Quantifizierung der Zytoskelettdynamik mittels differentieller dynamischer Mikroskopie

Hier zeigen wir Beispiele für die Analyse, die mit PyDDM aus zwei verschiedenen Experimenten durchgeführt wurde. In einer Reihe von Experimenten wurden Submikron-Tracer-Perlen in Netzwerke eingebettet, die aus dem Zwischenfilamentprotein Vimentin bestanden, und mit einer 100-fachen Objektivlinse im Hellfeldmodus bei 100 Bildern/s abgebildet (Abbildung 3A). Vimentin wird in mesenchymalen Zellen exprimiert und ist eine Schlüsseldeterminante für die mechanischen Eigenschaften des Zytoplasmas 65 und die mechanische Stabilität des Zellkerns in Zellen, die eine begrenzte Migrationdurchführen 66,67. Bisher wurden rekonstituierte Vimentin-Netzwerke hauptsächlich durch makroskopische Rheologieuntersucht 64,68,69, während die Dynamik vergleichsweise wenig Beachtung gefunden hat 13,70,71. Weitere Einzelheiten zu diesen Experimenten finden Sie in der Ergänzungsdatei 2. In den anderen Experimenten wurden aktive Zytoskelettnetzwerke mit Aktin, Mikrotubuli und Myosin hergestellt. Spektral unterschiedliche Fluoreszenzmarkierungen ermöglichten die Aufnahme der Aktin- und Mikrotubuli-Filamente mit einem zweifarbigen Laser-Scanning-Konfokalmikroskop unter Verwendung einer 60-fachen Objektivlinse bei 2,78 Bildern / s (Abbildung 3B, C). Aktin- und Mikrotubuli-Filamente sind beide wichtige Treiber dynamischer Zellformveränderungen, deren Wirkung durch mechanische und biochemische Wechselwirkungen koordiniert wird72. Weitere Details zu diesen Experimenten finden Sie in11. Einzelne Frames aus Bildsequenzen, die in diesen Experimenten aufgenommen wurden, sind in Abbildung 3 dargestellt. Abbildung 3: Bilder aus der analysierten Zeitreihe . (A) Hellfeldbild von 0,6 μm Perlen in einem Vimentin-Netzwerk. (B,C) Abbildung der (B) Mikrotubuli und (C) Aktin in einem aktiven Aktin-Mikrotubuli-Komposit, aufgenommen mit einem 60-fachen Objektiv auf einem konfokalen Laser-Rastermikroskop unter Verwendung von 561 nm Anregungslicht für die Mikrotubuli-Bildgebung und 488 nm Anregungslicht für die Aktin-Bildgebung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Für Bilder von Tracerperlen in Vimentin-Netzwerken wurden Filme von 5000 Bildern mit einer Größe von 512 x 512 Pixeln bei 100 Bildern/s aufgenommen. Aus diesen wurde die DDM-Matrix mit 60 logarithmisch verteilten Verzögerungszeiten zwischen 1 und 1000 Frames oder 0,01 s und 10 s berechnet. Um den Hintergrund zu schätzen, wurde B, der Mittelwert der quadrierten Fourier-transformierten Bilder, berechnet und auf 55,73 gesetzt. Es wurde angenommen, dass über die größten 10% der q-Werte diese Menge gleich B/2 ist und dass B unabhängig von q ist. Dies ist die Standardmethode des Pakets zum Schätzen von B, aber andere Methoden sind möglich, indem der Parameter background_method auf einen anderen Wert festgelegt wird. Mit den aus ermittelten Parametern A(q) und B kann man die Zwischenstreufunktion (ISF) aus der DDM-Matrix extrahieren. Beispiele für ISFs sind in Abbildung 4 dargestellt. In Abbildung 4A ist der ISF aus Bildern von Perlen mit einem Durchmesser von 0,6 μm dargestellt, die in ein Netzwerk mit einer Vimentinkonzentration von 19 μM eingebettet sind. In Abbildung 4B ist der ISF für die gleiche Art von Perlen in einem Netzwerk mit einer Vimentinkonzentration von 34 μM dargestellt. Interessanterweise ist der ISF in keinem der beiden Fälle auf Null gesunken. In großen Verzögerungszeiten sollte sich der ISF für ergodische Systeme Null nähern. Das heißt, in solchen Systemen sollten Dichteschwankungen über große Verzögerungszeiten vollständig dekorrelieren. Die Tatsache, dass der ISF hier nicht auf Null zerfiel, könnte aus ungenauen Schätzungen von A(q) und B resultieren, die verwendet wurden, um den ISF aus der berechneten DDM-Matrix zu finden. Insbesondere kann die hier angewandte Methode B in bestimmten