Экспериментальная модель для оценки разрешения пневмонии

Все протоколы содержания животных, описанные в этом исследовании, были одобрены Комитетом по институциональному уходу за животными и их использованию (ACUC) в Школе медицины Университета Джона Хопкинса для протокола MO21M160 животных. Кроме того, эксперименты проводились в соответствии с институциональными, государственными и федеральными правилами исследований на животных. ВНИМАНИЕ: Воспроизведение всех описанных ниже протоколов должно быть выполнено в шкафу уровня биобезопасности 2 (BSL-2) в соответствии со всеми институциональными рекомендациями BSL-2 в кабинете биобезопасности. 1. Осаждение бактериальных запасов из коммерческих контуров ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол может быть использован для выращивания бактериальных запасов для Spn (ATCC 49619) и Kpn (ATCC 43816), начиная с культовых петель, полученных от поставщика (подробнее см. Таблицу материалов ). Нагрейте тарелку с 5% овечьей кровью в течение 15 минут при температуре 37 °C в инкубаторе. Для этой цели можно использовать клеточный инкубатор. Под капюшоном снимите оболочку с петли для бактериальной инокуляции и аккуратно распределите ее, пронизывая агаровую пластину, по зигзагообразной схеме. Повторите этот шаг, используя отдельную пластину в качестве дубликата. Одной петлей можно прорезать до пяти пластин. Инкубируйте планшеты в течение ночи при температуре 37 °C для оптимального роста бактерий. Выводите бактерии ежедневно в течение 3 дней. Нагрейте кровяные агаровые пластины в течение 15 минут при 37 °C, возьмите от 15 до 20 колоний из первой агаровой пластины с помощью одноразовой инокуляционной петли и распределите их в новую, предварительно нагретую агаровую пластину. Нанесите соответствующую маркировку на табличку. 2. Размножение бактерий и их хранение впрок Через 3 дня соберите до 30 колоний из кровяного агарового планшета с помощью петли полосы и поместите его непосредственно в колбу объемом 250 мл с бульоном Тодда Хьюитта (бульон TH). Инкубировать при 37 °C, встряхивая при 250 об/мин, с 5%CO2 в течение примерно 4 ч. Принимайте аликвоты каждые 15 минут, чтобы измерить наружный диаметр620 нм, пока он не достигнет 0,3, что эквивалентно примерно 3 x 108 колониеобразующим единицам (КОЕ) на мл. Выделите 1 мл нового бактериального запаса сразу в криогенные флаконы объемом 2 мл. Свежеаликотированные флаконы мгновенной заморозки в жидком азоте на 5 минут. Храните аликвоты бактерий в морозильной камере при температуре -80 °C (флаконы можно использовать до 6-8 месяцев, прежде чем они потеряют эффективность). После 7 дней заморозки аликвоты можно использовать для исследований на животных. Поэтому определите новую концентрацию бактерий. 3. Размораживание бактерий для интратрахеального закапывания Нагрейте тарелку с кровяным агаром в течение 10 минут при температуре 37 °C в шейкере. Достаньте один из новых флаконов из морозильной камеры и разморозьте его путем осторожного перемешивания на водяной бане при температуре 37 °C в течение примерно 2 минут. Не прикасайтесь к уплотнительному кольцу или колпачку теплой водой. Пластина на кровяной агаровой пластине для ручного подсчета колоний бактерий. Проведите разведение 1 x 10-6 и налейте 200 мкл от последнего разведения в предварительно подогретую кровяную агаровую пластину. Делайте это в двух экземплярах. Инкубируйте планшеты в течение ночи при температуре 37 °C для оптимального роста бактерий. На следующий день примените следующую формулу для определения новой концентрации бактерий: КОЕ/мл = (количество колоний х коэффициент разбавления) / объем посуды 4. Интратрахеальное закапывание живых бактерий ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол был оптимизирован для закапывания объема 50 мкл внутритрахеально. Бактериальные запасы могут храниться до 6-9 месяцев. Чтобы обеспечить наличие бактериальных КОЕ в каждом флаконе, обязательно наносите его на тарелку перед каждым экспериментом, рассчитывайте бактериальный запас КОЕ, как описано выше, и используйте бульон TH для последующих разведений. ВНИМАНИЕ: Под шкафом биобезопасности проведите процедуру выживания грызунов с использованием стерильных хирургических инструментов. Обезболите мышь путем внутрибрюшинного введения 100 мг/кг кетамина и 2,5 мг/кг ацетилпромазина. Повторите то же самое для количества мышей, которым вводится инъекция за один раз.