تحديد ديناميكيات الهيكل الخلوي باستخدام المجهر الديناميكي التفاضلي

هنا ، نعرض أمثلة على التحليل الذي تم إجراؤه باستخدام PyDDM من مجموعتين مختلفتين من التجارب. وفي مجموعة واحدة من التجارب، تم تضمين حبات التتبع دون الميكرون في شبكات تتكون من فيمنتين بروتين الخيوط الوسيطة وتم تصويرها باستخدام عدسة موضوعية 100x في وضع برايتفيلد عند 100 إطار/ثانية (الشكل 3A). يتم التعبير عن Vimentin في الخلايا الوسيطة وهو محدد رئيسي للخصائص الميكانيكية للسيتوبلازم65 والاستقرار الميكانيكي للنواة في الخلايا التي تؤدي هجرة محصورة66,67. حتى الآن ، تمت دراسة شبكات vimentin المعاد تشكيلها في المقام الأول بواسطة الريولوجيا العيانية64,68,69 ، في حين أن الديناميكيات لم تحظ باهتمام يذكر نسبيا 13,70,71. يمكن العثور على تفاصيل إضافية عن هذه التجارب في الملف التكميلي 2. في المجموعة الأخرى من التجارب ، تم إعداد شبكات الهيكل الخلوي النشطة باستخدام الأكتين والأنابيب الدقيقة والميوسين. سمحت الملصقات الفلورية المتميزة الطيفية بتصوير خيوط الأكتين والأنابيب الدقيقة باستخدام مجهر بؤري بؤري المسح الضوئي بالليزر بلونين باستخدام عدسة موضوعية 60x عند 2.78 إطار / ثانية (الشكل 3B ، C). خيوط الأكتين والأنابيب الدقيقة كلاهما محركان مهمان لتغيرات شكل الخلية الديناميكية ، مع تنسيق إجراءاتهما من خلال التفاعلات الميكانيكية والكيميائية الحيوية72. يمكن العثور على تفاصيل إضافية عن هذه التجارب في11. يتم عرض الإطارات الفردية من تسلسلات الصور الملتقطة في هذه التجارب في الشكل 3. الشكل 3: صور من السلسلة الزمنية التي تم تحليلها . (أ) صورة برايتفيلد لخرز 0.6 ميكرومتر في شبكة vimentin. (ب، ج) صورة للأنابيب الدقيقة (B) و (C) الأكتين في مركب نشط من الأكتين والأنابيب الدقيقة تم التقاطه بهدف 60x على مجهر بؤري بؤري المسح الضوئي بالليزر ، باستخدام ضوء إثارة 561 نانومتر لتصوير microtubule وضوء إثارة 488 نانومتر لتصوير الأكتين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. بالنسبة لصور خرز التتبع في شبكات vimentin ، تم تسجيل أفلام من 5000 إطار بحجم 512 × 512 بكسل في 100 إطار / ثانية. من هذه ، تم حساب مصفوفة DDM في 60 وقت تأخير متباعد لوغاريتميا بين 1 و 1000 إطار ، أو 0.01 ثانية و 10 ثانية. لتقدير الخلفية ، تم حساب B ، متوسط الصور المحولة إلى فورييه التربيعية ، وتعيينها مساوية ل 55,73. تم افتراض أن هذه الكمية تساوي B/2 وأن B مستقلة عن q على أكبر 10٪ من قيم q. هذه هي الطريقة الافتراضية للحزمة لتقدير B، ولكن هناك طرق أخرى ممكنة عن طريق تعيين معلمة background_method إلى قيمة مختلفة. مع تحديد المعلمتين A (q) و B من ، يمكن للمرء استخراج دالة التشتت الوسيطة (ISF) من مصفوفة DDM. ويرد في الشكل 4 أمثلة على أطر الدعم الدولية. في الشكل 4A ، يظهر ISF من صور خرزات قطرها 0.6 ميكرومتر مدمجة في شبكة بتركيز vimentin يبلغ 19 ميكرومتر. في الشكل 4B ، يظهر ISF لنفس النوع من الخرز في شبكة بتركيز vimentin يبلغ 34 ميكرومتر. ومن المثير للاهتمام أنه في كلتا الحالتين لم تتحلل قوى الأمن الداخلي إلى الصفر. في أوقات التأخر الكبيرة ، يجب أن تقترب ISF من الصفر للأنظمة الإرغودية. أي أنه في مثل هذه الأنظمة ، يجب أن ترتبط تقلبات الكثافة تماما خلال أوقات التأخير الكبيرة. حقيقة أن قوى الأمن الداخلي هنا لم تتحلل إلى الصفر يمكن أن تكون ناتجة عن تقديرات غير دقيقة ل A(q) و B ، والتي