Szenarien62 überschätzen. Es ist jedoch wahrscheinlicher, dass die Dynamik der Tracer-Perlen wirklich nicht ergodisch ist, da die Perlen eine vergleichbare Größe wie die Netzwerkmaschenweite haben und daher eingesperrt werden können. Andere Daten bestätigten die Feststellung der Nichtergodizität. Die Perlengröße von 0,6 μm war nämlich größer als der berechnete Durchschnittswert für die Maschenweiten von 0,4 μm für die 19 μM-Konzentration und 0,3 μm für die 34-μM-Konzentration. Darüber hinaus zeigten die Ergebnisse der Einzelpartikelverfolgung dieser Tracer-Perlen, die später gezeigt werden, auch eine begrenzte Bewegung. Abbildung 4: Zwischenstreufunktionen bei mehreren Wellenzahlen für Vimentin-Netzwerke. Der ISF wird als Funktion der Verzögerungszeit für q-Werte von etwa 1 bis 9 μm-1 dargestellt. (A) Die ISF aus Bildern von 0,6 μm-Kügelchen in einem Vimentin-Netzwerk mit einer Vimentin-Konzentration von 19 μM. (B) Die ISF aus Bildern von 0,6 μm-Perlen in einem Vimentin-Netzwerk mit einer Vimentin-Konzentration von 34 μM. Das lange Lag-Time-Plateau des ISF bei einem Wert deutlich über Null deutet auf Nichtergodizität hin. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Da die Dynamik wahrscheinlich nicht ergodisch ist, sind die ISFs an die Form angepasst, wobei C der Nichtergodizitätsfaktor 32 ist. Diese Form des ISF wurde in früheren Studien zur nicht-ergodischen Dynamik verwendet, wie z.B. der von kolloidalen Gelen32,74 oder Tracerpartikeln in Aktin-Mikrotubuli-Netzwerken 10. Die gepunkteten schwarzen Linien in Abbildung 4 zeigen die Anpassungen zusammen mit den Daten. Aus diesen Anpassungen kann man nun die q-Abhängigkeit der Zerfallszeit τ und des Nichtergodizitätsparameters C betrachten. Abbildung 5: Abklingzeit vs. Wellenzahl für Vimentin-Netzwerke. Von der Anpassung an die ISF wird die Abklingzeit τ für einen Bereich von q-Werten bestimmt. Aus Gründen der Klarheit zeigen wir nicht den Wert von τ für jedes q, sondern nur eine logarithmisch beabstandete Menge. In blau (tan) sind die Daten aus Bildern von 0,6 μm Perlen innerhalb von Vimentin-Netzwerken mit einer Vimentin-Konzentration von 19 μM (34 μM). Die Fehlerbalken stellen die Standardabweichungen in τ über mehrere Filme dar (vier Filme für die Daten mit dem 19-μM-Netzwerk [blau] und fünf Filme für die Daten mit dem 34-μM-Netzwerk [tan]). Rote gestrichelte Linien markieren geschätzte Grenzen für unsere zeitliche und räumliche Auflösung, wie in den Ergebnissen beschrieben. Die durchgezogene schwarze Linie zeigt eine Skalierung, die auf diffusive Bewegung hinweisen würde. Keiner der beiden Datensätze folgt dieser Skalierung. Vielmehr zeigen Perlen im 19-μM-Netzwerk subdiffusive Bewegung (mit β > 2), und Perlen im 34-μM-Netzwerk zeigen eine begrenzte oder eingesperrte Bewegung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Die Zerfallszeiten zeigten eine große Unsicherheit, sowohl bei den niedrigen q- als auch bei den hohen q-Extremen, wie in Abbildung 5 zu sehen ist. Die Fehlerbalken in diesem Diagramm zeigen die Standardabweichung zwischen vier Videos, die für den Fall der niedrigeren Vimentin-Konzentration analysiert wurden, oder fünf Videos, die für die höhere Konzentration analysiert wurden. Um die Quelle der großen Unsicherheit an diesen Extremen zu verstehen, betrachten Sie sowohl die zeitliche als auch die räumliche Auflösung. Ungefähre Grenzen der Auflösung werden mit drei roten gestrichelten Linien angezeigt. Die beiden horizontalen Linien entsprechen den untersuchten minimalen und maximalen Verzögerungszeiten. Angesichts der Bildrate von 100 Frames/s und der maximalen Verzögerungszeit, die 1000 Frames (20% der gesamten Videodauer) entspricht, ging die Genauigkeit verloren, wenn die Dynamik schneller als 0,01 s oder langsamer als 10 s gemessen wurde. Bei den niedrigeren q-Werten waren die angepassten Werte für τ größer als 10 s. Daher