Использование микрофлюидики и флуоресцентной микроскопии для изучения динамики сборки одноактиновых нитей и пучков
Summary
Мы представляем протоколы для простых микрофлюидных анализов актиновой нити в сочетании с флуоресцентной микроскопией, которые позволяют точно контролировать отдельные актиновые нити в режиме реального времени, последовательно подвергая их воздействию различных белковых растворов.
Abstract
Чтобы расшифровать сложные молекулярные механизмы, которые регулируют сборку и разборку актиновых нитей, является большим преимуществом для мониторинга отдельных реакций, живущих в хорошо контролируемых условиях. Для этого за последние 20 лет появились живые эксперименты с одной нитью, в основном с использованием микроскопии полной флуоресценции внутреннего отражения (TIRF), и дали множество ключевых результатов. В 2011 году, чтобы еще больше расширить возможности этих экспериментов и избежать повторяющихся проблемных артефактов, мы ввели в эти анализы простую микрофлюидику. В этом исследовании подробно описывается наш основной протокол, где отдельные актиновые нити закреплены одним концом на пассивированной поверхности покрова, выравниваются с потоком и могут последовательно подвергаться воздействию различных белковых растворов. Мы также представляем протоколы для конкретных применений и объясняем, как можно применять контролируемые механические силы благодаря вязкому сопротивлению текучего раствора. Мы выделяем технические предостережения этих экспериментов и кратко представляем возможные разработки, основанные на этой технике. Эти протоколы и объяснения, наряду с сегодняшним наличием простого в использовании оборудования для микрофлюидики, должны позволить неспециалистам реализовать этот анализ в своих лабораториях.
Introduction
Сборка и разборка актиновых нитей и сетей актиновых нитей контролируется несколькими биохимическими реакциями и зависит от механического контекста. Чтобы получить представление об этих сложных механизмах, бесценно иметь возможность наблюдать индивидуальные реакции на отдельных нитях (в достаточно большом количестве). За последние десятилетия наблюдение динамических актиновых нитей в режиме реального времени, главным образом с использованием флуоресцентной микроскопии полного внутреннего отражения (TIRF), стало ключевым методом и обеспечило впечатляющий список результатов, которые не могли быть получены с помощью биохимических анализов объемного раствора1.
Для достижения этого необходимо поддерживать флуоресцентно меченые актиновые нити близко к поверхности крышки микроскопа, подвергая их воздействию растворов актин-связывающих белков (ABP), которые также могут быть флуоресцентно помечены. Это обеспечивает средства для мониторинга событий, происходящих на отдельных нитях в хорошо контролируемых биохимических условиях, и, таким образом, для количественной оценки скорости реакции. Однако следует рассмотреть ряд конкретных ограничений. Искусственное поддержание нитей близко к поверхности, часто благодаря множественным точкам крепления или с помощью скученного агента, такого как метилцеллюлоза, может изменить их поведение (например, вызывая паузы в их полимеризации и деполимеризации2). Отслеживание контура каждой нити накала может быть сложной задачей, особенно если новые нити или фрагменты нити накапливаются в поле зрения с течением времени. Реакции происходят в конечном объеме, где концентрация мономеров актина и ABP может изменяться с течением времени, что потенциально затрудняет получение точных констант скорости. Наконец, возобновление или изменение раствора ABP трудно достичь менее чем за 30 с и часто приводит к неоднородному содержанию белка в образце.
Чуть более 10 лет назад, вдохновленные тем, что уже было сделано для изучения отдельных нитей дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК)3, мы представили новую технику, основанную на микрофлюидике, для наблюдения и манипулирования отдельными актиновыми нитями4. Это позволяет обойти вышеупомянутые ограничения классических однонитевых техник. В этих анализах микрофлюидики актиновые нити выращиваются из спектрин-актиновых семян, адсорбированных на покровном листе. Таким образом, нити закреплены одним концом только на дне микрофлюидной камеры и колеблются над поверхностью, не прилипая. Нити накаливания выравниваются с потоком поступающих растворов, тем самым облегчая контроль длины их контура и поддерживая их в неглубокой области над крышкой, где можно использовать TIRF. Различные растворы одновременно поступают в камеру без перемешивания, и нити могут подвергаться их последовательному и быстрому воздействию.
Здесь мы предлагаем ряд основных протоколов для создания одноактиновых микрофлюидных анализов в лаборатории. Чехлы и микрофлюидные камеры могут быть подготовлены заранее (за полдня), а сам эксперимент, где можно проверить несколько биохимических состояний, проводится менее чем за сутки.
