Quantification de la dynamique du cytosquelette à l’aide de la microscopie dynamique différentielle

Ici, nous montrons des exemples de l’analyse effectuée avec PyDDM à partir de deux ensembles d’expériences différents. Dans une série d’expériences, des billes traceuses submicroniques ont été intégrées dans des réseaux constitués de la protéine de filament intermédiaire vimentine et imagées à l’aide d’une lentille d’objectif 100x en mode champ clair à 100 images / s (Figure 3A). La vimentine est exprimée dans les cellules mésenchymateuses et est un déterminant clé des propriétés mécaniques du cytoplasme65 et de la stabilité mécanique du noyau dans les cellules effectuant une migration confinée 66,67. Jusqu’à présent, les réseaux de vimentine reconstitués ont été étudiés principalement par la rhéologie macroscopique 64,68,69, alors que la dynamique a reçu relativement peu d’attention 13,70,71. Des détails supplémentaires sur ces expériences se trouvent dans le dossier supplémentaire 2. Dans l’autre série d’expériences, des réseaux actifs de cytosquelettes ont été préparés avec de l’actine, des microtubules et de la myosine. Des étiquettes fluorescentes spectralement distinctes ont permis d’imager les filaments d’actine et de microtubules à l’aide d’un microscope confocal à balayage laser bicolore à l’aide d’une lentille d’objectif 60x à 2,78 images/s (Figure 3B,C). Les filaments d’actine et de microtubules sont tous deux des moteurs importants des changements dynamiques de la forme cellulaire, leurs actions étant coordonnées par des interactions mécaniques et biochimiques72. Des détails supplémentaires sur ces expériences peuvent être trouvés dans11. Les images individuelles des séquences d’images prises dans ces expériences sont illustrées à la figure 3. Figure 3 : Images de la série chronologique analysées. (A) Image en champ lumineux de perles de 0,6 μm dans un réseau de vimentine. (B,C) Image des microtubules (B) et de l’actine (C) dans un composite actif actine-microtubule prise avec un objectif 60x sur un microscope confocal à balayage laser, en utilisant une lumière d’excitation de 561 nm pour l’imagerie des microtubules et une lumière d’excitation de 488 nm pour l’imagerie de l’actine. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Pour les images de perles traceuses dans les réseaux vimentin, des films de 5000 images d’une taille de 512 x 512 pixels à 100 images / s ont été enregistrés. À partir de ceux-ci, la matrice DDM a été calculée à 60 temps de décalage espacés logarithmiquement entre 1 et 1000 images, soit 0,01 s et 10 s. Pour estimer l’arrière-plan, B, la moyenne des images transformées de Fourier au carré, , a été calculée et définie sur 55,73. On a supposé que, sur les 10 % les plus grands des valeurs q, cette quantité est égale à B/2 et que B est indépendante de q. Il s’agit de la méthode par défaut du package pour estimer B, mais d’autres méthodes sont possibles en définissant le paramètre background_method sur une valeur différente. Avec les paramètres A(q) et B déterminés à partir de , on peut extraire la fonction de diffusion intermédiaire (ISF) de la matrice DDM. Des exemples de FIA sont illustrés à la figure 4. La figure 4A montre l’ISF à partir d’images de billes de 0,6 μm de diamètre encastrées dans un réseau avec une concentration de vimentine de 19 μM. La figure 4B montre l’ISF pour le même type de billes dans un réseau avec une concentration de vimentine de 34 μM. Fait intéressant, dans aucun des deux cas, l’ISF ne s’est désintégré à zéro. Dans les temps de latence, l’ISF devrait approcher de zéro pour les systèmes ergodiques. C’est-à-dire que dans de tels systèmes, les fluctuations de densité doivent être complètement décorrélées sur de grands temps de latence. Le fait que l’ISF ici ne se soit pas désintégré à zéro pourrait avoir résulté d’estimations inexactes de A (q) et B, qui ont été utilisées pour trouver