ist in Zerfallszeiten, die größer als die maximale Verzögerungszeit sind, mit großen Unsicherheiten zu rechnen. Am oberen Ende des q-Bereichs näherte sich die Zerfallszeit der minimalen Verzögerungszeit von 0,01 s, blieb aber darüber. Anstatt durch die zeitliche Auflösung begrenzt zu sein, kann bei diesen höheren q-Werten die räumliche Auflösung der begrenzende Faktor sein. Bei einer Pixelgröße von 0,13 μm lag der größte Wert für q bei etwa 24 μm-1. Die beugungsbegrenzte Auflösung erlaubt jedoch nicht unbedingt genaue Messungen der Dynamik bei diesen hohen Raumfrequenzen. Die Annäherung an die optische Auflösung als führt zu einer oberen Wellenzahlgrenze von etwa 16 μm-1, wenn man die numerische Apertur der Objektivlinse, NA, von 1,4 und die Wellenlänge des Lichts berücksichtigt. Dies ist durch die vertikale rote gestrichelte Linie in Abbildung 5 gekennzeichnet. Tatsächlich waren die Daten bei großen Werten von q verrauscht. Schon vor dieser ungefähren Obergrenze von q wurde eine erhöhte Unsicherheit in τ beobachtet, und dies könnte auf eine Überschätzung von qmax zurückzuführen sein. Eine schlechtere optische Auflösung als vorhergesagt kann darauf zurückzuführen sein, dass eine Ölimmersionslinse verwendet wurde, um über das Deckglas hinaus in eine wässrige Probe zu fotografieren, oder weil die Kondensatorlinse nicht perfekt ausgerichtet war. Für die 0,6-μm-Perlen, die in das weniger konzentrierte Netzwerk eingebettet sind (19 μM Vimentin), kann aus dem Log-Log-Diagramm der Abklingzeit im Vergleich zur Wellenzahl beobachtet werden, dass die Abklingzeit mit der Wellenzahl in einer Weise abnahm, die mit einem Potenzgesetz übereinstimmt (Abbildung 5). Es scheint jedoch nicht dem zu folgen, was für eine normale diffusive Bewegung zu erwarten wäre, wobei . Vielmehr nahm τ mit zunehmendem q stärker ab. Dies deutet auf eine subdiffusive Bewegung hin, die häufig bei Perlen in überfüllten Umgebungen wie diesen auftritt. Die Anpassung τ(q) über den Bereich von 1,4 μm-1 bis 12,3 μm-1 an ein Potenzgesetz der Form τ = 1/Kqβ ergibt die Transportparameter K = 0,0953 μm β/s und β = 2,2. Für diejenigen, die eher daran gewöhnt sind, über normale Diffusion vs. Subdiffusion in Bezug auf die mittlere quadratische Verschiebung (MSD) von Tracer-Partikeln als Funktion der Verzögerungszeit nachzudenken (dh MSD = K ‘Δ t α), ist es hilfreich zu erkennen, dass der subdiffusive Skalierungsexponent in der MSD-Gleichung, α, äquivalent zu α = 2 / β ist. Mit anderen Worten, der Wert von β = 2,2 ist konsistent mit einem subdiffusiven Skalierungsexponenten in der MSD-Gleichung von α = 0,9. Man würde PyDDM so einstellen, dass es τ (q) über diesen Bereich von q-Werten anpasst, indem man die Indizes des Arrays von q entweder mit dem Parameter Good_q_range in der YAML-Datei angibt oder indem man das optionale Argument forced_qs an die Funktion generate_fit_report übergibt. Der Bereich von q von 1,4 μm-1 bis 12,3 μm-1 würde für die Daten hier Indizes des Arrays von q von 15 bis 130 entsprechen. Für die 0,6 μm-Kügelchen im konzentrierteren Netzwerk (34 μM) zeigte die Zerfallszeit wenig Abhängigkeit von q. Dies ist wahrscheinlich auf die Nichtergodizität von Perlen in einem Netzwerk mit einer kleineren Maschenweite zurückzuführen. Um die Nichtergodizität in diesem System zu untersuchen, sollte der Nichtergodizitätsparameter C als Funktion von q aufgetragen werden, wie in Abbildung 6. Für die 0,6 μm Perlen im 19 μM Vimentin-Netzwerk ≈ C 0,2 mit geringer Abhängigkeit von q (nicht gezeigt). Für das Netzwerk mit 34 μM Vimentin und für ein Netzwerk mit einer noch höheren Konzentration von 49 μM Vimentin war der Logarithmus von C jedoch proportional zu q2, wie in Abbildung 6 gezeigt. Diese Beziehung zwischen C und q wird für eine begrenzte Bewegung erwartet. Für Perlen, die in Taschen des Netzwerks gefangen sind, wird erwartet, dass der MSD bei ausreichend