تم استخدامها للعثور على ISF من مصفوفة DDM المحسوبة. والجدير بالذكر أن الطريقة المستخدمة هنا يمكن أن تبالغ في تقدير B في بعض السيناريوهات62. ومع ذلك ، فمن المرجح أن تكون ديناميكيات حبات التتبع غير إرغودية حقا لأن الخرز له حجم مماثل لحجم شبكة الشبكة ، وبالتالي قد يصبح في قفص. وأكدت بيانات أخرى اكتشاف عدم الارتقاء. أي أن حجم الخرزة ، 0.6 ميكرومتر ، كان أكبر من متوسط القيمة المحسوبة لأحجام الشبكة البالغة 0.4 ميكرومتر لتركيز 19 ميكرومتر و 0.3 ميكرومتر لتركيز 34 ميكرومتر. بالإضافة إلى ذلك ، أظهرت نتائج تتبع الجسيمات المفردة لهذه الخرز المقتفي ، والتي تظهر لاحقا ، حركة محصورة. الشكل 4: دوال التشتت الوسيطة عند عدة أرقام موجية لشبكات الفيمنتين. يتم رسم ISF كدالة لوقت التأخر لقيم q من حوالي 1 إلى 9 ميكرومتر-1. (أ) قوى الأمن الداخلي من صور خرز 0.6 ميكرومتر في شبكة فيمنتين بتركيز فيمنتين 19 ميكرومتر. (ب) قوى الأمن الداخلي من صور خرز 0.6 ميكرومتر في شبكة فيمنتين بتركيز فيمنتين 34 ميكرومتر. تشير الهضبة الزمنية الطويلة ل ISF بقيمة أعلى بكثير من الصفر إلى عدم الثبات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. بالنظر إلى أن الديناميكيات من المحتمل أن تكون غير إرغودية ، فإن ISFs مناسبة للشكل ، حيث C هو عامل عدم الإرغودية 32. وقد استخدم هذا الشكل من ISF في دراسات سابقة للديناميكيات غير الإرغودية ، مثل تلك الخاصة بالمواد الهلامية الغروية32,74 أو جزيئات التتبع في شبكات الأكتين microtubule 10. الخطوط السوداء المنقطة في الشكل 4 تظهر التناسبات جنبا إلى جنب مع البيانات. من هذه النوبات ، يمكن للمرء الآن أن ينظر إلى الاعتماد على q لوقت الاضمحلال ، τ ، ومعلمة عدم الإرغودية ، C. الشكل 5: زمن الاضمحلال مقابل الرقم الموجي لشبكات الفيمنتين. من النوبات إلى ISF ، يتم تحديد وقت الاضمحلال τ لمجموعة من قيم q . للتوضيح ، نحن لا نعرض قيمة τ لكل q ، ولكن مجرد مجموعة متباعدة لوغاريتميا. باللون الأزرق (tan) هي البيانات من صور خرز 0.6 ميكرومتر داخل شبكات vimentin بتركيز vimentin يبلغ 19 ميكرومتر (34 ميكرومتر). تمثل أشرطة الخطأ الانحرافات المعيارية في τ عبر أفلام متعددة (أربعة أفلام للبيانات مع شبكة 19 ميكرومتر [أزرق] وخمسة أفلام للبيانات مع شبكة 34 ميكرومتر [tan]). تشير الخطوط الحمراء المنقطة إلى الحدود المقدرة للدقة الزمنية والمكانية، كما هو موضح في النتائج. يظهر الخط الأسود الصلب التحجيم ، مما يشير إلى حركة منتشرة. لا تتبع أي من مجموعتي البيانات هذا القياس. بدلا من ذلك ، تظهر الخرز في شبكة 19 ميكرومتر حركة شبه منتشرة (مع β > 2) ، وتظهر الخرز في شبكة 34 ميكرومتر حركة محصورة أو محبوسة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. أظهرت أوقات الاضمحلال قدرا كبيرا من عدم اليقين ، سواء عند الحد الأقصى المنخفض q أو المرتفع q ، كما هو موضح في الشكل 5. تظهر أشرطة الخطأ على هذه المؤامرة الانحراف المعياري بين أربعة مقاطع فيديو تم تحليلها لحالة تركيز vimentin الأقل أو خمسة مقاطع فيديو تم تحليلها للتركيز الأعلى. لفهم مصدر عدم اليقين الكبير في هذه الحدود القصوى ، فكر في كل من الدقة الزمنية والمكانية. يتم عرض الحدود التقريبية للدقة بثلاثة خطوط حمراء منقطة بشرطة. يتوافق الخطان الأفقيان مع الحد الأدنى والحد الأقصى لأوقات التأخير التي تم فحصها. بالنظر إلى معدل الإطارات البالغ 100 إطار / ثانية والحد الأقصى لوقت التأخر