ПРИМЕЧАНИЕ: Мыши могут подвергаться воздействию изофлурана для облегчения работы с животными. Тем не менее, опытный дрессировщик, способный вводить внутрибрюшинные анестетики, не вызывая значительного стресса у животного, может избежать воздействия изофлурана. Количество мышей для инъекции зависит от опыта хирурга. После того, как все мыши находятся под соответствующей анестезией, подтвердите анестезию щипцом хвоста. Поместите мышь, находящуюся под наркозом, на чистую и стерилизованную поверхность, подвесьте животное за резцы и аккуратно обмотайте передние конечности скотчем (рисунок 1А).ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы обеспечить хорошее самочувствие животных, обеспечьте смазку роговицы всем животным, находящимся под наркозом. Можно использовать глазные капли с карбоксиметилцеллюлозой, нанося по одной капле на глаз. Побрейте область шеи и продезинфицируйте область хлоргексидином и 70% спиртом. С помощью хирургических ножниц сделайте поверхностный разрез по средней линии шеи на 1 см, чтобы визуализировать трахею (рисунок 1B). Одного небольшого разреза должно быть достаточно, но если видно обилие жировой ткани, тщательно рассеките жировую ткань вертикально, чтобы визуализировать трахею.ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте стерильные перчатки и стерильные инструменты с помощью техники «только наконечники». Риск инфицирования минимален, если процедура проводится в стерильных условиях. С помощью щипцов интубируйте каждую мышь. Осторожно вытяните язык наружу и введите через рот ангиокатетер 20 G, продвигая катетер в трахею. Слегка надавите на трахею, чтобы облегчить интубацию.ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку трахея находится спереди от тела мыши, слегка согните кончик катетера, так как это поможет получить угол для успешной интубации мыши. Разрез на шее выполняется в основном в целях визуализации; В качестве альтернативы оператор может интубировать трахею вслепую. После интубации подключите мышь к респиратору для подтверждения интубации. Стандартные параметры аппарата ИВЛ, используемые при этой процедуре, составляют 200 мкл объема при работе и 200 ходов в минуту. Кратковременно увеличьте и/или уменьшите мощность вентилятора для быстрого и легкого подтверждения. После подтверждения интубации отсоедините мышь от респиратора и осторожно введите 50 мкл бактериального агента через ангиокатетер с помощью насадочного наконечника для дозатора 200 мкл пипетки. Контрольным мышам вводят 50 μл стерильного бульона TH. После закапывания бактериального агента снова подключите мышь к респиратору, чтобы помочь возобновить дыхание. Оставьте мышь на респираторе на 30-60 с. После инъекции всем мышам следите за их дыханием. Если дыхание замедлилось, снова подключите мышей к респиратору. Закройте разрез, добавив одну небольшую каплю клея на кожу. Сведите вместе кожные складки и слегка надавите, пока клей не высохнет. Поместите мышей на грелку для восстановления и внимательно наблюдайте за ними, пока они не придут в сознание. Перенесите мышей обратно в клетку после полного выздоровления. Для послеоперационного купирования боли/дистресса мышей можно лечить бупренорфином в дозе 0,05-0,1 мг/кг подкожно (ПК).ПРИМЕЧАНИЕ: Животные с потерей веса более чем на 20% или испытывающие значительные дистрессы после процедуры, такие как вялость, неспособность дотянуться до воды или пищи, затрудненное дыхание, нарушение реакции на внешние раздражители или снижение умственной активности, должны быть усыплены. 5. Бронхоальвеолярный лаваж и забор легких Усыпите мышь, поместив ее в закрытый контейнер, содержащий 5% изофлурана. Продолжайте воздействие изофлурана в течение 1 минуты после того, как мышь перестанет дышать. Провести торакотомию для подтверждения эвтаназии.