微分動的顕微鏡を用いた細胞骨格ダイナミクスの定量化

ここでは、2つの異なる実験セットからPyDDMで行われた分析の例を示します。1組の実験では、サブミクロントレーサービーズを中間フィラメントタンパク質ビメンチンからなるネットワークに埋め込み、明視野モードで100倍対物レンズを使用して100フレーム/秒でイメージングしました(図3A)。ビメンチンは間葉系細胞で発現され、細胞質65の機械的特性および閉じ込められた遊走を行う細胞における核の機械的安定性の重要な決定因子である66、67。これまでのところ、再構成されたビメンチンネットワークは、主に巨視的レオロジー64、68、69によって研究されてきたが、一方、ダイナミクスは比較的ほとんど注目されていない13、70、71。これらの実験の詳細については、補足ファイル2を参照してください。他の一連の実験では、活性細胞骨格ネットワークをアクチン、微小管、およびミオシンで調製した。スペクトル的に異なる蛍光標識により、アクチンフィラメントと微小管フィラメントを、2.78フレーム/秒の60倍対物レンズを使用して2色レーザー走査共焦点顕微鏡でイメージングすることができました(図3B,C)。アクチンフィラメントと微小管フィラメントは、いずれも動的細胞形状変化の重要な駆動因子であり、それらの作用は機械的および生化学的相互作用によって調整される72。これらの実験のさらなる詳細は、11に記載される。これらの実験で撮影した画像シーケンスからの個々のフレームを図3に示す。 図3:解析した時系列からの画像(A)ビメンチンネットワークにおける0.6μmビーズの明視野画像。(B,C)レーザー走査型共焦点顕微鏡で60倍対物レンズで撮影した活性アクチン-微小管複合体中の(B)微小管および(C)アクチンの画像は、微小管イメージングに561nm励起光を使用し、アクチンイメージングに488nm励起光を使用した。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 ビメンチンネットワーク内のトレーサービーズの画像については、100フレーム/秒で512 x 512ピクセルのサイズの5000フレームのムービーが記録されました。これらから、DDM行列は、1〜1000フレーム、または0.01秒〜10秒の間の60対数間隔のラグタイムで計算されました。背景を推定するために、B、フーリエ変換された画像の二乗の平均を計算し、55、73に等しいように設定した。q値の最大10%以上で、この量はB / 2に等しく、Bはqから独立しているという仮定がなされました。これは B を推定するためのパッケージのデフォルトの方法ですが、background_method パラメーターを別の値に設定することで、他の方法も可能です。 パラメータA(q)とBを から決定すると、DDM行列から中間散乱関数(ISF)を抽出できます。ISF の例を図 4 に示します。図4Aでは、19 μMのビメンチン濃度を有するネットワークに埋め込まれた直径0.6 μmビーズの画像からのISFが示されている。図4Bでは、34μMのビメンチン濃度を有するネットワーク内の同種のビーズについてのISFが示されている。興味深いことに、どちらの場合もISFはゼロに減衰しませんでした。大きなラグタイムでは、ISFはエルゴード系ではゼロに近づくはずです。つまり、このようなシステムでは、密度変動は大きなラグタイムにわたって完全に相関関係を解消する必要があります。ここでのISFがゼロに減衰しなかったという事実は、計算されたDDM行列からISFを見つけるために使用されたA(q)とBの不正確な推定値に起因する可能性があります。注目すべきことに、ここで用いられる方法は、特定のシナリオ62においてBを過大評価し得る。しかし、トレーサービーズのダイナミクスは、ビーズがネットワークメッシュサイズに匹敵するサイズを有し、したがってケージ状になる可能性があるため、真に非エルゴードである可能性が高い。他のデータは、非人間性の発見を裏付けた。すなわち、ビーズサイズ0.6μmは、19μM濃度で0.4μm、34μM濃度で0.3μmのメッシュサイズで計算された平均値よりも大きかった。さらに、後に示すこれらのトレーサービーズの単一粒子追跡の結果も、限られた動きを示しました。 