Experimenteel model om de resolutie van longontsteking te evalueren

Alle dierprotocollen die in deze studie worden beschreven, zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (ACUC) van de Johns Hopkins University, School of Medicine voor het dierprotocol MO21M160. Bovendien werden de experimenten uitgevoerd volgens de institutionele, staats- en federale regelgeving voor dieronderzoek. LET OP: De replicatie van alle hieronder beschreven protocollen moet worden uitgevoerd in een kast van bioveiligheidsniveau 2 (BSL-2), volgens alle institutionele BSL-2-richtlijnen onder de bioveiligheidskast. 1. Plateren van bacterievoorraden uit commerciële lussen OPMERKING: Dit protocol kan worden gebruikt voor het kweken van bacterievoorraden voor Spn (ATCC 49619) en Kpn (ATCC 43816), te beginnen met de culti-loops die zijn verkregen van de leverancier (zie Materiaaltabel voor details). Verwarm een agarplaat van 5% schapenbloed gedurende 15 minuten op 37 °C in een couveuse. Hiervoor kan een celincubator worden gebruikt. Verwijder onder de kap het omhulsel van de bacteriële inoculatielus en spreid het voorzichtig uit, strepen in de agarplaat, volgens een zigzagpatroon. Herhaal deze stap met een aparte plaat als duplicaat. Er kunnen maximaal vijf platen met dezelfde lus worden gestreept. Laat de platen een nacht incuberen bij 37 °C voor een optimale bacteriegroei. Passage van de bacteriën dagelijks gedurende 3 dagen. Verwarm de bloedagarplaten gedurende 15 minuten op 37 °C, neem tussen de 15 en 20 kolonies van de eerste agarplaat met behulp van een wegwerpinoculatielus en verdeel ze over een nieuwe, voorverwarmde agarplaat. Label de plaat op de juiste manier. 2. Bacteriegroei en opslag voor toekomstig gebruik Pak na 3 dagen maximaal 30 kolonies van de bloedagarplaat met een streeplus en plaats deze rechtstreeks in een kolf van 250 ml met Todd Hewitt-bouillon (TH-bouillon). Incubeer bij 37 °C, schudden bij 250 tpm, met 5% CO2 gedurende ongeveer 4 uur. Neem elke 15 minuten aliquots om de OD620nm te meten totdat deze 0,3 bereikt, wat overeenkomt met ongeveer 3 x 108 kolonievormende eenheden (CFU) per ml. Doe 1 ml van de nieuwe bacteriebouillon onmiddellijk in cryogene injectieflacons van 2 ml. Vries de vers gealiquoteerde flacons snel in vloeibare stikstof gedurende 5 minuten in. Bewaar aliquots bacteriën in een vriezer van -80 °C (injectieflacons kunnen tot 6-8 maanden worden gebruikt voordat ze hun kracht verliezen). Na 7 dagen invriezen kunnen de aliquots worden gebruikt voor dierstudies. Bepaal daarom de nieuwe concentratie van de bacteriën. 3. Bacteriën ontdooien voor intratracheale instillatie Verwarm een bloedagarplaat gedurende 10 minuten op 37 °C in een shaker. Neem een van de nieuwe voorraadflesjes uit de vriezer en ontdooi deze door deze zachtjes te schudden in een waterbad van 37 °C gedurende ongeveer 2 min. Raak de O-ring of dop niet aan met het warme water. Plaat op een bloedagarplaat om de bacteriekolonies handmatig te tellen. Voer een verdunning van 1 x 10-6 uit en plaats 200 μL van de laatste verdunning in een voorverwarmde bloedagarplaat. Doe dit in tweevouden. Incubeer de platen een nacht bij 37 °C voor een optimale groei van de bacteriën. Pas de volgende dag de volgende formule toe om de nieuwe bacterieconcentratie te bepalen: CFU/ml = (aantal kolonies x verdunningsfactor) / volume van de geplateerde bouillon 4. Intratracheale instillatie van levende bacteriën OPMERKING: Dit protocol is geoptimaliseerd om intratracheaal een volume van 50 μl in te druppelen. Bacterievoorraden kunnen tot 6-9 maanden worden bewaard. Om ervoor te zorgen dat de bacteriële CFU in elke injectieflacon aanwezig is, moet u ervoor zorgen dat deze voor elk experiment wordt geplateerd, de CFU van de bacteriële voorraad berekent zoals hierboven beschreven en TH-bouillon gebruikt voor latere verdunningen. LET OP: Voer onder de bioveiligheidskast een overlevingsprocedure voor knaagdieren uit met behulp van steriele chirurgische instrumenten. Verdoof de muis door intraperitoneaal 100 mg/kg ketamine en 2,5 mg/kg acetylpromazine te injecteren. Herhaal dit voor het aantal muizen dat per keer wordt geïnjecteerd.OPMERKING: Muizen kunnen worden blootgesteld aan isofluraan om het hanteren van dieren te vergemakkelijken. Een ervaren verzorger die in