langen Verzögerungszeiten ein Plateau erreicht (d. h. , wobei der MSD und δ2 der maximale MSD ist). Da der ISF als MSD ausgedrückt werden kann und da der nichtergodische ISF zu langen Verzögerungszeiten (d. h. ) nach C geht, erhältman die Beziehung 32,75. Daher kann man C(q) verwenden, um δ 2 zu finden, und dies ergab δ 2 = 0,017 μm 2 und 0,0032 μm 2 für die 34 bzw. 49 μM Vimentin-Netzwerke (entsprechend δ = 0,13 μm und 0,057 μm). Abbildung 6: Nichtergodizitätsparameter vs. Wellenzahl für Vimentin-Netzwerke. Von der Anpassung an die ISF wird der Nichtergodizitätsparameter C für einen Bereich von q-Werten bestimmt. In tan (rot) sind die Daten aus Bildern von 0,6 μm Perlen innerhalb von Vimentin-Netzwerken mit einer Vimentin-Konzentration von 34 μM (49 μM). Die Fehlerbalken stellen die Standardabweichungen in τ über mehrere Filme dar (fünf Filme für die Daten mit dem 34-μM-Netzwerk [tan] und vier Filme für die Daten mit dem 49-μM-Netzwerk [rot]). Die y-Achse hat eine logarithmische Skalierung. Man beobachtet eine q-Abhängigkeit von C , die folgt , die es ermöglicht, die maximale mittlere quadratische Verschiebung zu extrahieren, δ2. Passungen an werden mit den durchgezogenen Linien angezeigt . Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Man kann andere Methoden verwenden, um die Einschlussgröße δ aus den Daten sowie den subdiffusiven Exponenten zu extrahieren, der bei der Untersuchung von τ(q) auf Perlen innerhalb des 19 μM Vimentin-Netzwerks gefunden wurde. Erstens kann man die von Bayles et al.76 und Edera et al.77 beschriebene Methode verwenden, um die MSD aus der DDM-Matrix zu extrahieren. Insbesondere erfordert diese Methode keine Anpassung der DDM-Matrix. Man muss nur die DDM-Matrix D(q,Δ t) und (aus der A(q) und B bestimmt werden können) berechnen. Dann, um die MSD zu finden, verwendet man die Beziehung . Beachten Sie, dass diese Methode zum Auffinden des MSD davon ausgeht, dass die Verteilung der Partikelverschiebungen Gauß ist, obwohl frühere Arbeiten gezeigt haben, dass in bestimmten Fällen MSDs, die von DDM abgeleitet sind, mit MSDs aus der Partikelverfolgung übereinstimmen, selbst wenn die Verschiebungen nicht Gauß73 sind. Für dieses System gibt es, wie erwartet78, eine Nicht-Gaußianität in der Verteilung großer Verschiebungen, wie in Abbildung S1 zu sehen ist. Im PyDDM-Paket sollte die Funktion extract_MSD ausgeführt werden, die . Zweitens kann man die Verfolgung einzelner Partikel verwenden, um die MSD zu finden. Obwohl DDM zur Analyse von Bildern verwendet werden kann, bei denen entweder die hohe Dichte von Partikeln oder die begrenzte optische Auflösung eine genaue Partikellokalisierung verhindert, konnten wir für die Bilder von 0,6-μm-Perlen in Vimentin-Netzwerken Perlen mit der Trackpy-Software (https://github.com/soft-matter/trackpy) 79 Perlen lokalisieren und verfolgen. Dieses Partikelverfolgungs-Softwarepaket verwendet die von Crocker und Grier80 beschriebenen Algorithmen. Abbildung 7: Mittlere quadratische Verschiebung im Vergleich zur Verzögerungszeit für Vimentin-Netzwerke. Die MSD wurde mit zwei Methoden bestimmt. Zuerst wurde der MSD aus der DDM-Matrix berechnet (dargestellt mit durchgezogenen Symbolen). Als nächstes wurde die MSD mithilfe von Single-Particle Tracking (SPT) bestimmt, um Partikeltrajektorien (offene Symbole) zu finden. Fehlerbalken werden auf die gleiche Weise bestimmt, wie in den beiden vorherigen Abbildungslegenden beschrieben. (A) Muskel-Skelett-Erkrankungen für 0,6-μm-Perlen im 19-μM-Vimentin-Netzwerk weisen auf eine subdiffusive Bewegung hin, wobei eine gute Übereinstimmung zwischen den beiden Methoden zur Ermittlung der Muskel-Skelett-Erkrankungen besteht. (B) Muskel-Skelett-Erkrankungen für 0,6-μm-Kügelchen im 49-μM-Vimentin-Netzwerk weisen auf eine Bewegung in Käfighaltung hin, wobei eine gute Übereinstimmung zwischen den beiden Methoden zur Ermittlung