図4:ビメンチンネットワークのいくつかの波数における中間散乱関数。ISFは、約1〜9μm−1のq値のラグタイムの関数としてプロットされる。(A)ビメンチン濃度19 μMのビメンチンネットワークにおける0.6 μmビーズの画像からのISF。(B)ビメンチン濃度34 μMのビメンチンネットワークにおける0.6 μmビーズの画像からのISF。ゼロをはるかに上回る値でのISFの長いラグタイムプラトーは、非人間性を示します。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 ダイナミクスが非人間性である可能性が高いことを考えると、ISFは の形に適合します 、ここでCは非人間性因子32です。ISFのこの形態は、アクチン微小管ネットワーク10におけるコロイドゲル32、74またはトレーサー粒子のそれのような非エルゴードダイナミクスの以前の研究において使用されてきた。図4の黒い点線は、適合度とデータを示しています。これらの適合から、崩壊時間τと非人間性パラメータCのq依存性を見ることができます。 図5:ビメンチンネットワークの減衰時間と波数適合からISFまで、減衰時間τはq値の範囲について決定されます。わかりやすくするために、すべてのqのτの値を示すのではなく、対数的に間隔を空けた集合のみを示しています。青色(黄褐色)は、ビメンチン濃度が19 μM(34 μM)のビメンチンネットワーク内の0.6 μmビーズの画像からのデータです。エラーバーは、複数のムービー(19 μMネットワーク[青]のデータの場合は4つのムービー、34 μMネットワーク[tan]のデータの場合は5つのムービー)にわたるτの標準偏差を表します。赤い破線は、結果に記載されているように、時間的および空間的分解能の推定境界を示します。黒い実線は拡大縮小を示し、拡散運動を示します。どちらのデータ・セットもこのスケーリングに従っていません。むしろ、19 μMネットワーク内のビーズは拡散下運動(β> 2)を示し、34 μMネットワーク内のビーズは閉じ込められた動きまたはケージの動きを示します。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 図5に示すように、減衰時間は、低いqと高いqの両極端の両方で、大量の不確実性を示しました。このプロットのエラーバーは、ビメンチン濃度が低いケースで分析された4つのビデオ、または高濃度で分析された5つのビデオの標準偏差を示しています。これらの極端における大きな不確実性の原因を理解するには、時間分解能と空間分解能の両方を考慮してください。解像度のおおよその限界は、3本の赤い破線で示されています。2 本の水平線は、プローブされた最小ラグ タイムと最大ラグ タイムに対応します。100 frames/s のフレームレートと 1000 フレームに対応する最大ラグタイム(ビデオ全体の 20%)を考えると、0.01 秒より速く発生するダイナミクスまたは 10 秒より遅く発生するダイナミクスを測定すると、精度が失われました。低いq値では、τの適合値は10秒より大きかった。したがって、最大ラグタイムよりも大きい減衰時間には大きな不確実性が予想されます。qレンジの上限では、減衰時間は最小ラグタイムの0.01秒に近づいたが、それを超えるままであった。時間分解能によって制限されるのではなく、これらのより高いq値では、空間分解能が制限要因となり得る。0.13 μmのピクセルサイズを考えると、qの最大値は約24 μm-1でした。しかし、回折制限分解能は、必ずしもこれらの高い空間周波数におけるダイナミクスの正確な測定を可能にするものではない。光学分解能を次のように近似すると、対物レンズの開口数NAが1.4、光の波長が与えられると、波数の上限は約16μm-1になります。これは、図 5 の縦の赤い破線で示されています。実際、データはqの大きな値でノイズが多かった。qのこのおおよその上限の前でさえ、τの不確実性の増加が見られ、これはqmaxを過大評価することによるものであった可能性がある。予想よりも光学解像度が低いのは、油浸レンズを使用してカバースリップを越えて水性サンプルに画像化した場合や、集光レンズの位置が不完全だったことが原因である可能性があります。 