Protocol
Representative Results
Discussion
По сравнению со стандартными методами с одной нитью, где актиновые нити закреплены на поверхности несколькими точками по их длине или поддерживаются близко к ней с помощью агента скученности, такого как метилцеллюлоза, микрофлюидика предлагает ряд преимуществ. Поскольку взаимодейств…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарны Б. Ладу и Р.-М. Лаборатория Mège для использования своего УФ-очистительного оборудования, а также J. Heuvingh и 0. du Roure за первоначальное обучение, которое мы получили по подготовке пресс-форм на кремниевых пластинах и предоставлению советов по микрофлюидике. Мы признаем финансирование из гранта Европейского исследовательского совета StG-679116 (для A.J.) и Agence Nationale de la Recherche Grants Muscactin and Conformin (для G.R.-L.).
Materials
| β-Casein | Merck | C6905 | Used at 8 mg/mL |
| Biopsy punch (with plunger) | Ted Pella | 15115-2 | ID 0.75 mm, OD 1.07 mm |
| Biotin-BSA | Merck | A8549 | Used at 1 mg/mL |
| BSA | Merck | A8022 | Used at 50 mg/mL |
| Coverslip Mini-Rack Teflon holder |
Invitrogen | C14784 | for 8 coverslips |
| Coverslips 22x40mm Thickness #1.5 |
Menzel Gläser | 631-1370 | |
| DABCO | Merck | D27802 | component in f-buffer |
| DTT | Euromedex | EU0006-D | component in f-buffer |
| Ester NHS Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A20000 | Fluorophore for actin labeling on Lys328. |
| EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin | Thermo Scientific | 21338 | To biotinylate actin on Lys328 |
| Hellmanex III | Hellma | 9-307-011-4-507 | Glass cleaning detergent |
| ImageJ | NIH | N/A | open source software |
| Laboport | KNF | 811kn.18 | vacuum pump (ultimate vacuum: 240 mbar) |
| Magic invisible tape | Scotch | 7100024666 | standard transparent office tape |
| Micrewtube | Simport | T341-6T | 2 mL microfluidic reservoir tubes |
| Microfluidic device Part 1: Flow Unit S | Fluigent | FLU-S-D-PCKB | Flowmeter |
| Microfluidic device Part 2: Fluiwell-4C-2 mL | Fluigent | 14002001PCK | Reservoir holder |
| Microfluidic device Part 3: MFCS-EZ | Fluigent | EZ-11000001 EZ-00345001 |
Pressure controller |
| Model 42 – UVO-Cleaner | Jelight Inc. | 42-220 | Ultraviolet cleaner |
| N6-(6-Aminohexyl)-ATP-ATTO-488 | Jena Bioscience | NU-805-488 | ATP-ATTO used to label actin |
| neutravidin | Thermo Scientific | 31000 | |
| PLL-PEG | SuSoS | PLL(20)-g[3.5]- PEG(2) | Use at 1 mg/mL in PBS. |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) Sylgard 184 Silicon Elastomer | Dow Corning | 1673921 | Contains PDMS base and curing agent |
| Polyetheretherketone (PEEK) tubing | Merck | Z226661 | “Blue” : I.D. = 0.25 mm |
| Safety blow gun | Coilhose Pneumatics | 700-S | filtered air |
| Silicon tubing | VWR | 228-0701P | connect PEEK to coupler |
| Stainless steel catheter coupler | Prime Bioscience | SC22/15 | Inserted into PDMS inlets and outlet to connect to PEEK tubing |
| Thermoplastic film | Sigma Aldrich | PM996 | Standard "parafilm" |
| Ultrapure ethanol | VWR | 64-17-5 | |
| Ultrasonic cleaning bath | VWR | USC200TH | To accomodate 1 L beakers |
| Vacuum dessicator | SP Bel-Art | F42022-0000 | to degas the PDMS or solutions |
References
- Wioland, H., Jégou, A., Romet-Lemonne, G. Celebrating 20 years of live single-actin-filament studies with five golden rules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (3), 2109506119 (2022).
- Kuhn, J. R., Pollard, T. D. Real-time measurements of actin filament polymerization by total internal reflection fluorescence microscopy. Biophysical Journal. 88 (2), 1387-1402 (2005).
- Brewer, L. R., Bianco, P. R. Laminar flow cells for single-molecule studies of DNA-protein interactions. Nature Methods. 5 (6), 517-525 (2008).
- Jégou, A., et al. Individual actin filaments in a microfluidic flow reveal the mechanism of ATP hydrolysis and give insight into the properties of profilin. PLoS Biology. 9 (9), 1001161 (2011).
- Gicquel, Y., et al. Microfluidic chips for in situ crystal x-ray diffraction and in situ dynamic light scattering for serial crystallography. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57133 (2018).
- Chandradoss, S. D., et al. Surface passivation for single-molecule protein studies. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (86), e50549 (2014).
- Schaedel, L., et al. Microtubules self-repair in response to mechanical stress. Nature Materials. 14 (11), 1156-1163 (2015).
- Zimmermann, D., Morganthaler, A. N., Kovar, D. R., Suarez, C. In vitro biochemical characterization of cytokinesis actin-binding proteins. Methods in Molecular Biology. 1369, 151-179 (2016).