der Muskel-Skelett-Krankheit und mit der maximalen Muskel-Skelett-Erkrankung aus dem Nichtergodizitätsparameter besteht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Die MSDs vs. Lag-Zeit für 0,6 μm-Beads im 19-μM-Vimentin-Netzwerk und im 49-μM-Vimentin-Netzwerk sind in Abbildung 7 dargestellt. In beiden Fällen stimmte die aus DDM ermittelte MSD gut mit der MSD überein, die durch Single-Particle Tracking (SPT) gefunden wurde. Darüber hinaus betrug für das weniger konzentrierte Netzwerk der subdiffusive Skalierungsexponent (α in ) etwa 0,9. Dies steht im Einklang mit der τ(q)-Skalierung von gefunden, indem der ISF angepasst wird, um τ(q) zu bestimmen (d. h. 2/2,2 = 0,9). Für das konzentriertere Netzwerk stagniert die MSD bei längeren Verzögerungszeiten. Die maximale MSD, die durch Analyse der q-Abhängigkeit des Nichtergodizitätsparameters gefunden wurde (dargestellt in Abbildung 7B mit der horizontalen Linie bei δ 2 = 0,0032 μm2), war ungefähr derselbe Wert, auf den sich die Muskel-Skelett-Erkrankungen von SPT und DDM zuzubewegen schienen. In Abbildung 7A besteht eine Diskrepanz zwischen den aus DDM ermittelten MSDs mit der längsten Verzögerungszeit und SPT. Während dies auf eine begrenzte Anzahl von langen Verzögerungszeittrajektorien zurückzuführen sein kann, kann es auch der Fall sein, dass eine weitere Optimierung des Bereichs der q-Werte, für die die DDM-Matrix verwendet wird, um für jede Verzögerungszeit zu schätzen (wie von Bayles et al.76 und Edera et al.77 getan), unsere Ergebnisse verbessern würde. Und eine solche Optimierung wird im Mittelpunkt der zukünftigen Arbeit stehen. Diese Experimente, bei denen Bildsequenzen von Tracer-Perlen aufgezeichnet wurden, die in ein Netzwerk von Vimentin-Zwischenfilamenten eingebettet waren, ermöglichten unabhängige Analysen: DDM (mit dem hier beschriebenen Paket) und SPT (mit Trackpy). Beide Analysen können den Grad der Subdiffusion und der Einschlusslänge aufdecken, so dass man zwei unabhängige Bildanalysetechniken verwenden kann, um komplementäre Metriken bereitzustellen. Es gibt zusätzliche Mengen, die man aus SPT und DDM vergleichen kann. Zum Beispiel kann sich die Heterogenität in der Dynamik der Stichprobe als Nicht-Gaußianität in der Verteilung der Partikelverschiebungen (d. h. der Van-Hove-Verteilung) aus SPT sowie in einer aus DDM bestimmten ISF, die zu einem gestrecktenExponential 34,35 passt, offenbaren. Abbildung S1 zeigt die Van-Hove-Verteilung für die 0,6-μm-Partikel in Vimentin-Netzwerken und diskutiert den Dehnungsexponenten, der bei der Anpassung der ISFs gefunden wurde – Metriken, die in früheren Studien im Tandem verwendet wurden, um die heterogene Dynamik von Partikeln in biomimetischen Systemen 9,10,47 oder anderen überfüllten Umgebungen zu demonstrieren 34 . Als weiteres Beispiel kann der ISF aus Partikeltrajektorien berechnet werden, die mit SPT gemessen und mit den DDM-erworbenen ISFs verglichen werden. Während die mittleren quadratischen Verschiebungen und Verschiebungsverteilungen die Metriken sind, die am häufigsten aus der SPT-Analyse gezogen werden, kann man die ISF auch aus Partikeltrajektorien berechnen, mit (siehe Abbildung S2). Dieser ISF kann mit DDM-generierten ISFs verglichen und verwendet werden, um eine Dynamik aufzudecken, die im MSD59 nicht offensichtlich ist. Während die Aufnahme von Bildern von Tracer-Partikeln innerhalb eines Netzwerks es ermöglichen kann, die komplementären Analysemethoden von SPT und DDM zu verwenden, ist es wichtig zu beachten, dass ein Vorteil von DDM gegenüber SPT darin besteht, dass keine Bilder von Perlen (oder anderen Merkmalen) benötigt werden, die leicht lokalisiert und verfolgt werden können. Um diesen Punkt zu demonstrieren, heben wir als nächstes die Analyse aktiver Netzwerke von Aktin- und Mikrotubuli-Filamenten hervor, wobei die fluoreszierende Markierung von Aktin und Tubulin die