l’ISF à partir de la matrice DDM calculée. Notamment, la méthode employée ici peut surestimer B dans certains scénarios62. Cependant, il est plus probable que la dynamique des perles traceuses soit vraiment non erratique car les perles ont une taille comparable à la taille du maillage du réseau et peuvent, par conséquent, devenir en cage. D’autres données ont corroboré la conclusion de non-urgence. À savoir, la taille des billes, 0,6 μm, était supérieure à la valeur moyenne calculée pour les maillages de 0,4 μm pour la concentration de 19 μM et de 0,3 μm pour la concentration de 34 μM. De plus, les résultats du suivi d’une seule particule de ces billes traceuses, qui sont montrés plus tard, ont également montré un mouvement confiné. Figure 4 : Fonctions de diffusion intermédiaire à plusieurs nombres d’onde pour les réseaux vimentin. L’ISF est tracé en fonction du temps de latence pour q valeurs d’environ 1 à 9 μm-1. (A) L’ISF à partir d’images de billes de 0,6 μm dans un réseau de vimentine avec une concentration de vimentine de 19 μM. (B) L’ISF à partir d’images de billes de 0,6 μm dans un réseau de vimentine avec une concentration de vimentine de 34 μM. Le long plateau de temps de latence de l’ISF à une valeur bien supérieure à zéro indique une non-énergie. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Étant donné que la dynamique est probablement non erratique, les FSI sont adaptés à la forme , où C est le facteur de non-énergie 32. Cette forme de l’ISF a été utilisée dans des études antérieures sur la dynamique non ergodique, comme celle des gels colloïdaux32,74 ou des particules traceuses dans les réseaux actine-microtubules 10. Les lignes noires pointillées de la figure 4 montrent les ajustements ainsi que les données. À partir de ces ajustements, on peut maintenant examiner la q-dépendance du temps de désintégration, τ, et du paramètre de non-énergie, C. Figure 5 : Temps de désintégration par rapport au nombre d’onde pour les réseaux vimentin. De l’ajustement à l’ISF, le temps de désintégration τ est déterminé pour une plage de valeurs q. Pour plus de clarté, nous n’affichons pas la valeur de τ pour chaque q, mais juste un ensemble espacé logarithmiquement. En bleu (bronzage) se trouvent les données provenant d’images de billes de 0,6 μm dans les réseaux de vimentine avec une concentration de vimentine de 19 μM (34 μM). Les barres d’erreur représentent les écarts-types en τ sur plusieurs films (quatre films pour les données avec le réseau 19 μM [bleu] et cinq films pour les données avec le réseau 34 μM [tan]). Des lignes pointillées rouges marquent les limites estimées de notre résolution temporelle et spatiale, comme décrit dans les résultats. La ligne noire continue montre la mise à l’échelle, ce qui indiquerait un mouvement diffusif. Aucun des deux ensembles de données ne suit cette mise à l’échelle. Au contraire, les perles du réseau de 19 μM montrent un mouvement subdiffusif (avec β > 2), et les perles du réseau de 34 μM montrent un mouvement confiné ou en cage. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Les temps de désintégration ont montré une grande quantité d’incertitude, à la fois aux extrêmes q faible et q élevé, comme le montre la figure 5. Les barres d’erreur sur ce graphique montrent l’écart-type entre quatre vidéos analysées pour le cas de concentration de vimentine inférieure ou cinq vidéos analysées pour la concentration plus élevée. Pour comprendre la source de la grande incertitude à ces extrêmes, considérez à la fois la résolution temporelle et spatiale. Les limites approximatives de la résolution sont indiquées par trois lignes pointillées rouges. Les deux lignes horizontales correspondent aux temps de latence minimaux et maximaux sondés. Compte tenu de la fréquence d’images de 100 images/s et du temps de latence maximal correspondant à 1000 images (20 % de la durée totale de la vidéo), la précision a été