低濃度ネットワーク(19 μM vimentin)に埋め込まれた0.6 μmビーズについては、減衰時間対波数の対数プロットから、減衰時間がべき乗則と一致する方法で波数とともに減少したことが観察できます(図5)。しかし、通常の拡散運動に期待されるものに従っていないようです。むしろ、τはqの増加とともにより急激に減少した。これは、このような混雑した環境でビーズに対してしばしば発生する亜拡散運動を示すものである。1.4 μm-1 ~ 12.3 μm-1 の範囲にわたって τ(q) を τ = 1/Kq の形式のべき乗則に当てはめると、 輸送パラメータ K = 0.0953 μm β/ s および β = 2.2 βが得られます。トレーサー粒子の平均二乗変位(MSD)をラグタイムの関数(すなわち、MSD = K’Δt α)の観点から通常の拡散対部分拡散について考えることに慣れている人にとっては、MSD方程式における部分拡散スケーリング指数αは、α = 2 / βと等価であることを認識することは有用である。つまり、β = 2.2 の値は、α = 0.9 の MSD 方程式のサブディフューズ スケーリング指数と一致します。この範囲の q 値に τ(q) を収めるように PyDDM を設定するには、YAML ファイルでGood_q_rangeパラメータを持つか、オプションの引数 forced_qs を関数 generate_fit_report に渡すことによって、q の配列のインデックスを指定します。1.4 μm-1 から 12.3 μm-1 までの q の範囲は、ここでのデータでは、15 から 130 までの q の配列のインデックスに対応します。 より濃縮されたネットワーク(34 μM)の0.6 μmビーズの場合、減衰時間はqにほとんど依存しませんでした。これは、メッシュサイズが小さいネットワーク内のビーズの非人間性に起因する可能性があります。このシステムで非エルゴディシティを調べるには、図6に示すように、非エルゴディシティパラメータCをqの関数としてプロットする必要があります。19 μM ビメンチンネットワーク内の 0.6 μm ビーズの場合、C ≈ 0.2 で、q (図示せず) にほとんど依存しません。しかし、34 μM ビメンチンを含むネットワーク、およびさらに高濃度の 49 μM ビメンチンを含むネットワークでは、図 6 に示すように、C の対数は q2 に比例しました。Cとqの間のこの関係は、限られた動きのために期待される。ネットワークのポケット内に閉じ込められたビーズの場合、MSDは十分なラグタイムでプラトーすると予想されます(すなわち、MSDはMSDであり、δ2は最大MSDです)。ISFはMSDの観点から、 として表すことができ、非エルゴードISFは長いラグタイム(すなわち、)でCに行くので、関係は32,75が得られる。したがって、C(q)を使用してδ2を見つけることができ、これにより、それぞれ34および49μMのビメンチンネットワークに対してδ 2 = 0.017 μm2および0.0032μm2が得られました(δ = 0.13 μmおよび0.057 μmに相当)。 図6:非人間性パラメータ対ビメンチンネットワークの波数。適合からISFまで、非人間性パラメータCはq値の範囲について決定されます。黄褐色(赤)は、ビメンチン濃度が34 μM(49 μM)のビメンチンネットワーク内の0.6 μmビーズの画像からのデータです。エラーバーは、複数のムービー(34 μM ネットワーク[tan]のデータでは 5 つのムービー、49 μM ネットワークのデータでは 4 つのムービー [赤])にわたる標準偏差を τ で表しています。Y 軸には対数スケーリングがあります。1つは、 に続くCのq依存性を観察し、最大平均二乗変位を抽出するこδが可能になり、2である。適合先は実線で示されます。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 他の方法を使用して、データからδ閉じ込めサイズと、19μMビメンチンネットワーク内のビーズのτ(q)を調べることから得られた亜拡散指数を抽出することができます。第一に、Bayles et al.76およびEdera et al.77によって記述された方法を使用して、DDMマトリックスからMSDを抽出することができる。