المقابل ل 1000 إطار (20٪ من إجمالي مدة الفيديو) ، فقد فقدت الدقة عند قياس الديناميكيات التي تحدث بشكل أسرع من 0.01 ثانية أو أبطأ من 10 ثوان. في قيم q السفلى ، كانت القيم المجهزة ل τ أكبر من 10 s. لذلك ، ينبغي توقع وجود شكوك كبيرة في أوقات الاضمحلال التي تكون أكبر من الحد الأقصى لوقت التأخير. في الطرف الأعلى من نطاق q، اقترب وقت الاضمحلال من الحد الأدنى لوقت التأخر البالغ 0.01 ثانية ولكنه ظل فوقه. بدلا من أن تكون محدودة بالدقة الزمنية ، عند هذه القيم q الأعلى ، قد تكون الدقة المكانية هي العامل المحدد. بالنظر إلى حجم البكسل البالغ 0.13 ميكرومتر ، كانت أكبر قيمة ل q حوالي 24 ميكرومتر-1. ومع ذلك، فإن الدقة المحدودة للحيود لا تسمح بالضرورة بقياسات دقيقة للديناميات عند هذه الترددات المكانية العالية. يؤدي تقريب الدقة البصرية إلى حد أعلى للعدد الموجي يبلغ حوالي 16 ميكرومتر-1 ، بالنظر إلى الفتحة العددية للعدسة الموضوعية ، NA ، البالغة 1.4 والطول الموجي للضوء ، . يتم تمييز ذلك بالخط العمودي الأحمر المنقط في الشكل 5. في الواقع ، كانت البيانات صاخبة في قيم كبيرة من q. حتى قبل هذا الحد الأعلى التقريبي ل q ، شوهد عدم اليقين المتزايد في τ ، ويمكن أن يكون هذا من المبالغة في تقدير qmax. قد تكون الدقة البصرية الرديئة مما كان متوقعا بسبب استخدام عدسة غمر الزيت للتصوير خارج الغطاء في عينة مائية أو لأن عدسة المكثف كانت محاذاة بشكل غير كامل. بالنسبة للحبات التي تبلغ سعتها 0.6 ميكرومتر المضمنة في الشبكة الأقل تركيزا (19 ميكرومتر فيمنتين)، يمكن ملاحظة من مخطط سجل سجل زمن الاضمحلال مقابل الرقم الموجي أن وقت الاضمحلال انخفض مع الرقم الموجي بطريقة تتفق مع قانون القدرة (الشكل 5). ومع ذلك ، لا يبدو أنه يتبع ما هو متوقع للحركة المنتشرة العادية ، حيث . بدلا من ذلك ، انخفض τ بشكل أكثر حدة مع زيادة q. هذا يدل على الحركة دون الانتشار ، والتي غالبا ما تحدث للحبات في بيئات مزدحمة مثل هذه. تركيب τ(q) على مدى 1.4 ميكرومتر-1 إلى 12.3 ميكرومتر-1 لقانون قوة من النموذج τ = 1/Kq β ينتج معلمات النقل K = 0.0953 μm β / s و β = 2.2. بالنسبة لأولئك الأكثر اعتيادا على التفكير في الانتشار الطبيعي مقابل الانتشار الفرعي من حيث متوسط الإزاحة التربيعية (MSD) لجسيمات التتبع كدالة لوقت التأخر (أي MSD = K’ Δ t α) ، من المفيد أن ندرك أن أس القياس دون الانتشار في معادلة MSD ، α ، يعادل α = 2 / β. وبعبارة أخرى، فإن قيمة β = 2.2 تتفق مع أس القياس الفرعي المنتشر في معادلة MSD α = 0.9. يمكن للمرء تعيين PyDDM لتناسب τ(q) عبر هذا النطاق من قيم q عن طريق تحديد مؤشرات صفيف q إما مع المعلمة Good_q_range في ملف YAML أو عن طريق تمرير الوسيطة الاختيارية forced_qs إلى الدالة generate_fit_report. نطاق q من 1.4 μm-1 إلى 12.3 μm-1 ، بالنسبة للبيانات هنا ، يتوافق مع مؤشرات مصفوفة q من 15 إلى 130. بالنسبة للحبات 0.6 ميكرومتر في الشبكة الأكثر تركيزا (34 ميكرومتر) ، أظهر وقت الاضمحلال اعتمادا ضئيلا على q. من المحتمل أن يكون هذا بسبب عدم وجود خرز في شبكة ذات حجم شبكة أصغر. للتحقيق في عدم الإرغودية في هذا النظام ، يجب رسم معلمة عدم الإرغودية ، C ، كدالة ل q ، كما في الشكل 6. بالنسبة للخرز 0.6 ميكرومتر في شبكة vimentin 19 ميكرومتر ، ≈ C 0.2 مع القليل من الاعتماد على q (غير معروض). ومع ذلك، بالنسبة للشبكة التي تحتوي على 34 ميكرومتر فيمنتين وللشبكة ذات التركيز