- Funk, J., et al. Profilin and formin constitute a pacemaker system for robust actin filament growth. eLife. 8, 50963 (2019).
- Pandit, N. G., et al. Force and phosphate release from Arp2/3 complex promote dissociation of actin filament branches. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (24), 13519-13528 (2020).
- Wioland, H., et al. ADF/Cofilin accelerates actin dynamics by severing filaments and promoting their depolymerization at both ends. Current Biology: CB. 27 (13), 1956-1967 (2017).
- Pollard, T. D., Mooseker, M. S. Direct measurement of actin polymerization rate constants by electron microscopy of actin filaments nucleated by isolated microvillus cores. The Journal of Cell Biology. 88 (3), 654-659 (1981).
- Kovar, D. R., Harris, E. S., Mahaffy, R., Higgs, H. N., Pollard, T. D. Control of the assembly of ATP- and ADP-actin by formins and profilin. Cell. 124 (2), 423-435 (2006).
- Jégou, A., Carlier, M. -. F., Romet-Lemonne, G. Formin mDia1 senses and generates mechanical forces on actin filaments. Nature Communications. 4, 1883 (2013).
- Breitsprecher, D., et al. Rocket launcher mechanism of collaborative actin assembly defined by single-molecule imaging. Science. 336 (6085), 1164-1168 (2012).
- Courtemanche, N., Lee, J. Y., Pollard, T. D., Greene, E. C. Tension modulates actin filament polymerization mediated by formin and profilin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (24), 9752-9757 (2013).
- Niedermayer, T., et al. Intermittent depolymerization of actin filaments is caused by photo-induced dimerization of actin protomers. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (27), 10769-10774 (2012).
- Gateva, G., et al. Tropomyosin isoforms specify functionally distinct actin filament populations in vitro. Current Biology: CB. 27 (5), 705-713 (2017).
- Aratyn, Y. S., Schaus, T. E., Taylor, E. W., Borisy, G. G. Intrinsic dynamic behavior of fascin in filopodia. Molecular Biology of the Cell. 18 (10), 3928-3940 (2007).
- Pollard, T. D. Rate constants for the reactions of ATP- and ADP-actin with the ends of actin filaments. The Journal of Cell Biology. 103, 2747-2754 (1986).
- Wioland, H., Jegou, A., Romet-Lemonne, G. Torsional stress generated by ADF/cofilin on cross-linked actin filaments boosts their severing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (7), 2595-2602 (2019).
- Colombo, J., et al. A functional family of fluorescent nucleotide analogues to investigate actin dynamics and energetics. Nature Communications. 12 (1), 548 (2021).
- Spudich, J. A., Watt, S. The regulation of rabbit skeletal muscle contraction. I. Biochemical studies of the interaction of the tropomyosin-troponin complex with actin and the proteolytic fragments of myosin. The Journal of Biological Chemistry. 246 (15), 4866-4871 (1971).
- Romet-Lemonne, G., Guichard, B., Jégou, A. Using microfluidics single filament assay to study formin control of actin assembly. Methods in Molecular Biology. 1805, 75-92 (2018).
- Gieselmann, R., Kwiatkowski, D. J., Janmey, P. A., Witke, W. Distinct biochemical characteristics of the two human profilin isoforms. European Journal of Biochemistry. 229 (3), 621-628 (1995).
- Lin, D. C., Lin, S. Actin polymerization induced by a motility-related high-affinity cytochalasin binding complex from human erythrocyte membrane. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (5), 2345-2349 (1979).
- Casella, J. F., Maack, D. J., Lin, S. Purification and initial characterization of a protein from skeletal muscle that caps the barbed ends of actin filaments. The Journal of Biological Chemistry. 261 (23), 10915-10921 (1986).
- Kremneva, E., et al. Cofilin-2 controls actin filament length in muscle sarcomeres. Developmental Cell. 31 (2), 215-226 (2014).
- Le Clainche, C., Carlier, M. -. F. Actin-based motility assay. Current Protocols in Cell Biology. , 1-20 (2004).
- Vignjevic, D., et al. Formation of filopodia-like bundles in vitro from a dendritic network. The Journal of Cell Biology. 160 (6), 951-962 (2003).
- Duellberg, C., Cade, N. I., Holmes, D., Surrey, T. The size of the EB cap determines instantaneous microtubule stability. eLife. 5, 13470 (2016).
- Duellberg, C., Cade, N. I., Surrey, T. Microtubule aging probed by microfluidics-assisted tubulin washout. Molecular Biology of the Cell. 27 (22), 3563-3573 (2016).
- Suzuki, E. L., et al. Geometrical constraints greatly hinder formin mDia1 activity. Nano Letters. 20 (1), 22-32 (2020).
- Wioland, H., Suzuki, E., Cao, L., Romet-Lemonne, G., Jegou, A. The advantages of microfluidics to study actin biochemistry and biomechanics. Journal of Muscle Research and Cell Motility. 41 (1), 175-188 (2020).