特に、この方法では DDM 行列のフィッティングは必要ありません。DDM行列D(q、Δt)、および(A(q)とBを決定することができる)を計算するだけで済みます。次に、MSD を見つけるには、 関係 を使用します。MSD を求めるこの方法は、粒子変位の分布がガウス分布であることを前提としていますが、以前の研究では、変位が非ガウス73 の場合でも、DDM から派生した MSD が粒子追跡の MSD と一致する場合があることが示されています。このシステムの場合、予想78のように、図S1に見られるように、大きな変位の分布には非ガウス性があります。PyDDM パッケージでは、関数extract_MSD を実行する必要があり、 が返されます。第二に、単一粒子追跡を使用してMSDを見つけることができます。DDMは、粒子の高密度化や限られた光学分解能が正確な粒子局在化を阻害する画像の解析にも使用できますが、ビメンチンネットワーク内の0.6μmビーズの画像では、trackpyソフトウェア(https://github.com/soft-matter/trackpy)79を使用してビーズの局在化と追跡を行うことができました。この粒子追跡ソフトウェアパッケージは、CrockerとGrier80によって記述されたアルゴリズムを使用します。 図7:ビメンチンネットワークの平均二乗変位対ラグタイム。 MSDを2つの方法を用いて測定した。まず、MSDはDDMマトリックス(実線の記号で示されている)から計算されました。次に、単一粒子追跡(SPT)を使用して粒子軌道(オープンシンボル)を見つけることによってMSDを決定した。エラー バーは、前の 2 つの図の凡例で説明したのと同じ方法で決定されます。(A) 19 μM ビメンチンネットワーク内の 0.6 μm ビーズの MSD は、拡散下運動を示し、MSD を見つける 2 つの方法の間でよく一致しています。(B) 49 μM ビメンチンネットワーク内の 0.6 μm ビーズの MSD はケージの動きを示し、MSD を見つける 2 つの方法と非人間性パラメータから見つかった最大 MSD との間でよく一致します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 19 μM ビメンチン ネットワークおよび 49 μM ビメンチン ネットワークにおける 0.6 μm ビーズの MSD 対ラグ タイムを図 7 に示します。どちらの場合も、DDMから決定されたMSDは、単一粒子追跡(SPT)によって見出されたMSDとよく一致した。さらに、集中度の低いネットワークの場合、亜拡散スケーリング指数(α in )は約0.9であった。これは、τ(q) を決定するために ISF を当てはめることによって見出された τ(q) スケーリングと一致します (つまり、2/2.2 = 0.9)。より集中したネットワークの場合、MSDはより長いラグタイムでプラトーする。非人間性パラメータのq依存性(図7Bにδ 2 = 0.0032 μm2の水平線で示されている)を分析することによって得られた最大MSDは、SPTとDDMの両方のMSDが頭打ちになっているように見える値とほぼ同じ値でした。図 7A の DDM と SPT から決定された最長ラグ タイム MSD の間には矛盾があります。これは、長いラグタイム軌道の数が限られているためかもしれませんが、DDM行列が各ラグタイムの推定に使用されるq値の範囲をさらに最適化することで(Bayles et al.76およびEdera et al.77によって行われたように)、結果が改善される場合もあります。 そして、そのような最適化は将来の仕事の焦点になるでしょう。 ビメンチン中間フィラメントのネットワークに埋め込まれたトレーサービーズの画像配列を記録したこれらの実験では、DDM(ここに記載されているパッケージを使用)とSPT(trackpyを使用)の独立した分析が可能になりました。どちらの解析でも、亜拡散と閉じ込めの長さの程度を明らかにすることができ、2つの独立した画像解析技術を使用して補完的なメトリックを提供することができます。SPT と DDM から比較できる追加の数量があります。