staat is om intraperitoneale anesthetica te injecteren zonder noemenswaardig dierenleed te veroorzaken, kan blootstelling aan isofluraan echter vermijden. Het aantal muizen dat moet worden geïnjecteerd, is afhankelijk van de expertise van de chirurg. Nadat alle muizen onder de juiste narcose zijn, bevestigt u de anesthesie door in de staart te knijpen. Plaats de verdoofde muis op een schoon en gesteriliseerd oppervlak, hang het dier aan de snijtanden en plak de voorpoten voorzichtig vast (Figuur 1A).OPMERKING: Om het welzijn van het dier te garanderen, moet u het hoornvlies smeren bij alle verdoofde dieren. Carboxymethylcellulose oogdruppels kunnen worden gebruikt, waarbij één druppel per oog wordt aangebracht. Scheer de nek en desinfecteer het gebied met chloorhexidine en 70% alcohol. Maak met een chirurgische schaar een oppervlakkige incisie van 1 cm in de middellijn van de nek om de luchtpijp te visualiseren (Figuur 1B). Een kleine incisie zou voldoende moeten zijn, maar als er een overvloed aan vetweefsel wordt gezien, ontleed het vetweefsel dan voorzichtig verticaal om de luchtpijp te visualiseren.OPMERKING: Gebruik steriele handschoenen en steriele instrumenten via de techniek met alleen tips. Het risico op infectie is minimaal als de procedure onder steriele omstandigheden wordt uitgevoerd. Gebruik een pincet om elke muis te intuberen. Trek de tong voorzichtig naar buiten en breng een angiokatheter van 20 G door de mond, waarbij de katheter in de luchtpijp wordt gebracht. Oefen lichte druk uit op de luchtpijp om de intubatie te vergemakkelijken.OPMERKING: Omdat de luchtpijp zich aan de voorkant van het muislichaam bevindt, moet u de punt van de katheter lichtjes buigen, omdat dit zal helpen om de hoek te krijgen om de muis met succes te intuberen. De incisie in de nek wordt voornamelijk uitgevoerd voor visualisatiedoeleinden; Als alternatief kan de operator de luchtpijp blindelings intuberen. Sluit de muis na intubatie aan op een gasmasker om de intubatie te bevestigen. De reguliere ventilatorparameters die in deze procedure worden gebruikt, zijn 200 μL slagvolume en 200 slagen per minuut. Draai de ventilatorsnelheid kort omhoog en/of omlaag voor een snelle en eenvoudige bevestiging. Na bevestiging van de intubatie koppelt u de muis los van het gasmasker en druppelt u voorzichtig 50 μl van het bacteriële agens in via de angiokatheter met behulp van een 200 μl pipetgel-laadtip. Injecteer voor controlemuizen 50 μL steriele TH-bouillon. Nadat u het bacteriële agens hebt ingedruppeld, sluit u de muis opnieuw aan op het gasmasker om de ademhaling weer op gang te brengen. Laat de muis 30-60 s op het gasmasker zitten. Nadat je alle muizen hebt geïnjecteerd, houd je hun ademhaling in de gaten. Als er een langzaam ademhalingspatroon is, sluit u de muizen weer aan op het gasmasker. Sluit de incisie door een klein druppeltje lijm op de huid aan te brengen. Breng de huidplooien samen en oefen lichte druk uit totdat de lijm droogt. Leg de muizen op een verwarmingskussen voor herstel en houd ze nauwlettend in de gaten totdat ze weer voldoende bij bewustzijn zijn. Breng de muizen terug in de kooi zodra ze volledig hersteld zijn. Voor postoperatieve pijn-/angstbeheersing kunnen de muizen worden behandeld met buprenorfine, met een dosis van 0,05-0,1 mg/kg subcutaan (SC).OPMERKING: Dieren met een gewichtsverlies van meer dan 20% of die na de procedure aanzienlijk leed ervaren, zoals lethargie, een onvermogen om bij water of voedsel te komen, moeizame ademhaling, verminderde reactie op externe stimuli of verminderde mentale alertheid, moeten worden geëuthanaseerd. 5. Bronchoalveolaire lavage en longoogst Euthanaseer de muis door hem in een gesloten container te plaatsen die 5% isofluraan bevat. Ga door met blootstelling aan isofluraan gedurende 1 minuut nadat de muis is gestopt met ademen. Voer thoracotomie uit om euthanasie te bevestigen.OPMERKING: Bevestig euthanasie door visueel en lichamelijk onderzoek. Het hart moet gestopt zijn met kloppen en de muizen ademden niet. Slijmvliezen moeten wit of bleek zijn. Leg de muis in rugligging op een schone operatieplank en hang hem aan de snijtanden. Spuit de muizenhuid in met 70% ethanol. Maak met een chirurgische schaar een kleine oppervlakkige incisie in de nek van de middellijn om