perdue lors de la mesure de la dynamique se produisant plus rapidement que 0,01 s ou plus lentement que 10 s. Aux valeurs q inférieures, les valeurs ajustées pour τ étaient supérieures à 10 s. Par conséquent, il faut s’attendre à de grandes incertitudes dans les temps de désintégration qui sont plus importants que le temps de latence maximal. À l’extrémité supérieure de la plage q, le temps de désintégration approchait le temps de latence minimum de 0,01 s, mais restait au-dessus. Plutôt que d’être limitée par la résolution temporelle, à ces valeurs q plus élevées, la résolution spatiale peut être le facteur limitant. Compte tenu de la taille des pixels de 0,13 μm, la plus grande valeur pour q était d’environ 24 μm-1. Cependant, la résolution limitée par diffraction ne permet pas nécessairement des mesures précises de la dynamique à ces hautes fréquences spatiales. L’approximation de la résolution optique conduit à une limite de nombre d’onde supérieure d’environ 16 μm-1, compte tenu de l’ouverture numérique de l’objectif, NA, de 1,4 et de la longueur d’onde de la lumière, . Ceci est marqué par la ligne pointillée rouge verticale de la figure 5. En effet, les données étaient bruyantes à de grandes valeurs de q. Même avant cette limite supérieure approximative de q, une incertitude accrue dans τ a été observée, et cela pourrait être dû à une surestimation de qmax. Une résolution optique plus faible que prévu peut être due au fait qu’une lentille d’immersion dans l’huile a été utilisée pour imager au-delà du couvercle dans un échantillon aqueux ou parce que la lentille du condensateur était imparfaitement alignée. Pour les billes de 0,6 μm incorporées dans le réseau moins concentré (vimentine de 19 μM), on peut observer à partir du diagramme logarithmique du temps de désintégration par rapport au nombre d’onde que le temps de désintégration diminuait avec le nombre d’onde d’une manière compatible avec une loi de puissance (Figure 5). Cependant, il ne semble pas suivre ce à quoi on pourrait s’attendre pour un mouvement diffusif normal, où . Au contraire, τ a diminué plus fortement avec l’augmentation de q. Ceci est révélateur d’un mouvement subdiffusif, qui se produit souvent pour les perles dans des environnements surpeuplés tels que ceux-ci. L’ajustement de τ(q) sur la plage de 1,4 μm-1 à 12,3 μm-1 à une loi de puissance de la forme τ = 1/Kqβ donne les paramètres de transport K = 0,0953 μmβ /s et β = 2,2. Pour ceux qui sont plus habitués à penser à la diffusion normale par rapport à la sous-diffusion en termes de déplacement moyen au carré (MSD) des particules traceuses en fonction du temps de latence (c’est-à-dire MSD = K’ Δtα), il est utile de reconnaître que l’exposant d’échelle sous-diffusif dans l’équation MSD, α, équivaut à α = 2 / β. En d’autres termes, la valeur de β = 2,2 est cohérente avec un exposant d’échelle sous-diffusif dans l’équation MSD de α = 0,9. On définirait PyDDM pour qu’il s’adapte à τ(q) sur cette plage de valeurs q en spécifiant les indices du tableau de q avec le paramètre Good_q_range dans le fichier YAML ou en passant l’argument facultatif forced_qs à la fonction generate_fit_report. La plage de q de 1,4 μm-1 à 12,3 μm-1 correspondrait, pour les données ici, aux indices du tableau de q de 15 à 130. Pour les billes de 0,6 μm dans le réseau plus concentré (34 μM), le temps de désintégration a montré peu de dépendance à q. Cela est probablement dû à la non-énergie des perles dans un réseau avec un maillage plus petit. Pour sonder la non-énergie dans ce système, le paramètre de non-énergie, C, doit être tracé en fonction de q, comme dans la figure 6. Pour les billes de 0,6 μm dans le réseau de vimentine de 19 μM, C ≈ 0,2 avec peu de dépendance à q (non montré). Cependant, pour le réseau avec une vimentine de 34 μM et pour un réseau avec une concentration encore plus élevée de 49 μM de vimentine, le log de C était proportionnel à q2 comme le montre la figure 6. Cette relation entre C et q est attendue pour le mouvement confiné. Pour les billes piégées dans les poches du réseau, on s’attend à ce que le TMS plafonne à des temps de latence suffisamment longs (c.