الأعلى من 49 ميكرومتر فيمنتين، كان سجل C متناسبا مع q2 كما هو موضح في الشكل 6. هذه العلاقة بين C و q متوقعة للحركة المحدودة. بالنسبة للخرز المحاصر داخل جيوب الشبكة ، من المتوقع أن يستقر MSD في أوقات تأخير طويلة بما فيه الكفاية (أي ، أين هو MSD و δ2 هو الحد الأقصى MSD). نظرا لأنه يمكن التعبير عن ISF من حيث MSD ك ، وبما أن ISF غير الإرغودي يذهب إلى C في أوقات تأخير طويلة (أي ، ) ، يتم الحصول على العلاقة 32,75. لذلك ، يمكن للمرء استخدام C (q) للعثور على δ 2 ، وهذا أسفر عن δ 2 = 0.017 ميكرومتر 2 و 0.0032 ميكرومتر 2 لشبكات vimentin 34 و 49 ميكرومتر ، على التوالي (المقابلة δ = 0.13 ميكرومتر و 0.057 ميكرومتر). الشكل 6: معلمة عدم الإرغودية مقابل الرقم الموجي لشبكات الفيمنتين. من التناسبات إلى ISF ، يتم تحديد معلمة عدم الإرغودية C لمجموعة من قيم q . في تان (أحمر) هي البيانات من صور خرز 0.6 ميكرومتر داخل شبكات vimentin مع تركيز vimentin من 34 μM (49 μM). تمثل أشرطة الخطأ الانحرافات المعيارية في τ عبر أفلام متعددة (خمسة أفلام للبيانات مع شبكة 34 ميكرومتر [tan] وأربعة أفلام للبيانات مع شبكة 49 ميكرومتر [أحمر]). يحتوي المحور y على مقياس لوغاريتمي. يلاحظ المرء اعتماد q ل C الذي يلي ، والذي يسمح باستخراج الحد الأقصى لمتوسط الإزاحة التربيعية ، δ2. تناسبها تظهر مع الخطوط الصلبة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. يمكن للمرء استخدام طرق أخرى لاستخراج حجم الحبس δ من البيانات بالإضافة إلى الأس دون المنتشر الموجود من فحص τ(q) للخرز داخل شبكة vimentin 19 ميكرومتر. أولا ، يمكن للمرء استخدام الطريقة التي وصفها Bayles et al.76 و Edera et al.77 لاستخراج MSD من مصفوفة DDM. والجدير بالذكر أن هذه الطريقة لا تتطلب أي ملاءمة لمصفوفة DDM. يحتاج المرء فقط إلى حساب مصفوفة DDM ، D (q ، Δt) ، و (التي يمكن من خلالها تحديد A (q) و B). ثم ، للعثور على MSD ، يستخدم المرء العلاقة . لاحظ أن هذه الطريقة للعثور على MSD تفترض أن توزيع إزاحات الجسيمات هو Gaussian ، على الرغم من أن العمل السابق أظهر أنه في بعض الحالات ، تتفق MSDs المشتقة من DDM مع MSDs من تتبع الجسيمات ، حتى عندما تكون الإزاحات غير Gaussian73. وبالنسبة لهذا النظام، وكما هو متوقع78، هناك عدم غاوسية في توزيع الإزاحات الكبيرة، كما هو مبين في الشكل S1. في حزمة PyDDM ، يجب تنفيذ الدالة extract_MSD ، والتي ترجع . ثانيا ، يمكن للمرء استخدام تتبع الجسيمات المفردة للعثور على MSD. على الرغم من أنه يمكن استخدام DDM لتحليل الصور حيث تحظر الكثافة العالية للجسيمات أو الدقة البصرية المحدودة توطين الجسيمات بدقة ، بالنسبة لصور حبات 0.6 ميكرومتر في شبكات vimentin ، تمكنا من توطين وتتبع الخرز باستخدام برنامج trackpy (https://github.com/soft-matter/trackpy)79. تستخدم حزمة برامج تتبع الجسيمات هذه الخوارزميات التي وصفها Crocker و Grier80. الشكل 7: متوسط الإزاحة المربعة مقابل وقت التأخر لشبكات vimentin. تم تحديد MSD باستخدام طريقتين. أولا ، تم حساب MSD من مصفوفة DDM (الموضحة برموز صلبة). بعد ذلك ، تم تحديد MSD باستخدام تتبع الجسيمات المفردة (SPT) للعثور على مسارات الجسيمات (الرموز المفتوحة). يتم تحديد أشرطة الخطأ بنفس الطريقة الموضحة في أسطورتي الشكل السابقتين. (أ) تشير MSDs لخرز 0.6 ميكرومتر في شبكة vimentin 19 ميكرومتر إلى حركة دون الانتشار ، مع وجود اتفاق جيد بين طريقتي العثور على MSD. (ب) تشير MSDs لخرز 0.6 ميكرومتر في شبكة vimentin 49 ميكرومتر إلى حركة قفص ، مع اتفاق جيد بين طريقتي العثور على MSD ومع الحد الأقصى MSD الموجود من معلمة nonergodicity. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. ويبين الشكل 7 MSDs مقابل وقت التأخر لخرز 0.6 ميكرومتر في شبكة vimentin 19 ميكرومتر وفي شبكة vimentin 49 ميكرومتر. في كلتا الحالتين ، وافق MSD المحدد من DDM بشكل جيد مع MSD الموجود من خلال تتبع الجسيمات المفردة (SPT). علاوة على ذلك ، بالنسبة للشبكة الأقل تركيزا ، كان أس التحجيم الفرعي (α في) حوالي 0.9. وهذا يتسق مع قياس τ(q) للكائن عن طريق تركيب ISF لتحديد τ(q) (أي 2/2.2 = 0.9). بالنسبة للشبكة الأكثر تركيزا ، فإن هضاب MSD في أوقات تأخير أطول. كان الحد الأقصى ل MSD الذي تم العثور عليه من خلال تحليل اعتماد q-لمعلمة عدم الإرغودية (الموضحة في الشكل 7B مع الخط الأفقي عند δ 2 = 0.0032 μm 2) هو تقريبا نفس القيمة التي يبدو أن MSDs من كل من SPT و DDM تستقر نحوها. وهناك تباين بين أطول فترات التأخر التي حددتها MSDs من DDM وSPT في الشكل 7A. في حين أن هذا قد يكون بسبب عدد محدود من مسارات التأخر الزمني الطويل ، فقد يكون الحال أيضا أن زيادة تحسين نطاق قيم q التي تستخدم مصفوفة DDM لتقديرها لكل وقت تأخير (كما فعل Bayles et al.76 و Edera et al.77) من شأنه أن يحسن نتائجنا ، وسيكون هذا التحسين محور العمل في المستقبل. سمحت هذه التجارب التي تم فيها تسجيل تسلسلات الصور لخرز التتبع المضمن في شبكة من خيوط vimentin الوسيطة بإجراء تحليلات مستقلة: DDM (باستخدام الحزمة الموضحة هنا) و SPT (باستخدام trackpy). يمكن أن يكشف كلا التحليلين عن درجة الانتشار الفرعي وطول الحبس ، مما يسمح للمرء باستخدام تقنيتين مستقلتين لتحليل الصور لتوفير مقاييس تكميلية. هناك كميات إضافية يمكن للمرء مقارنتها من SPT و DDM. على سبيل المثال، يمكن أن يكشف عدم التجانس في ديناميكيات العينة عن نفسه على أنه غير غاوسي في توزيع إزاحات الجسيمات (أي توزيع فان هوف) المحددة من SPT، وكذلك في ISF المحدد من DDM الذي يتناسب مع الأس الممتد34,35. يوضح الشكل S1 توزيع فان هوف لجسيمات 0.6 ميكرومتر في شبكات vimentin ويناقش الأس الممتد الموجود من تركيب ISFs – المقاييس المستخدمة جنبا إلى جنب في الدراسات السابقة لإثبات الديناميكيات غير المتجانسة للجسيمات داخل أنظمة المحاكاة الحيوية 9,10,47 أو غيرها من البيئات المزدحمة 34 . وكمثال آخر، يمكن حساب قوى الأمن الداخلي من مسارات الجسيمات المقاسة باستخدام SPT ومقارنتها ب ISFs التي تم الحصول عليها من DDM. في حين أن متوسط الإزاحات التربيعية وتوزيعات الإزاحة هي المقاييس التي غالبا ما يتم سحبها من تحليل SPT ، يمكن للمرء أيضا حساب ISF من مسارات الجسيمات ، باستخدام (انظر الشكل S2). يمكن مقارنة ISF هذا مع ISFs التي تم إنشاؤها بواسطة DDM واستخدامها للكشف عن الديناميكيات غير الواضحة في MSD59. وفي حين أن الحصول على صور لجسيمات التتبع داخل الشبكة قد يسمح للمرء باستخدام أساليب التحليل التكميلية ل SPT و DDM، فمن المهم ملاحظة أن ميزة DDM على SPT هي أنها لا تتطلب صورا للخرز (أو ميزات أخرى) يمكن توطينها وتعقبها بسهولة. ولتوضيح هذه النقطة، نسلط الضوء بعد ذلك على تحليل الشبكات النشطة لخيوط الأكتين والأنابيب الدقيقة، حيث يسمح وضع العلامات الفلورية للأكتين والتوبولين بتصوير كلا النوعين