens de contas (ou outras características) que podem ser facilmente localizadas e rastreadas. Para demonstrar este ponto, destacamos em seguida a análise de redes ativas de filamentos de actina e microtúbulos, onde a rotulagem fluorescente de actina e tubulina permite a imagem de ambos os tipos de filamento, distinguidos uns dos outros através de diferentes fluoroforos, com um microscópio confocal de varredura a laser multicolorida. As imagens foram adquiridas com um microscópio confocal de escaneamento a laser de redes actin-microtúbulos com atividade impulsionada pela minosina (myosina do músculo esquelético do coelho II; #MY02 do citoesqueleto). Detalhes dos experimentos e resultados foram descritos anteriormente11, e os resultados representativos aqui mostrados são da análise de dois filmes fornecidos nos materiais suplementares (filmes S1 e S4) para11. Ambas as sequências de imagem foram gravadas em 2,78 quadros/s para 1000 quadros. Para analisar essas imagens, a matriz DDM foi calculada para 50 tempos de atraso que variam de 0,4 s a 252 s (1 quadro a 700 quadros). A matriz DDM foi então adequada ao modelo , sendo a função de dispersão intermediária . Há, portanto, quatro parâmetros de ajuste: A, τ, s e B. Os resultados desses ajustes são mostrados na Figura 8. Observou-se que a matriz DDM para um determinado q-valor tinha um platô em tempos de baixa defasagem, aumentado com o tempo de defasagem, e depois planado (ou mostrou sinais de início ao planalto) em grandes momentos de defasagem. A matriz DDM para os valores mais baixos de q não atingiu um patamar em longos tempos de defasagem. Deve-se, portanto, esperar baixa precisão na medição do tempo de decomposição para essas dinâmicas de baixo q (grande extensão). Os tempos característicos de decomposição, τ, dos ajustes à matriz DDM são mostrados na Figura 9. Os resultados são apresentados para uma rede composta ativa actin-microtúbula (semelhante ao filmeS111) e para uma rede ativa de actin (semelhante ao filme S411). Ambas as redes foram preparadas com as mesmas concentrações de actina e minoína, mas a rede somente actin foi criada sem tubulina, como descrito em11. Para esses dois tipos de redes ativas, a relação de direito de poder observada foi . Este escalonamento indica movimento balístico e que a contração e o fluxo movidos a miosina dominam o movimento térmico dos filamentos. A partir de τ = (vq)-1, foi encontrada uma velocidade característica, v, de cerca de 10 nm/s para a rede ativa actin-microtúbula e 75 nm/s para a rede ativa actin. Esses valores são consistentes com a análise de velocimetria da imagem de partículas dos mesmos vídeos mostrados em11. O dimensionamento não se mantém nos valores q mais baixos para a rede composta actin-microtubule ativa. Isso é provável porque os verdadeiros tempos de decadência para esta rede composta actin-microtúbula nos valores q mais baixos são mais longos do que o tempo máximo de defasagem da matriz DDM computada. O tempo máximo de defasagem é indicado com a linha vermelha horizontal na Figura 9, e os tempos de decomposição desviados do escalonamento esperado perto desses tempos mais longos. Figura 8: Matriz DDM vs. tempo de defasagem para uma rede composta ativa actin-microtúbula. A matriz DDM para vários valores de q é plotada em função do tempo de atraso de um filme de uma rede composta composta de monômeros de actina de 2,9 μM, 2,9 μM de dimers de tubulina e 0,24 μM de micosina. Esses dados mostram a análise apenas do canal microtúbulo de uma série de imagens temporizais multicoloridas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 9: Tempo de decomposição versus número de ondas para redes ativas de actin-microtúbulos. A partir da montagem da matriz DDM, o tempo de decomposição, τ, em função do número de ondas, q, é encontrado. Plotado é τ vs q para imagens de uma rede ativa actin-microtúbula (analisando apenas o canal microtúbulo) em marrom e para imagens de uma rede ativa de actin em verde. Ambas as redes possuem as mesmas concentrações de actina e miosina (2,9 μM e 0,24 μM, respectivamente); o composto actin-microtúbulo tem 2,9 μM de dimers de tubulina. Os tempos de decadência para a rede de actina ativa são muito menores do que os tempos de decomposição para a rede ativa actin-microtúbula, o que indica um movimento mais rápido da rede ativa actin. Em ambos os casos, a dinâmica é balística, pois os dados seguem uma tendência. Inset: o enredo dos ISFs vs. o tempo de atraso escalado pelo número de ondas (Δt × q) mostra um colapso dos ISFs sobre uma faixa de valores q . Isso também indica movimento balístico. Os ISFs mostrados neste início são da rede ativa actin. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Para esses dados de redes ativas, optamos por se encaixar na matriz DDM, . Isso contrasta com o que foi feito para os dados das contas na rede vimentina, onde A (q) e B foram estimados sem qualquer encaixe para isolar o ISF, f (q, Δt). Neste caso, para os dados ativos da rede, A e B foram deixados como parâmetros adequados porque os métodos utilizados para estimar B não resultaram em bons ajustes. O método padrão para estimar B é calcular e assumir que, em geral q, isso vai para B/2. No entanto, esse método superestimou B para esses dados, o que foi visto no fato de que, ao calcular os ISFs de B estimados desta forma (não mostrados), os ISFs foram maiores que 1 em tempos de atraso precoce (enquanto eles devem passar de um máximo de 1 para zero ou algum parâmetro de nonergodicidade com tempo de atraso crescente). Pode-se selecionar