-à-d. , où est le TMS et δ2 est le TMS maximal). Étant donné que le FSI peut être exprimé en termes de MSD comme , et puisque le FSI non erratique va à C à des temps de latence longs (c’est-à-dire ), la relation est obtenue32,75. Par conséquent, on peut utiliser C(q) pour trouver δ2, ce qui a donné δ2 = 0,017 μm2 et 0,0032 μm2 pour les réseaux de vimentine de 34 et 49 μM, respectivement (correspondant à δ = 0,13 μm et 0,057 μm). Figure 6 : Paramètre de non-énergie par rapport au nombre d’onde pour les réseaux vimentin. De l’ajustement à l’ISF, le paramètre de non-énergie C est déterminé pour une plage de valeurs q. Dans le bronzage (rouge) sont les données provenant d’images de billes de 0,6 μm dans les réseaux de vimentine avec une concentration de vimentine de 34 μM (49 μM). Les barres d’erreur représentent les écarts-types en τ sur plusieurs films (cinq films pour les données avec le réseau 34 μM [tan] et quatre films pour les données avec le réseau 49 μM [rouge]). L’axe des y a une mise à l’échelle logarithmique. On observe une q-dépendance de C qui suit , ce qui permet d’extraire le déplacement au carré moyen maximal, δ2. Les ajustements sont affichés avec les lignes pleines. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. On peut utiliser d’autres méthodes pour extraire la taille de confinement δ des données ainsi que l’exposant sous-diffusif trouvé lors de l’examen de τ(q) pour les billes dans le réseau de vimentine de 19 μM. Tout d’abord, on peut utiliser la méthode décrite par Bayles et al.76 et Edera et al.77 pour extraire le MSD de la matrice DDM. Notamment, cette méthode ne nécessite aucun ajustement de la matrice DDM. Il suffit de calculer la matrice DDM, D(q, Δt), et (à partir de laquelle A(q) et B peuvent être déterminés). Ensuite, pour trouver le MSD, on utilise la relation . Notez que cette méthode pour trouver le MSD suppose que la distribution des déplacements de particules est gaussienne, bien que des travaux antérieurs aient montré que, dans certains cas, les TMS dérivés de DDM sont en accord avec les TMS du suivi des particules, même lorsque les déplacements ne sont pas gaussiens73. Pour ce système, comme prévu78, il y a une non-gaussianité dans la distribution des grands déplacements, comme le montre la figure S1. Dans le package PyDDM, la fonction extract_MSD doit être exécutée, ce qui renvoie . Deuxièmement, on peut utiliser le suivi des particules uniques pour trouver le MSD. Bien que DDM puisse être utilisé pour analyser des images où la densité élevée de particules ou la résolution optique limitée interdisent une localisation précise des particules, pour les images de billes de 0,6 μm dans les réseaux de vimentine, nous avons pu localiser et suivre les perles à l’aide du logiciel trackpy (https://github.com/soft-matter/trackpy)79. Ce progiciel de suivi des particules utilise les algorithmes décrits par Crocker et Grier80. Figure 7 : Déplacement moyen au carré par rapport au temps de latence pour les réseaux vimentin. Le TMS a été déterminé à l’aide de deux méthodes. Tout d’abord, le MSD a été calculé à partir de la matrice DDM (illustrée par des symboles solides). Ensuite, le MSD a été déterminé en utilisant le suivi des particules uniques (SPT) pour trouver des trajectoires de particules (symboles ouverts). Les barres d’erreur sont déterminées de la même manière que celle décrite dans les deux légendes de figures précédentes. (A) Les TMS pour les billes de 0,6 μm dans le réseau de vimentine de 19 μM indiquent un mouvement subdiffusif, avec un bon accord entre les deux méthodes de recherche du TMS. (B) Les TMS pour les billes de 0,6 μm dans le réseau de vimentine de 49 μM indiquent un mouvement en cage, en bon accord entre les deux méthodes de recherche du TMS et avec le TMS maximal trouvé à partir du paramètre de non-urgence. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Les TMS par rapport au temps de latence pour les billes de 0,6 μm dans le réseau de vimentine de 19 μM et dans le réseau de vimentine de 49 μM sont illustrés à la figure 7. Dans les deux cas, le DSM déterminé à partir du DDM concordait bien avec le TMS trouvé grâce au suivi d’une seule particule (SPT). De plus, pour le réseau moins concentré, l’exposant de mise à l’échelle sous-diffusive (α en ) était d’environ 0,9. Ceci est cohérent avec la mise à l’échelle τ(q) de found en ajustant l’ISF pour déterminer τ(q) (c’est-à-dire 2/2.2 = 0.9). Pour le réseau plus concentré, le MSD plafonne à des temps de latence plus longs. La DSM maximale trouvée en analysant la dépendance q du paramètre de non-énergie (illustrée à la figure 7B avec la ligne horizontale à δ2 = 0,0032 μm2) était à peu près la même valeur que les TMS du SPT et du DDM semblaient plafonner. Il existe un écart entre les TMS à plus long délai déterminés à partir du DDM et du SPT à la figure 7A. Bien que cela puisse être dû à un nombre limité de trajectoires de temps de décalage long, il se peut également que l’optimisation de la plage de valeurs q pour laquelle la matrice DDM est utilisée pour estimer pour chaque temps de décalage (comme le font Bayles et al.76 et Edera et al.77) améliorerait nos résultats, et cette optimisation sera au centre des travaux futurs. Ces expériences où des séquences d’images ont été enregistrées de billes traceuses intégrées dans un réseau de filaments intermédiaires de vimentine ont permis des analyses indépendantes: DDM (en utilisant le paquet décrit ici) et SPT (en utilisant trackpy). Les deux analyses peuvent révéler le degré de sous-diffusion et la longueur de confinement, ce qui permet d’utiliser deux techniques d’analyse d’image indépendantes pour fournir des mesures complémentaires. Il existe des quantités supplémentaires que l’on peut comparer à partir de SPT et DDM. Par exemple, l’hétérogénéité dans la dynamique de l’échantillon peut se révéler comme une non-gaussianité dans la distribution des déplacements de particules (c’est-à-dire la distribution de van Hove) déterminée à partir de SPT, ainsi que dans un ISF déterminé à partir de DDM qui correspond à une exponentielle étirée34,35. La figure S1 montre la distribution de van Hove pour les particules de 0,6 μm dans les réseaux de vimentine et discute de l’exposant d’étirement trouvé lors de l’ajustement des FSI – mesures utilisées en tandem dans des études antérieures pour démontrer la dynamique hétérogène des particules dans les systèmes biomimétiques 9,10,47 ou d’autres environnements surpeuplés 34 . Autre exemple, l’ISF peut être calculé à partir des trajectoires de particules mesurées avec spT et comparé aux ISF acquis par DDM. Alors que les déplacements au carré moyens et les distributions de déplacement sont les mesures les plus souvent tirées de l’analyse SPT, on peut également calculer l’ISF à partir des trajectoires des particules, en utilisant (voir la figure S2). Ce FSI peut être comparé aux FAI générés par DDM et utilisé pour révéler une dynamique non apparente dans la DSM59. Bien que l’acquisition d’images de particules traceuses au sein d’un réseau puisse permettre d’utiliser les méthodes d’analyse complémentaires de SPT et DDM, il est important de noter que l’un des avantages de DDM par rapport à SPT est qu’il ne nécessite pas d’images de perles (ou d’autres caractéristiques) qui peuvent être facilement localisées et suivies. Pour démontrer ce point, nous soulignons ensuite l’analyse des réseaux actifs de filaments d’actine et de microtubules, où le marquage fluorescent de l’actine et de la tubuline permet l’imagerie des deux types de filaments, distingués l’un de l’autre via différents