Abbildung beider Filamenttypen ermöglicht, die sich über verschiedene Fluorophore voneinander unterscheiden, mit einem mehrfarbigen Laser-Scanning-Konfokalmikroskop. Die Bilder wurden mit einem laserscannenden konfokalen Mikroskop von Aktin-Mikrotubuli-Netzwerken mit Aktivität aufgenommen, die durch Myosin (Kaninchen-Skelettmuskel-Myosin II; Zytoskelett #MY02). Details der Experimente und Ergebnisse wurden zuvorbeschrieben 11, und die hier gezeigten repräsentativen Ergebnisse stammen aus der Analyse von zwei Filmen, die in den ergänzenden Materialien (Filme S1 und S4) für11 bereitgestellt wurden. Beide Bildsequenzen wurden mit 2,78 Bildern/s für 1000 Bilder aufgenommen. Zur Analyse dieser Bilder wurde die DDM-Matrix für 50 Verzögerungszeiten von 0,4 s bis 252 s (1 Frame bis 700 Frames) berechnet. Die DDM-Matrix wurde dann an das Modell angepasst, wobei die Zwischenstreufunktion war . Es gibt daher vier Anpassungsparameter: A, τ, s und B. Die Ergebnisse dieser Anpassungen sind in Abbildung 8 dargestellt. Es wurde beobachtet, dass die DDM-Matrix für einen bestimmten q-Wert bei niedrigen Verzögerungszeiten ein Plateau aufwies, mit der Verzögerungszeit zunahm und dann zu großen Verzögerungszeiten ein Plateau aufwies (oder Anzeichen eines Plateaubeginns zeigte). Die DDM-Matrix für die unteren Werte von q erreichte bei langen Verzögerungszeiten kein Plateau. Man sollte daher eine schlechte Genauigkeit bei der Messung der Zerfallszeit für diese niedrige q-Dynamik (große Längenskala) erwarten. Die charakteristischen Abklingzeiten τ von der Anpassung an die DDM-Matrix sind in Abbildung 9 dargestellt. Die Ergebnisse werden für ein aktives Aktin-Mikrotubuli-Verbundnetzwerk (ähnlich dem Film S1 11) und für ein aktives Aktinnetzwerk (ähnlich dem Film S411) vorgestellt. Beide Netzwerke wurden mit den gleichen Konzentrationen von Aktin und Myosin hergestellt, aber das reine Aktinnetzwerk wurde ohneTubulin erzeugt, wie in 11 beschrieben. Für diese beiden Arten von aktiven Netzwerken war die beobachtete Potenzgesetzbeziehung . Diese Skalierung zeigt eine ballistische Bewegung an und dass die Myosin-getriebene Kontraktion und der Fluss die thermische Bewegung der Filamente dominieren. Aus τ = (vq)-1 konnte eine charakteristische Geschwindigkeit v von etwa 10 nm/s für das aktive Aktin-Mikrotubuli-Netzwerk und 75 nm/s für das aktive Aktinnetzwerk gefunden werden. Diese Werte stimmen mit der Partikelbild-Velocimetrie-Analyse der gleichen Videos überein, die in11 gezeigt werden. Die Skalierung hielt bei den niedrigeren q-Werten für das aktive Aktin-Mikrotubuli-Kompositnetzwerk nicht an. Dies liegt wahrscheinlich daran, dass die wahren Zerfallszeiten für dieses Aktin-Mikrotubuli-Kompositnetzwerk bei den niedrigeren q-Werten länger sind als die maximale Verzögerungszeit der berechneten DDM-Matrix. Die maximale Verzögerungszeit ist mit der horizontalen roten Linie in Abbildung 9 angegeben, und die Zerfallszeiten wichen von der erwarteten Skalierung in der Nähe dieser längeren Zeiten ab. Abbildung 8: DDM-Matrix vs. Verzögerungszeit für ein aktives Aktin-Mikrotubuli-Kompositnetzwerk. Die DDM-Matrix für mehrere Werte von q wird als Funktion der Verzögerungszeit aus einem Film eines zusammengesetzten Netzwerks dargestellt, das aus 2,9 μM-Aktinmonomeren, 2,9 μM-Tubulindimeren und 0,24 μM-Myosin besteht. Diese Daten zeigen die Analyse nur des Mikrotubuli-Kanals einer mehrfarbigen Zeitreihe von Bildern. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Abbildung 9: Abklingzeit vs. Wellenzahl für aktive Aktin-Mikrotubuli-Netzwerke. Aus der Anpassung der DDM-Matrix wird die Abklingzeit τ als Funktion der Wellenzahl q ermittelt. Dargestellt ist τ vs q für Bilder eines aktiven Aktin-Mikrotubuli-Netzwerks (Analyse nur des Mikrotubuli-Kanals) in braun und für Bilder eines aktiven Aktinnetzwerks in grün. Beide Netzwerke haben die gleichen Konzentrationen von Aktin und Myosin (2,9 μM bzw. 0,24 μM); Der Aktin-Mikrotubuli-Komposit hat 2,9 μM Tubulin-Dimere. Die Zerfallszeiten für das aktive Aktinnetzwerk sind viel kleiner als die Zerfallszeiten für das aktive Aktin-Mikrotubuli-Netzwerk, was auf eine schnellere Bewegung des aktiven Aktinnetzwerks hinweist. In beiden Fällen ist die Dynamik ballistisch, da die Daten einem Trend folgen. Inset: Das Diagramm der ISFs im Vergleich zur Verzögerungszeit, skaliert durch die Wellenzahl (Δt × q), zeigt einen Zusammenbruch der ISFs über einen Bereich von q-Werten. Dies deutet auch auf ballistische Bewegung hin. Die in diesem Inset gezeigten ISFs stammen aus dem aktiven Aktinnetzwerk. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Für diese Daten aktiver Netzwerke haben wir uns für die DDM-Matrix entschieden.  Dies steht im Gegensatz zu dem, was für die Daten von Perlen im Vimentin-Netzwerk getan wurde, wo A (q) und B ohne jegliche Anpassung zur Isolierung der ISF, f (q,Δ t) geschätzt wurden. In diesem Fall wurden für die aktiven Netzdaten A und B als Anpassungsparameter belassen, da die zur Schätzung von B verwendeten Methoden nicht zu guten Anpassungen führten. Die Standardmethode zur Schätzung von B besteht darin, zu berechnen und davon auszugehen, dass dies im Großen und Ganzen nach B/2 geht. Diese Methode überschätzte B jedoch für diese Daten, was sich in der Tatsache zeigte, dass bei der Berechnung der auf diese Weise geschätzten (nicht gezeigten) ISFs aus B zu frühen Verzögerungszeiten größer als 1 waren (während sie von einem Maximum von 1 entweder auf Null oder einen Nichtergodizitätsparameter mit zunehmender Verzögerungszeit gehen sollten). Man kann andere Methoden zur Schätzung von B mit dem Parameter background_method auswählen. Eine dieser anderen Methoden besteht darin, B zu frühen Verzögerungszeiten als das Minimum der DDM-Matrix zu schätzen (festgelegt mit background_method=1). Eine ähnliche Methode wurde von Bayles et al.76 verwendet, obwohl sie nicht davon ausgingen, dass B mit q konstant war. Eine andere Möglichkeit besteht darin, B als Durchschnittswert über alle Verzögerungszeiten der DDM-Matrix beim maximalen q (festgelegt mit background_method=2) zu schätzen. Diese verschiedenen Methoden zur Schätzung des Hintergrunds sowie die Ergebnisse, mit denen B als freier Anpassungsparameter zugelassen werden kann, sind in Abbildung 10 dargestellt. Aus diesen Diagrammen kann man sehen, dass die Amplitude, A, bei den größten untersuchten q-Werten nicht Null erreichte, da sie bei großen q kein Plateau erreichte (Abbildung 10B), und da D (q max, Δ t) von einem niedrigerenVerzögerungszeitplateau zu einem höheren Verzögerungszeitplateau überging (dh bei q max gab es ein Nicht-Null-A; Abbildung 10D). Daher wäre weder eine Schätzung von B als noch wie angemessen. Man sollte vs. q und D(qmax, Δ t) vs.Δ t inspizieren, bevor man entscheidet, wie (oder ob) man B schätzt. Abbildung 10: Hintergrund vs. Wellenzahl für aktive Aktin-Mikrotubuli-Netzwerke. Aus der Anpassung der DDM-Matrix kann man den Hintergrund B als Funktion der Wellenzahl q finden. Gezeigt wird B vs. q für Bilder eines aktiven Aktin-Mikrotubuli-Netzwerks (das nur den Mikrotubuli-Kanal analysiert), das aus diesen Passungen mit den violetten Symbolen bestimmt wird . Die drei durchgezogenen Linien in (A) zeigen Schätzungen des Hintergrunds, der ohne Anpassung gefunden wurde. Die obere, dunkelste Linie in (A) zeigt den geschätzten Hintergrund mit , was angemessen sein kann, wenn ein Plateau auf einen konstanten Wert bei großem q erreicht wird. Beachten Sie von (B), dass bei der größten untersuchten q noch kein konstanter Wert erreicht wurde. Daher wird bei der Verwendung dieser Methode der Hintergrund überschätzt. Die untere Zeile in (A) zeigt den geschätzten Hintergrund mit . Wenn die DDM-Matrix ein niedriges Verzögerungszeitplateau aufweist, wie in (C) mit der roten Linie gezeigt, kann diese Methode zur Schätzung des Hintergrunds geeignet sein. Die mittlere, hellste Linie in (A) zeigt den geschätzten Hintergrund von . Diese Methode kann geeignet sein, wenn bei qmax die Amplitude A Null erreicht hat. Aus (D) geht hervor, dass die Amplitude ungleich Null ist und diese Methode daher den Hintergrund überschätzt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Ergänzende Abbildung S1: Wahrscheinlichkeitsverteilungen von Partikelverschiebungen. Wahrscheinlichkeitsverteilungen von Partikelverschiebungen zeigen Nicht-Gaußianität für Vimentinkonzentrationen von 34 μM und 49 μM. Einzelpartikel-Tracking von Perlen mit einem Durchmesser von 0,6 μm wurde in Vimentin-Netzwerken unterschiedlicher Konzentration durchgeführt. Unterschiedliche Verzögerungszeiten werden in den Verschiebungsverteilungen für die drei Bedingungen angezeigt. (A) Die Verteilung der Partikelverschiebungen in einem 19 μM Vimentin-Netzwerk ist mit einer Gaußschen Funktion vereinbar. Die Breite des Gauß nimmt mit zunehmender Verzögerungszeit zu. (B) Die Verteilung der Partikelverschiebungen in einem 34-μM-Vimentin-Netzwerk zeigt eine größere Nicht-Gaußianität, insbesondere bei großen Verschiebungen, als im 19-μM-Fall. (C) Die Verteilung der Partikelverschiebungen in einem 49 μM Vimentin-Netzwerk zeigt ebenfalls eine Nicht-Gaußianität. Darüber hinaus nehmen die Breiten der Verteilungen mit der Verzögerungszeit nicht so signifikant zu wie in den Proben mit niedrigeren Vimentin-Konzentrationen, was auf eine begrenzte Bewegung hinweist. Nicht-Gaußsche Van-Hove-Verteilungen (beobachtet für alle Vimentin-Proben, aber am deutlichsten in den höheren Konzentrationen) sind mit einer heterogenen Dynamik verbunden, wie sie häufig beim Transport von Partikeln in überfüllten und begrenzten Umgebungen beobachtet wird. Ein weiterer Indikator für den heterogenen Transport, der aus der DDM-Analyse bestimmt wird, ist der Dehnungsexponent, der verwendet wird, um die Zwischenstreufunktion anzupassen (die Parameter s in der Gleichung für die ISF, die hier verwendet wird: + ). Die durchschnittlichen Dehnungsexponenten über den q-Bereich von 0,4 μm-1 bis 9,4 μm-1 sind, von der höchsten Vimentinkonzentration bis zur niedrigsten, 0,53 ± 0,07, 0,64 ± 0,02 und 0,86 ± 0,04 (Mittelwert ± Standardabweichung). Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen. Ergänzende Abbildung S2: Die Zwischenstreufunktionen aus DDM und SPT. Die Zwischenstreufunktionen (ISF) für fünf verschiedene Wellenzahlen werden gezeigt. Die ISF-Verzögerungszeit, die durch DDM gefunden wurde, wird mit kreisförmigen Markern dargestellt und die ISF aus Einzelteilchentrajektorien mit offenen Quadraten berechnet. Gepunktete schwarze Linien zeigen die Passungen zu den von DDM erworbenen ISFs. Der ISF wird aus Einzelteilchentrajektorien berechnet, wobei . In (A) ist der ISF für 0,6 μm Partikel in den 19 μM Vimentin-Netzwerken dargestellt. In (B) ist der ISF für 0,6 μm Partikel in den 34 μM Vimentin-Netzwerken dargestellt. Die Diskrepanzen in der ISF, die von DDM und SPT gefunden wurden, sind wahrscheinlich auf eine begrenzte Anzahl von langen Verzögerungszeitverläufen zurückzuführen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen. Ergänzende Datei 1: Protokoll für die Verwendung von DDM. Die Eingabe und Ausgabe der im Protokoll angezeigten Schritte werden dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen. Ergänzende Datei 2: Details zur Probenvorbereitung und Beispielparameterdateien für vimentin-Netzwerke. Detaillierte Schritte zur Probenvorbereitung und Bildaufnahme auf vimentin-Netzwerken werden bereitgestellt. Zusätzlich wird eine Beispielparameterdatei für die Analyse von Daten bereitgestellt, die im Abschnitt “Repräsentative Ergebnisse” zu vimentin-Netzwerken vorgestellt werden. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.