de luchtpijp van de muis te visualiseren. Draai de luchtpijp af met een katheter van 20 G. Voeg voorzichtig 1 ml calciumvrije fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) intratracheaal toe met behulp van een spuit van 1 ml. Laat volledige longexpansie toe en zuig de vloeistof vervolgens op met dezelfde spuit. Herhaal deze stap voor een totaal van 2 ml. Breng de BAL over in een aliquot van 2 ml. Voer deze stap twee keer uit voor een eindvolume van 2 ml. Spoel de longen niet met meer dan 1 ml per keer, vanwege het hoge risico op alveolaire ruimteverstoring. Open de borstholte en leg de long, het hart en de luchtpijp bloot met een schaar en een tang. Ontleed het middenrif voorzichtig en verwijder de ribbenkast. Zorg ervoor dat het longweefsel niet bekneld raakt. Doorsnijd de abdominale aorta om bloedverbloeding mogelijk te maken. Doordrenk het longweefsel door met een schaar een kleine incisie van ongeveer 2 mm in de rechterventrikel te maken en injecteer 5 ml koude PBS met behulp van een katheter van 20 G. De PBS moet de long doordringen. Als een adequate perfusie wordt uitgevoerd, wordt het longweefsel witbleek en verlaat de PBS het intravasculaire compartiment via de abdominale aorta. Haal voorzichtig de longen eruit en ontleed ze uit de luchtpijp om histologie of verdere verwerking tot eencellige suspensie uit te voeren. Als u voor histologie wordt verwerkt, breng dan voorzichtig een katheter van 20 G in om de longen op te blazen tot 25 cm H2O met formaline-oplossing (neutraal gebufferd 10%). Zodra de longen zijn geïnstiketteerd, passeert u een 3.0 hechtdraad van ongeveer 5 cm lang onder de luchtpijp en bindt u deze twee keer stevig vast om ervoor te zorgen dat de formaline in het longweefsel blijft. Ontleed voorzichtig de long van de rest van de weefsels en plaats deze in een kegelvormige buis van 15 ml met 10 ml formaline-oplossing. 6. Bronchoalveolaire lavage verwerking Centrifugeer de BAL bij 500 x g bij 4 °C gedurende 5 min. Verwijder het celvrije supernatans in een aparte tube en bewaar bij -80 °C.OPMERKING: Verdere analyse kan worden uitgevoerd in de BAL-supernatant, inclusief eiwitkwantificering (bijv. BCA-test13) of meting van specifieke biomarkers of cytokines (ELISA-assays en meervoudige assays met platforms zoals MSD en Luminex). Lyseer de rode bloedcellen door 100 μL lyseerbuffer toe te voegen gedurende 1 minuut. Neutraliseer de lyseerreactie door 1 ml PBS toe te voegen. Centrifugeer de BAL bij 500 x g bij 4 °C gedurende 5 minuten en verwijder het supernatant. Resuspendeer de cellen in PBS (100-300 μL; op basis van de grootte van de celkorrel). Voer een celtelling uit met 0,4% trypan blauwe vlek door handmatige of geautomatiseerde celtelling. Gebruik de resterende pellet voor flowcytometriekleuring en/of cryopreservatie (door resuspendatie in cryoconserveringsoplossing) in vloeibare stikstof voor verder onderzoek. 7. Longverwerking voor eencellige suspensie Ontleed de long voorzichtig van de rest van de weefsels en plaats deze in een conische buis van 15 ml met 5 ml koude PBS. Haal de long uit PBS en droog deze af met keukenpapier. Bereid een spijsverteringscocktail door 1 mg DNase en 5 mg collagenase toe te voegen aan 1 ml Dulbecco’s gemodificeerde Eagle’s medium (DMEM) met een laag glucosegehalte. Breng de long over naar een C-tube met 1 ml spijsverteringscocktail. Breng de C-buis over naar de weefseldissociator en volg het gestandaardiseerde protocol voor het verwerken van longweefsel14. Voeg 10 ml koude PBS toe aan de C-tube en meng goed. Filtreer de eencellige suspensie met behulp van een celzeef van 70 μm bovenop een conische buis van 50 ml. Voer de filtratie twee keer uit. Centrifugeer de suspensie bij 500 x g bij 4 °C gedurende 5 min. Decanteer het supernatans voorzichtig en voeg 1 ml lysingbuffer toe gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur. Voeg 10 ml koude PBS toe om de lyseringsreactie te stoppen en het overtollige te verwijderen. Centrifugeer de suspensie bij 500 x g bij 4 °C gedurende 5 min. Decanteer het supernatans voorzichtig en voeg 10 ml koude PBS toe. Voer een celtelling uit met trypan blauwe vlek door handmatige of geautomatiseerde celtelling. Gebruik een celpellet voor flowcytometriekleuring en/of cryopreserve in vloeibare stikstof voor verder onderzoek.