من الخيوط، المتميزين عن بعضهما البعض عبر الفلوروفورات المختلفة، باستخدام مجهر بؤري متعدد الألوان لمسح الليزر. تم الحصول على الصور باستخدام مجهر بؤري بؤري المسح الضوئي بالليزر لشبكات الأكتين – الأنابيب الدقيقة ذات النشاط المدفوع بالميوسين (الميوسين العضلي الهيكلي للأرانب II; الهيكل الخلوي #MY02). تم وصف تفاصيل التجارب والنتائج سابقا11 ، والنتائج التمثيلية المعروضة هنا هي من تحليل فيلمين مقدمين في المواد التكميلية (الفيلمان S1 و S4) ل11. تم تسجيل كلا تسلسلي الصور عند 2.78 إطار / ثانية ل 1000 إطار. لتحليل هذه الصور ، تم حساب مصفوفة DDM ل 50 مرة تأخير تتراوح من 0.4 ثانية إلى 252 ثانية (1 إطار إلى 700 إطار). ثم كانت مصفوفة DDM مناسبة للنموذج ، مع وظيفة التشتت الوسيطة هي . لذلك ، هناك أربعة معلمات مناسبة: A و τ و s و B. وتظهر نتائج هذه النوبات في الشكل 8. ولوحظ أن مصفوفة DDM لقيمة q معينة لها هضبة في أوقات تأخير منخفضة، وتزداد مع وقت التأخر، ثم تستقر (أو تظهر علامات البدء في الهبوط) في أوقات تأخر كبيرة. لم تصل مصفوفة DDM للقيم الدنيا من q إلى هضبة في أوقات التأخير الطويلة. لذلك ، ينبغي للمرء أن يتوقع دقة ضعيفة في قياس وقت الاضمحلال لهذه الديناميكيات المنخفضة q (مقياس الطول الكبير). أوقات الاضمحلال المميزة ، τ ، من النوبات إلى مصفوفة DDM موضحة في الشكل 9. يتم تقديم النتائج لشبكة مركبة نشطة من الأكتين والأنابيب الدقيقة (على غرار الفيلم S111) ولشبكة أكتين نشطة (على غرار الفيلم S411). تم إعداد كلتا الشبكتين بنفس تركيزات الأكتين والميوسين ، ولكن تم إنشاء شبكة الأكتين فقط بدون توبولين ، كما هو موضح في11. بالنسبة لهذين النوعين من الشبكات النشطة ، كانت علاقة قانون الطاقة المرصودة هي . يشير هذا التحجيم إلى الحركة الباليستية وأن الانكماش والتدفق المدفوع بالميوسين يهيمن على الحركة الحرارية للخيوط. من τ = (vq)-1 ، يمكن العثور على سرعة مميزة ، v ، تبلغ حوالي 10 نانومتر / ثانية لشبكة الأكتين – الأنابيب الدقيقة النشطة و 75 نانومتر / ثانية لشبكة الأكتين النشطة. تتوافق هذه القيم مع تحليل قياس سرعة صورة الجسيمات لمقاطع الفيديو نفسها الموضحة في11. لم يحافظ التحجيم على قيم q الدنيا للشبكة المركبة النشطة من الأكتين والأنابيب الدقيقة. ويرجع ذلك على الأرجح إلى أن أوقات الاضمحلال الحقيقية لهذه الشبكة المركبة من الأكتين والأنابيب الدقيقة عند قيم q الأدنى أطول من الحد الأقصى لوقت التأخر لمصفوفة DDM المحسوبة. يشار إلى الحد الأقصى لوقت التأخر بالخط الأحمر الأفقي في الشكل 9 ، وانحرفت أوقات الاضمحلال عن التحجيم المتوقع بالقرب من هذه الأوقات الأطول. الشكل 8: مصفوفة DDM مقابل وقت التأخر لشبكة مركبة نشطة من الأكتين والأنابيب الدقيقة. يتم رسم مصفوفة DDM لعدة قيم من q كدالة لوقت التأخر من فيلم لشبكة مركبة تتكون من مونومرات أكتين 2.9 ميكرومتر ، و 2.9 ميكرومتر توبولين دايمرات ، و 0.24 ميكرومتر ميوسين. تظهر هذه البيانات تحليل قناة الأنابيب الدقيقة فقط لسلسلة زمنية متعددة الألوان من الصور. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 9: زمن الاضمحلال مقابل الرقم الموجي لشبكات الأكتين والأنابيب الدقيقة النشطة. من تركيب مصفوفة DDM ، تم العثور على وقت الاضمحلال ، τ ، كدالة للرقم الموجي ، q. Plotted هو τ vs q لصور شبكة أكتين-ميكروبوبول نشطة (تحلل قناة microtubule فقط) باللون البني ولصور شبكة أكتين نشطة باللون الأخضر. ولكل من الشبكتين نفس تركيزات الأكتين والميوسين (2.9 ميكرومتر و0.24 ميكرومتر على التوالي)؛ يحتوي مركب الأكتين-microtubule على 2.9 ميكرومتر من التوبولين دايمر. أوقات الاضمحلال لشبكة الأكتين النشطة أصغر بكثير من أوقات الاضمحلال لشبكة الأكتين – الأنابيب الدقيقة النشطة ، مما يشير إلى حركة أسرع لشبكة الأكتين النشطة. في كلتا الحالتين ، تكون الديناميكيات باليستية حيث تتبع البيانات اتجاها. Inset: يظهر مخطط ISFs مقابل وقت التأخر الذي تم قياسه بواسطة الرقم الموجي (Δt × q) انهيار ISFs على نطاق من قيم q. هذا يشير أيضا إلى الحركة الباليستية. ISFs الموضحة في هذه المجموعة الداخلية هي من شبكة actin النشطة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. بالنسبة لهذه البيانات الخاصة بالشبكات النشطة ، اخترنا أن تناسب مصفوفة DDM ، . وهذا يتناقض مع ما تم القيام به لبيانات الخرز في شبكة vimentin ، حيث تم تقدير A (q) و B دون أي ملاءمة لعزل ISF ، f (q ، Δt). في هذه الحالة ، بالنسبة لبيانات الشبكة النشطة ، تم ترك A و B كمعلمات مناسبة لأن الطرق المستخدمة لتقدير B لم تسفر عن ملاءمة جيدة. الطريقة الافتراضية لتقدير B هي حساب وافتراض أن هذا ، بشكل عام q ، يذهب إلى B / 2. ومع ذلك ، فإن هذه الطريقة بالغت في تقدير B لهذه البيانات ، والتي شوهدت في حقيقة أنه عند حساب ISFs من B المقدرة بهذه الطريقة (غير معروضة) ، كانت ISFs أكبر من 1 في أوقات التأخر المبكرة (في حين أنها يجب أن تنتقل من الحد الأقصى من 1 إلى الصفر أو بعض معلمات عدم الإرغودية مع زيادة وقت التأخر). يمكن للمرء اختيار طرق أخرى لتقدير B باستخدام المعلمة background_method. واحدة من هذه الطرق الأخرى هي تقدير B ليكون الحد الأدنى من مصفوفة DDM في أوقات التأخر المبكرة (مضبوطة مع background_method = 1). تم استخدام طريقة مماثلة من قبل Bayles et al.76 ، على الرغم من أنهم لم يفترضوا أن B ثابت مع q. خيار آخر هو تقدير B ليكون متوسط القيمة على جميع أوقات التأخير لمصفوفة DDM عند الحد الأقصى q (المحدد مع background_method = 2). ويوضح الشكل 10 هذه الطرق المختلفة لتقدير الخلفية، فضلا عن نتائج السماح ل B بأن تكون معلمة ملائمة بحرية. ومن تلك المؤامرات، يمكن للمرء أن يرى أن السعة، A، لم تصل إلى الصفر عند أكبر قيم q التي تم فحصها، حيث لم تكن الهضبة عند q بشكل عام (الشكل 10B)، وبما أن D(q max, Δt) انتقلت من هضبة زمنية أقل إلى هضبة زمنية أعلى للتأخر (أي عند qmax، كان هناك A غير صفري؛ الشكل 10 دال). ولذلك، لا يقدر باء على النحو المناسب ولا كما هو مناسب. يجب على المرء أن يتفحص مقابل q و D (qmax ، Δ t) مقابل Δ t قبل اتخاذ قرار بشأن كيفية (أو إذا) تقدير B. الشكل 10: الخلفية مقابل الرقم الموجي لشبكات الأكتين – الأنابيب الدقيقة النشطة. من خلال تركيب مصفوفة DDM ، يمكن للمرء العثور على الخلفية ، B ، كدالة للرقم الموجي ، q. يظهر B مقابل q لصور شبكة نشطة من الأكتين والأنابيب الدقيقة (تحليل قناة الأنابيب الدقيقة فقط) المحددة من هذه التناسبات مع الرموز الأرجوانية. تظهر الخطوط الصلبة الثلاثة في (أ) تقديرات للخلفية التي تم العثور عليها دون أي ملاءمة. يظهر الخط العلوي الأكثر قتامة في (A) الخلفية المقدرة باستخدام ، والتي قد تكون مناسبة إذا كانت الهضاب إلى قيمة ثابتة بشكل عام q. من (B) ، لاحظ أنه لم يصل بعد إلى قيمة ثابتة عند أكبر q تم فحصه. لذلك ، باستخدام هذه الطريقة يبالغ في تقدير