例えば、サンプルのダイナミクスにおける不均一性は、SPTから決定される粒子変位の分布(すなわち、van Hove分布)における非ガウス性、ならびに伸張指数34,35に適合するDDMから決定されたISFにおいて、それ自体を明らかにすることができる。図S1は、ビメンチンネットワークにおける0.6μm粒子のvan Hove分布を示し、ISFのフィッティングから見出された伸張指数(バイオミメティックシステム9、10、47または他の混雑した環境内の粒子の不均一なダイナミクスを実証するために以前の研究で並行して使用されたメトリック)について論じる34.別の例として、ISFは、SPTで測定された粒子軌道から計算され、DDMで取得されたISFと比較することができる。平均二乗変位と変位分布は、SPT 解析から最も頻繁に取得されるメトリックですが、(図 S2 を参照) を使用して、粒子の軌跡から ISF を計算することもできます。この ISF は、DDM によって生成された ISF と比較することができ、MSD59 では明らかではないダイナミクスを明らかにするために使用されます。 ネットワーク内のトレーサー粒子の画像を取得することで、SPTとDDMの相補的な分析方法を使用できるようになりますが、SPTに対するDDMの利点は、簡単に局在化および追跡できるビーズ(または他の特徴)の画像を必要としないことに注意することが重要です。この点を実証するために、アクチンと微小管フィラメントの活性ネットワークの分析に焦点を当て、アクチンとチューブリンの蛍光標識により、多色レーザー走査共焦点顕微鏡を使用して、異なる蛍光色素を介して互いに区別される両方のフィラメントタイプのイメージングが可能になります。 画像は、ミオシンによって駆動される活性を有するアクチン – 微小管ネットワークのレーザー走査型共焦点顕微鏡を用いて取得された(ウサギ骨格筋ミオシンII;細胞骨格#MY02)。実験の詳細及び結果は、既に図11で説明したが、ここに示した代表的な結果は、11の補足資料に用意された2つの動画(動画S1及びS4)の分析によるものである。両方の画像シーケンスは、1000フレームに対して2.78フレーム/秒で記録された。 これらの画像を解析するために、DDM行列を0.4秒から252秒(1フレームから700フレーム)の範囲の50ラグタイムで計算しました。次に、DDM 行列をモデルに適合させ、中間散乱関数を .したがって、適合パラメータには、A、τ、s、B の 4 つがあります。これらの適合の結果を図8に示します。特定のq値のDDMマトリックスは、低いラグタイムでプラトーを有し、ラグタイムとともに増加し、その後、大きなラグタイムでプラトー化した(またはプラトーに始まる兆候を示した)ことが観察された。q の下位値に対する DDM 行列は、長いラグタイムでプラトーに達しませんでした。したがって、これらの低いq(大きな長さスケール)ダイナミクスの減衰時間の測定における精度が低いことが予想されます。 DDM行列への適合値からの特性減衰時間τを図9に示します。結果は、活性アクチン-微小管複合ネットワーク(映画S1 11に類似)および活性アクチンネットワーク(映画S411に類似)について提示される。両方のネットワークは、同じ濃度のアクチンおよびミオシンで調製したが、11に記載されるように、アクチンのみのネットワークがチューブリンなしで作成された。これら 2 種類のアクティブ ネットワークについて、観測されたべき乗則関係は でした。このスケーリングは、弾道運動を示し、ミオシン駆動の収縮と流れがフィラメントの熱運動を支配することを示しています。τ = (vq)-1 から、能動アクチン-微小管ネットワークでは約 10 nm/s、能動アクチンネットワークでは 75 nm/s の特徴的な速度 v が見出された。これらの値は、11に示された同じビデオの粒子画像速度測定分析と一致する。スケーリングは、アクティブなアクチン-微小管複合ネットワークのより低いq値では成り立たなかった。これは、低いq値におけるこのアクチン-微小管複合ネットワークの真の減衰時間が、計算されたDDM行列の最大ラグタイムよりも長いことが原因である可能性があります。最大ラグ タイムは図 9 の水平の赤い線で示されており、減衰時間はこれらの長い時間の近くで予想されるスケーリングから逸脱しています。 図8:アクティブなアクチン-微小管複合ネットワークのDDMマトリックス対ラグタイム。