fluorophores, avec un microscope confocal multicolore à balayage laser. Les images ont été acquises à l’aide d’un microscope confocal à balayage laser de réseaux actine-microtubules dont l’activité était entraînée par la myosine (myosine II du muscle squelettique du lapin; Cytosquelette #MY02). Les détails des expériences et des résultats ont déjà été décrits11, et les résultats représentatifs présentés ici proviennent de l’analyse de deux films fournis dans les documents supplémentaires (films S1 et S4) pour11. Les deux séquences d’images ont été enregistrées à 2,78 images/s pour 1000 images. Pour analyser ces images, la matrice DDM a été calculée pour 50 temps de latence allant de 0,4 s à 252 s (1 image à 700 images). La matrice DDM a ensuite été adaptée au modèle , la fonction de diffusion intermédiaire étant . Il existe donc quatre paramètres d’ajustement : A, τ, s et B. Les résultats de ces ajustements sont présentés à la figure 8. Il a été observé que la matrice DDM pour une valeur q particulière avait un plateau à des temps de décalage faibles, augmentait avec le temps de décalage, puis plafonnait (ou montrait des signes de début à plateau) à des temps de décalage importants. La matrice DDM pour les valeurs inférieures de q n’a pas atteint un plateau à long terme. Il faut donc s’attendre à une faible précision dans la mesure du temps de désintégration pour ces dynamiques de faible q (grande échelle de longueur). Les temps de désintégration caractéristiques, τ, des ajustements à la matrice DDM sont illustrés à la figure 9. Les résultats sont présentés pour un réseau composite actine-microtubule actif (similaire au film S111) et pour un réseau actif d’actine (similaire au film S411). Les deux réseaux ont été préparés avec les mêmes concentrations d’actine et de myosine, mais le réseau d’actine seule a été créé sans tubuline, comme décrit aupoint 11. Pour ces deux types de réseaux actifs, la relation de loi de puissance observée était . Cette mise à l’échelle indique un mouvement balistique et que la contraction et l’écoulement entraînés par la myosine dominent le mouvement thermique des filaments. À partir de τ = (vq)-1, on a pu trouver une vitesse caractéristique, v, d’environ 10 nm/s pour le réseau actif actine-microtubule et de 75 nm/s pour le réseau actif d’actine. Ces valeurs sont cohérentes avec l’analyse de vélocimétrie d’image de particules des mêmes vidéos montrées dans11. La mise à l’échelle n’a pas tenu aux valeurs q inférieures pour le réseau composite actif actine-microtubule. Cela est probablement dû au fait que les temps de désintégration réels de ce réseau composite actine-microtubule aux valeurs q inférieures sont plus longs que le temps de latence maximal de la matrice DDM calculée. Le temps de latence maximal est indiqué par la ligne rouge horizontale de la figure 9, et les temps de désintégration s’écartent de la mise à l’échelle prévue près de ces temps plus longs. Figure 8 : Matrice DDM par rapport au temps de latence pour un réseau composite actine-microtubule actif. La matrice DDM pour plusieurs valeurs de q est tracée en fonction du temps de latence à partir d’un film d’un réseau composite composé de monomères d’actine de 2,9 μM, de dimères de tubuline de 2,9 μM et de myosine de 0,24 μM. Ces données montrent l’analyse du canal microtubule d’une série chronologique multicolore d’images. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 9 : Temps de désintégration par rapport au nombre d’onde pour les réseaux actifs actine-microtubules. En ajustant la matrice DDM, on trouve le temps de désintégration, τ, en fonction du nombre d’onde, q. Tracé est τ vs q pour les images d’un réseau actif actine-microtubule (analysant uniquement le canal microtubule) en brun et pour les images d’un réseau actif d’actine en vert. Les deux réseaux ont les mêmes concentrations d’actine et de myosine (2,9 μM et 0,24 μM, respectivement); le composite actine-microtubule a 2,9 μM de dimères de tubuline. Les temps de désintégration du réseau actif d’actine sont beaucoup plus petits que les temps de désintégration du réseau actif actine-microtubule, ce qui indique un mouvement plus rapide du réseau d’actine actif. Dans les deux cas, la dynamique est balistique car les données suivent une tendance. Encadré : le tracé des FAI par rapport au temps de décalage mis à l’échelle par le nombre d’onde (Δt × q) montre un effondrement des FAI sur une plage de valeurs q. Cela indique également un mouvement balistique. Les FAI indiqués dans cet encadré proviennent du réseau actif d’actine. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Pour ces données de réseaux actifs, nous avons choisi d’adapter la matrice DDM, . Cela contraste avec ce qui a été fait pour les données des billes dans le réseau vimentin, où A (q) et B ont été estimés sans aucun ajustement pour isoler l’ISF, f (q, Δt). Dans ce cas, pour les données de réseau actif, A et B ont été laissés comme paramètres d’ajustement parce que les méthodes utilisées pour estimer B n’ont pas abouti à de bons ajustements. La méthode par défaut pour estimer B est de calculer et de supposer que, dans l’ensemble q, cela va à B/2. Cependant, cette méthode a surestimé B pour ces données, ce qui a été vu dans le fait que, lors du calcul des FAI à partir de B estimés de cette manière (non montrés), les FAI étaient supérieurs à 1 aux premiers temps de décalage (alors qu’ils devraient passer d’un maximum de 1 à zéro ou à un paramètre de non-urgence avec un temps de latence croissant). On peut sélectionner d’autres méthodes pour estimer B en utilisant le paramètre background_method. L’une de ces autres méthodes consiste à estimer B comme étant le minimum de la matrice DDM aux premiers temps de latence (défini avec background_method = 1). Une méthode similaire a été utilisée par Bayles et al.76, bien qu’ils n’aient pas supposé que B était constant avec q. Une autre option consiste à estimer B comme étant la valeur moyenne sur tous les temps de latence de la matrice DDM au maximum q (défini avec background_method = 2). Ces différentes méthodes d’estimation de l’arrière-plan, ainsi que les résultats permettant à B d’être un paramètre d’ajustement libre, sont illustrés à la figure 10. À partir de ces graphiques, on peut voir que l’amplitude, A, n’a pas atteint zéro aux plus grandes valeurs q sondées, puisqu’elle n’a pas plafonné à l’ensemble q (figure 10B), et puisque D(qmax, Δt) est passée d’un plateau de temps de décalage inférieur à un plateau de temps de décalage plus élevé (c’est-à-dire qu’à qmax, il y avait un A non nul; Figure 10D). Par conséquent, ni estimer B ni ce qui serait approprié. Il faut inspecter vs. q et D(qmax, Δt) vs. Δt avant de décider comment (ou si) estimer B. Figure 10 : Arrière-plan par rapport au nombre d’onde pour les réseaux actifs actine-microtubules. En ajustant la matrice DDM, on peut trouver l’arrière-plan, B, en fonction du nombre d’onde, q. B vsq  est  montré pour les images d’un réseau actif actine-microtubule (en analysant uniquement le canal microtubule) déterminé à partir de ces correspondances avec les symboles violets. Les trois lignes pleines en (A) montrent des estimations de l’arrière-plan trouvé sans aucun ajustement. La ligne la plus sombre du haut en (A) montre l’arrière-plan estimé en utilisant , ce qui peut être approprié si les plateaux à une valeur constante à q large. À partir de (B), notez qu’il n’a pas encore atteint une valeur constante au plus grand q sondé. Par conséquent, l’utilisation de cette méthode surestime l’arrière-plan. La ligne de fond dans (A) montre l’arrière-plan estimé à l’aide de . Si la matrice DDM montre un plateau de temps de décalage faible comme indiqué en (C) avec la ligne rouge, cette méthode peut être appropriée pour estimer l’arrière-plan. La ligne médiane la plus claire en (A) montre l’arrière-plan estimé à partir de . Cette méthode peut être appropriée si, à qmax, l’amplitude, A, a atteint zéro. À partir de (D), on voit que l’amplitude est non nulle et, par conséquent, cette méthode surestime l’arrière-plan. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure supplémentaire S1 : Distributions de probabilité des déplacements de particules. Les distributions de probabilité des déplacements de particules montrent une non-gaussianité pour des concentrations de vimentine de 34 μM et 49 μM. Un suivi monoparticulaire de billes de 0,6 μm de diamètre a été effectué dans des réseaux de vimentine de concentrations différentes. Différents temps de latence sont indiqués dans les distributions de déplacement pour les trois conditions. (A) La distribution des déplacements de particules dans un réseau de vimentine de 19 μM est adaptée à une fonction gaussienne. La largeur du gaussien augmente avec l’augmentation du temps de latence. (B) La distribution des déplacements de particules dans un réseau de vimentine de 34 μM montre plus de non-gaussianité, en particulier pour les grands déplacements, que pour le cas de 19 μM. (C) La distribution des déplacements de particules dans un réseau de vimentine de 49 μM montre également une non-gaussianité. De plus, les largeurs des distributions n’augmentent pas avec le temps de latence de manière aussi significative que dans les échantillons avec des concentrations de vimentine plus faibles, ce qui indique un mouvement confiné. Les distributions de van Hove non gaussiennes (observées pour tous les échantillons de vimentine mais plus apparentes dans les concentrations plus élevées) sont associées à une dynamique hétérogène comme on le voit souvent dans le transport de particules dans des environnements surpeuplés et confinés. Un autre indicateur de transport hétérogène qui est déterminé à partir de l’analyse DDM est l’exposant d’étirement utilisé pour s’adapter à la fonction de diffusion intermédiaire (le paramètre s dans l’équation de l’ISF utilisé ici: + ). Les exposants d’étirement moyens sur la plage q de 0,4 μm-1 à 9,4 μm-1 sont, de la concentration de vimentine la plus élevée à la plus faible, de 0,53 ± 0,07, 0,64 ± 0,02 et 0,86 ± 0,04 (écart type moyen ±). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier. Figure supplémentaire S2 : Les fonctions de diffusion intermédiaires de DDM et SPT. Les fonctions de diffusion intermédiaire (ISF) pour cinq nombres d’onde différents sont affichées. L’ISF par rapport au temps de latence trouvé par DDM est tracé avec des marqueurs circulaires, et l’ISF calculé à partir de trajectoires à particule unique avec des carrés ouverts. Des lignes noires pointillées indiquent les ajustements aux FAI acquis par DDM. L’ISF est calculé à partir de trajectoires monoparticulaires, , en utilisant . En (A), l’ISF est représenté pour des particules de 0,6 μm dans les réseaux de vimentine de 19 μM. En (B), l’ISF est représenté pour les particules de 0,6 μm dans les réseaux de vimentine de 34 μM. Les écarts dans le FSI constatés à partir du DDM et du SPT sont probablement dus à un nombre limité de trajectoires de temps de long décalage. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier. Fichier supplémentaire 1 : Protocole d’utilisation de DDM. L’entrée et la sortie des étapes indiquées dans le protocole sont présentées. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier. Fichier supplémentaire 2 : Détails de la préparation des échantillons et exemples de fichiers de paramètres pour les réseaux vimentin. Des étapes détaillées pour la préparation des échantillons et l’acquisition d’images sur les réseaux vimentin sont fournies. En outre, un exemple de fichier de paramètres pour l’analyse des données présentées dans la section des résultats représentatifs sur les réseaux vimentin est également fourni. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.