ПРИМЕЧАНИЕ: Подтвердите эвтаназию с помощью визуального и физического осмотра. Должно быть, сердце перестало биться, а мыши не дышали. Слизистые оболочки должны быть белыми или бледными. Положите мышь в лежачем положении на чистую хирургическую доску и подвесьте ее за резцы. Сбрызните кожу мыши 70% этанолом. С помощью хирургических ножниц сделайте небольшой поверхностный разрез по средней линии шеи, чтобы визуализировать трахею мыши. Канюляция трахеи с помощью катетера 20 G. Осторожно добавьте 1 мл безкальциевого фосфатно-солевого буфера (PBS) внутритрахеально с помощью шприца объемом 1 мл. Дайте волю полному расширению легких, а затем аспирируйте жидкость с помощью того же шприца. Повторите этот шаг в общей сложности на 2 мл. Переложите BAL в аликвоту объемом 2 мл. Выполните этот шаг дважды, чтобы конечный объем составил 2 мл. Не промывайте легкие более чем 1 мл за один раз из-за высокого риска нарушения альвеолярного пространства. Откройте грудную полость и обнажите легкое, сердце и трахею с помощью ножниц и щипцов. Аккуратно рассеките диафрагму и удалите грудную клеть. Следите за тем, чтобы не защемить легочную ткань. Пересеките брюшную аорту, чтобы обеспечить обескровливание. Перфузируйте легочную ткань, сделав небольшой разрез примерно 2 мм в правом желудочке с помощью ножниц, и введите 5 мл холодного PBS с помощью катетера 20 G. PBS должен перфузировать легкое. Если будет проведена адекватная перфузия, легочная ткань станет белой, бледной, и PBS покинет внутрисосудистый компартмент через брюшную аорту. Осторожно извлеките легкие и рассеките их из трахеи для выполнения либо гистологии, либо дальнейшей обработки до суспензии одиночных клеток. При обработке на гистологию осторожно введите катетер 20 G, чтобы надуть легкие до 25 см H2O раствором формалина (нейтральный буферный 10%). После того, как легкие будут инсуффляированы, проденьте шовный нить длиной около 5 см под трахеей и дважды крепко завяжите его, чтобы формалин оставался в легочной ткани. Аккуратно отделите легкое от остальных тканей и поместите его в коническую пробирку объемом 15 мл, содержащую 10 мл раствора формалина. 6. Обработка бронхоальвеолярного лаважа Центрифугируйте BAL при 500 x g при 4 °C в течение 5 минут. Извлеките надосадочную жидкость без клеток в отдельную пробирку и храните при температуре -80 °C.ПРИМЕЧАНИЕ: Дальнейший анализ может быть выполнен в надосадочной жидкости BAL, включая количественное определение белка (например, анализ BCA13) или измерение специфических биомаркеров или цитокинов (анализы ELISA и множественные анализы с использованием таких платформ, как MSD и Luminex). Лизируйте эритроциты, добавив 100 мкл лизирующего буфера на 1 мин. Нейтрализуйте реакцию лизинга, добавив 1 мл PBS. Центрифугируйте BAL при давлении 500 x g при 4 °C в течение 5 минут и удалите надосадочную жидкость. Ресуспендируйте клетки в PBS (100-300 μл; в зависимости от размера гранул клетки). Выполните подсчет клеток с помощью 0,4% трипанового синего цвета с помощью ручного или автоматического подсчета клеток. Оставшуюся гранулу используют для окрашивания проточной цитометрией и/или криоконсервации (путем суспендирования в криоконсервирующем растворе) в жидкий азот для дальнейшего тестирования. 7. Обработка легких на суспензию одиночных клеток Аккуратно отделите легкое от остальных тканей и поместите его в коническую пробирку объемом 15 мл, содержащую 5 мл холодного PBS. Извлеките легкое из PBS и высушите его бумажным полотенцем. Приготовьте коктейль для пищеварения, добавив 1 мг ДНКазы и 5 мг коллагеназы в 1 мл модифицированной среды Дульбекко (DMEM) с низким содержанием глюкозы. Перенесите легкое в С-образную трубку, содержащую 1 мл коктейля для пищеварения. Перенесите С-образную трубку в тканевый диссоциатор и следуйте стандартизированному протоколу обработки легочной ткани14. Добавьте 10 мл холодного PBS в С-образную трубку и тщательно перемешайте. Отфильтруйте одноклеточную суспензию с помощью клеточного фильтра 70 мкм на конической пробирке объемом 50 мл. Выполните фильтрацию дважды. Центрифугируйте суспензию при 500 x g при 4 °C в течение 5 мин. Осторожно сцедите надосадочную жидкость и добавьте 1 мл лизирующего буфера на 1 мин при комнатной температуре. Добавьте 10 мл холодного PBS, чтобы остановить реакцию лизирования и удалить надосадочную жидкость. Центрифугируйте суспензию при 500 x g при 4 °C в течение 5 мин. Осторожно сцедите надосадочную жидкость и добавьте 10 мл холодной PBS. Выполните подсчет клеток с помощью трипанового синего окрашивания вручную или автоматически. Используйте клеточную гранулу для окрашивания проточной цитометрией и/или криоконсервации в жидком азоте для дальнейшего тестирования.