qのいくつかの値に対するDDMマトリックスは、2.9μMアクチンモノマー、2.9μMチューブリン二量体、および0.24μMミオシンからなる複合ネットワークのムービーからのラグタイムの関数としてプロットされる。これらのデータは、多色時系列画像の微小管チャネルのみの解析を示している。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 図9:アクティブなアクチン-微小管ネットワークの減衰時間と波数DDM行列を当てはめることから、波数の関数としての減衰時間τqが見出される。 プロットされたτ vs qは、アクティブなアクチン-微小管ネットワークの画像(微小管チャネルのみを解析)の画像を茶色で、アクティブなアクチンネットワークの画像については緑色でプロットされています。両方のネットワークは、アクチンおよびミオシンの同じ濃度(それぞれ2.9μMおよび0.24μM)を有する。アクチン-微小管複合体は、2.9μMのチューブリン二量体を有する。活性アクチンネットワークの減衰時間は、活性アクチン – 微小管ネットワークの減衰時間よりもはるかに小さく、これは活性アクチンネットワークのより速い運動を示す。どちらの場合も、データがトレンドに従うため、ダイナミクスは弾道的です。インセット: ISFのプロットと、波数(Δt × q)でスケーリングされたラグタイムは、q値の範囲にわたるISFの崩壊を示しています。 これは弾道運動も示しています。このインセットに示されている ISF は、アクティブなアクチン ネットワークからのものです。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 アクティブなネットワークのこのデータに対して、DDM マトリックス (.これは、ビメンチンネットワーク内のビーズのデータに対して行われたこととは対照的であり、そこでは、ISF、f(q、Δt)を単離するための適合なしにA(q)およびBが推定された。この場合、アクティブなネットワークデータについては、Bの推定に使用された方法では良好な適合が得られなかったため、AとBが適合パラメータとして残されました。B を推定するデフォルトの方法は、計算し、qが大きいとB/2になると仮定することです。しかし、この方法は、このデータについてBを過大評価しており、これは、この方法で推定されたBからISFを計算するとき(図示せず)、ISFが早期のラグタイムで1より大きかったという事実に見られる(一方、ラグタイムが増加すると、最大1からゼロまたは非人間性パラメータのいずれかに移動すべきである)。パラメータbackground_methodを使用してBを推定するための他の方法を選択できます。これらの他の方法の1つは、早期ラグタイム(background_method=1で設定)におけるDDM行列の最小値であるとBを推定することです。Bayles et al.76も同様の方法を用いたが、Bがqで一定であるとは想定していなかった。もう 1 つの選択肢は、B を最大 q (background_method=2 で設定) における DDM 行列のすべてのラグ・タイムの平均値と推定することです。背景を推定するためのこれらの異なる方法、およびBを自由フィッティングパラメータにするための結果を図10に示す。これらのプロットから、振幅Aは、大きなqでプラトーではなかったため(図10B)、D(qmax、Δt)が低いラグタイムプラトーからいくつかの高いラグタイムプラトー(すなわち、qmaxでは、ゼロ以外のAがあった)に行ったため、プローブされた最大のq値でゼロに達しなかったことがわかります。図10D)。したがって、Bを推定することも、そのように推定することも適切ではありません。Bを推定する方法(または推定する場合)を決定する前に、対qおよびD(qmax、Δt)対Δtを調べる必要があります。 図10:アクティブなアクチン-微小管ネットワークの背景と波数DDM行列を当てはめることから、波数qの関数として背景Bを見つけることができます。これらから決定されたアクティブなアクチン – 微小管ネットワーク(微小管チャネルのみを分析する)の画像が紫色のシンボルと適合する場合のB 対qが示されている 。