outros métodos para estimar B usando o parâmetro background_method. Um desses outros métodos é estimar B como o mínimo da matriz DDM em tempos de atraso precoce (definido com background_method=1). Um método semelhante foi utilizado por Bayles et al.76, embora não assumissem que B era constante com q. Outra opção é estimar B como o valor médio sobre todos os tempos de defasagem da matriz DDM no máximo q (definido com background_method=2). Estes diferentes métodos para estimar o fundo, bem como os resultados para permitir que B seja um parâmetro de montagem livre, são mostrados na Figura 10. A partir dessas parcelas, pode-se ver que a amplitude, A, não atingiu zero nos maiores valores q sondados, uma vez que não platô em grande q (Figura 10B), e desde D(qmax, Δt) passou de um planto de lag mais baixo para algum planalto de tempo de lag mais alto (ou seja, no q max, não havia um A não-zero; Figura 10D). Portanto, nem estimar B como nem como seria apropriado. Deve-se inspecionar vs. q e D(qmax, Δt) vs. Δt antes de decidir como (ou se) estimar B. Figura 10: Número de antecedentes vs. ondas para redes ativas de actin-microtúbulos. A partir da montagem da matriz DDM, pode-se encontrar o fundo, B, em função do número de ondas, q. Mostrado é B vs. q para imagens de uma rede ativa actin-microtúbula (analisando apenas o canal microtúbulo) determinado a partir desses ajustes com os símbolos roxos. As três linhas sólidas em (A) mostram estimativas do fundo encontrado sem qualquer encaixe. A linha superior, mais escura em (A) mostra o fundo estimado usando , o que pode ser apropriado se planaltos a um valor constante em geral q. A partir (B), nota que ainda não atingiu um valor constante no maior q sondado. Portanto, o uso deste método superestima o fundo. A linha de fundo em (A) mostra o fundo estimado usando . Se a matriz DDM mostrar um platô de tempo de atraso baixo como mostrado em (C) com a linha vermelha, então este método pode ser apropriado para estimar o fundo. A linha média e mais clara em (A) mostra o fundo estimado de . Este método pode ser apropriado se, no q max, a amplitude, A, atingiu zero. A partir de (D), vê-se que a amplitude não é zero e, portanto, este método superestima o fundo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura suplementar S1: Distribuições de probabilidades de deslocamentos de partículas. As distribuições de probabilidades de deslocamentos de partículas mostram não gaussianidade para concentrações de vimentina de 34 μM e 49 μM. O rastreamento de partículas únicas de 0,6 μm de diâmetro foi realizado em redes de vimentinas de diferentes concentrações. Diferentes tempos de atraso são mostrados nas distribuições de deslocamento para as três condições. (A) A distribuição de deslocamentos de partículas em uma rede de vimentina de 19 μM está adequada a uma função gaussiana. A largura do gaussiano aumenta com o aumento do tempo de atraso. (B) A distribuição de deslocamentos de partículas em uma rede de vimentina de 34 μM mostra mais não gaussianidade, especialmente em grandes deslocamentos, do que no caso de 19 μM. (C) A distribuição de deslocamentos de partículas em uma rede de vimentina de 49 μM também mostra não gaussianity. Além disso, as larguras das distribuições não aumentam com o tempo de defasagem tão significativamente quanto nas amostras com concentrações de vimentina mais baixas, indicando movimento confinado. As distribuições não gaussianas van Hove (vistas para todas as amostras de vimentina, mas mais aparentes nas concentrações mais altas) estão associadas à dinâmica heterogênea, como frequentemente visto no transporte de partículas em ambientes lotados e confinados. Outro indicador de transporte heterogêneo que é determinado a partir da análise DDM é o expoente de alongamento usado para se encaixar na função de dispersão intermediária (o parâmetro s na equação para o ISF utilizado aqui: + ). Os expoentes médios de alongamento ao longo da faixa q de 0,4 μm-1 a 9,4 μm-1 são, da maior concentração vimentina para menor, 0,53 ± 0,07, 0,64 ± 0,02 e 0,86 ± 0,04 (média ± desvio padrão). Clique aqui para baixar este Arquivo. Figura suplementar S2: As funções de dispersão intermediárias da DDM e da SPT. As funções de dispersão intermediária (ISF) para cinco diferentes números de ondas são mostradas. O tempo de isf versus lag encontrado através do DDM é plotado com marcadores circulares, e o ISF computado a partir de trajetórias de partículas únicas com quadrados abertos. Linhas pretas pontilhadas mostram os ajustes nos ISFs adquiridos pelo DDM. O ISF é calculado a partir de trajetórias de partículas únicas, utilizando . Em (A), o ISF é mostrado para partículas de 0,6 μm nas redes de vimentina de 19 μM. Em (B), o ISF é mostrado para partículas de 0,6 μm nas redes de vimentina de 34 μM. As discrepâncias no ISF encontradas no DDM e no SPT são provavelmente devido a um número limitado de trajetórias de tempo de atraso longo. Clique aqui para baixar este Arquivo. Arquivo Complementar 1: Protocolo para o uso de DDM. A entrada e saída das etapas mostradas no protocolo são apresentadas. Clique aqui para baixar este Arquivo. Arquivo complementar 2: Detalhes da preparação da amostra e arquivos de parâmetros de exemplo para redes vimentinas. São fornecidas etapas detalhadas para preparação de amostras e aquisição de imagens em redes vimentinas. Além disso, também é fornecido um arquivo de parâmetros de exemplo para a análise dos dados apresentados na seção de resultados representativos em redes vimentin. Clique aqui para baixar este Arquivo.