الخلفية. يوضح الخلاصة في (A) الخلفية المقدرة باستخدام . إذا أظهرت مصفوفة DDM هضبة زمنية منخفضة التأخر كما هو موضح في (C) مع الخط الأحمر ، فقد تكون هذه الطريقة مناسبة لتقدير الخلفية. يظهر الخط الأوسط والأخف وزنا في (A) الخلفية المقدرة من . قد تكون هذه الطريقة مناسبة إذا ، عند qmax ، وصلت السعة ، A ، إلى الصفر. من (D) ، يلاحظ أن السعة غير صفرية ، وبالتالي ، فإن هذه الطريقة تبالغ في تقدير الخلفية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل التكميلي S1: التوزيعات الاحتمالية لإزاحة الجسيمات. تظهر التوزيعات الاحتمالية لإزاحة الجسيمات عدم الغاوسية لتركيزات الفيمنتين البالغة 34 ميكرومتر و 49 ميكرومتر. تظهر أوقات تأخير مختلفة في توزيعات الإزاحة للشروط الثلاثة. (أ) يتناسب توزيع إزاحات الجسيمات في شبكة فيمنتين 19 ميكرومتر مع دالة غاوسية. يزداد عرض Gaussian مع زيادة وقت التأخير. (ب) يظهر توزيع إزاحات الجسيمات في شبكة فيمنتين 34 ميكرومتر قدرا أكبر من عدم الغاوسية، ولا سيما في حالات الإزاحة الكبيرة، مقارنة بالحالة البالغة 19 ميكرومتر. (ج) توزيع إزاحات الجسيمات في شبكة فيمنتين 49 ميكرومتر يظهر أيضا عدم الغاوسية. وعلاوة على ذلك، فإن عرض التوزيعات لا يزداد مع وقت التأخر بقدر ما هو الحال في العينات ذات التركيزات المنخفضة من الفيمنتين، مما يشير إلى الحركة المحصورة. ترتبط توزيعات فان هوف غير الغاوسية (التي شوهدت لجميع عينات الفيمنتين ولكن الأكثر وضوحا في التركيزات الأعلى) بديناميكيات غير متجانسة كما هو الحال غالبا في نقل الجسيمات في البيئات المزدحمة والمحصورة. مؤشر آخر للانتقال غير المتجانس الذي يتم تحديده من تحليل DDM هو أس التمدد المستخدم لتناسب دالة التشتت الوسيطة (المعلمة s في معادلة ISF المستخدمة هنا: + ). متوسط الأسس الممتدة على مدى Q من 0.4 ميكرومتر-1 إلى 9.4 ميكرومتر-1 هي، من أعلى تركيز فيمنتين إلى أدنى ±، 0.53 ± 0.07، 0.64 ± 0.02، و 0.86 0.04 (متوسط ± الانحراف المعياري). يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف. الشكل التكميلي S2: وظائف التشتت الوسيطة من DDM و SPT. تظهر دوال التشتت الوسيطة (ISF) لخمسة أرقام موجية مختلفة. يتم رسم ISF مقابل وقت التأخر الموجود من خلال DDM بعلامات دائرية ، ويتم حساب ISF من مسارات الجسيمات المفردة ذات المربعات المفتوحة. تظهر الخطوط السوداء المنقطة الملاءمة مع ISFs التي تم الحصول عليها من DDM. يتم حساب ISF من مسارات الجسيمات المفردة ، باستخدام . في (A) ، يظهر ISF لجسيمات 0.6 ميكرومتر في شبكات vimentin 19 ميكرومتر. في (B) ، يظهر ISF لجسيمات 0.6 ميكرومتر في شبكات vimentin 34 ميكرومتر. ومن المرجح أن تكون التناقضات في قوى الأمن الداخلي التي عثر عليها من DDM وSPT راجعة إلى عدد محدود من مسارات التأخر الزمني الطويل. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف. الملف التكميلي 1: بروتوكول لاستخدام DDM. يتم عرض مدخلات ومخرجات الخطوات الموضحة في البروتوكول. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف. الملف التكميلي 2: تفاصيل إعداد العينات وملفات المعلمات النموذجية لشبكات vimentin. يتم توفير خطوات مفصلة لإعداد العينات والحصول على الصور على شبكات vimentin. بالإضافة إلى ذلك ، يتم أيضا توفير مثال على ملف المعلمات لتحليل البيانات المقدمة في قسم النتائج التمثيلية حول شبكات vimentin. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.