(A) の 3 本の実線は、フィッティングなしで見つかった背景の推定値を示しています。(A)の一番上の最も濃い線は、を用いて推定された背景を示しており、これは、プラトーが大きなqで一定の値にすれば適切であり得る。(B)から、プローブされた最大のqで定数値にまだ達していないことに注意。したがって、この方法を使用すると、背景が過大評価されます。(A)の一番下の行は、を使用して推定された背景を示しています。DDM 行列が (C) のように低ラグ タイム プラトーを赤い線で示す場合、この方法は背景の推定に適している可能性があります。(A)の中央の最も明るい線は、 から推定された背景を示しています。この方法は、qmaxで振幅Aがゼロに達した場合に適切です。(D)から、振幅がゼロではないため、この方法はバックグラウンドを過大評価していることがわかります。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 補足図S1:粒子変位の確率分布。粒子変位の確率分布は、34 μMおよび49 μMのビメンチン濃度について非ガウス性を示し、直径0.6 μmのビーズの単一粒子追跡を、異なる濃度のビメンチンネットワークで実施した。異なるラグタイムは、3つの条件の変位分布に示されています。(A)19μMのビメンチンネットワークにおける粒子変位の分布は、ガウス関数と適合する。ガウスの幅は、ラグタイムの増加とともに増加します。(B)34μMのビメンチンネットワークにおける粒子変位の分布は、特に大きな変位において、19μMの場合よりも非ガウス性を示す。(C)49μMのビメンチンネットワークにおける粒子変位の分布も非ガウス性を示す。さらに、分布の幅は、ビメンチン濃度の低いサンプルほどラグタイムとともに有意に増加せず、限られた動きを示しています。非ガウス・ヴァン・ホーブ分布(すべてのビメンチンサンプルに見られるが、高濃度で最も明白)は、混雑した閉じ込められた環境での粒子の輸送によく見られるような不均一なダイナミクスと関連している。DDM 分析から決定される異種輸送のもう 1 つの指標は、中間散乱関数を適合させるために使用されるストレッチ指数です (ここで使用される ISF の式のパラメーター s : +)。0.4 μm-1 ~ 9.4 μm-1 の q 範囲における平均延伸指数は、ビメンチン濃度の高いものから最も低いものまで、0.53 ± 0.07、0.64 ± 0.02、および 0.86 ± 0.04 (標準偏差±平均) です。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。 補足図 S2: DDM および SPT からの中間散乱機能。5つの異なる波数の中間散乱関数(ISF)を示します。DDM によって検出された ISF 対ラグ タイムは円形マーカーでプロットされ、ISF は開いた正方形の単一粒子軌道から計算されます。黒い点線は、DDM で獲得した ISF への適合を示します。ISF は、 を使用して、単一粒子の軌道から計算されます。(A)では、19 μM ビメンチンネットワーク内の 0.6 μm 粒子について ISF が示されています。(B)では、34 μM ビメンチンネットワーク内の 0.6 μm 粒子についてISF を示します。DDM と SPT から見つかった ISF の不一致は、ラグ タイムの長い軌道の数が限られていることが原因である可能性があります。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。 補足ファイル 1: DDM を使用するためのプロトコル。 プロトコルに示されているステップの入力と出力が表示されます。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。 補足ファイル2:ビメンチンネットワーク用のサンプル調製およびサンプルパラメータファイルの詳細。 ビメンチンネットワーク上でのサンプル調製と画像取得のための詳細な手順が提供されます。さらに、ビメンチンネットワーク上の代表的な結果セクションに提示されるデータの分析のためのサンプルパラメータファイルも提供される。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。