نحن نقدم بروتوكولات لفحوصات الموائع الدقيقة البسيطة لخيوط الأكتين ، بالاشتراك مع الفحص المجهري الفلوري ، والتي تسمح للمرء بمراقبة خيوط الأكتين الفردية بدقة في الوقت الفعلي مع تعريضها بالتتابع لحلول البروتين المختلفة.
من أجل فك رموز الآليات الجزيئية المعقدة التي تنظم تجميع وتفكيك خيوط الأكتين ، يعد من الأصول العظيمة مراقبة التفاعلات الفردية التي تعيش في ظروف يتم التحكم فيها بشكل جيد. للقيام بذلك ، ظهرت تجارب حية أحادية الخيط على مدى السنوات ال 20 الماضية ، معظمها باستخدام المجهر الفلوري الداخلي الكلي للانعكاس (TIRF) ، وقدمت مجموعة من النتائج الرئيسية. في عام 2011 ، من أجل توسيع إمكانيات هذه التجارب وتجنب القطع الأثرية الإشكالية المتكررة ، أدخلنا الموائع الدقيقة البسيطة في هذه المقاييس. تفصل هذه الدراسة بروتوكولنا الأساسي ، حيث يتم تثبيت خيوط الأكتين الفردية بواسطة طرف واحد على سطح الغطاء المخمل ، وتتماشى مع التدفق ، ويمكن أن تتعرض على التوالي لمحاليل البروتين المختلفة. كما نقدم بروتوكولات لتطبيقات محددة ونشرح كيف يمكن تطبيق القوى الميكانيكية التي يتم التحكم فيها ، وذلك بفضل السحب اللزج للمحلول المتدفق. نسلط الضوء على المحاذير التقنية لهذه التجارب ونقدم بإيجاز التطورات المحتملة بناء على هذه التقنية. هذه البروتوكولات والتفسيرات، جنبا إلى جنب مع توافر اليوم من معدات الموائع الدقيقة سهلة الاستخدام، ينبغي أن تسمح لغير المتخصصين بتنفيذ هذا الفحص في مختبراتهم.
يتم التحكم في تجميع وتفكيك خيوط الأكتين وشبكات خيوط الأكتين بواسطة العديد من التفاعلات الكيميائية الحيوية وتعتمد على السياق الميكانيكي. من أجل اكتساب نظرة ثاقبة على هذه الآليات المعقدة ، من غير القيم أن تكون قادرا على مراقبة ردود الفعل الفردية على الخيوط الفردية (بأعداد كبيرة بما فيه الكفاية). على مدى العقود الماضية ، ظهرت مراقبة خيوط الأكتين الديناميكية في الوقت الفعلي ، ومعظمها باستخدام الفحص المجهري الكلي للتألق الداخلي للانعكاس (TIRF) ، كتقنية رئيسية وقدمت قائمة رائعة من النتائج التي لم يكن من الممكن الحصول عليها باستخدام المقايسات الكيميائية الحيوية للمحلول السائب1.
لتحقيق ذلك ، يحتاج المرء إلى الحفاظ على خيوط الأكتين المصنفة بالفلورسنت بالقرب من سطح غطاء المجهر مع تعريضها لمحاليل البروتينات المرتبطة بالأكتين (ABPs) ، والتي يمكن أيضا تصنيفها بالفلورسنت. ويوفر القيام بذلك وسيلة لرصد الأحداث التي تحدث على خيوط فردية في ظروف كيميائية حيوية جيدة التحكم، وبالتالي تحديد معدلات التفاعل كميا. ومع ذلك، ينبغي النظر في عدد من القيود المحددة. يمكن أن يؤدي الحفاظ على خيوط قريبة من السطح بشكل مصطنع ، غالبا بفضل نقاط تثبيت متعددة أو باستخدام عامل ازدحام مثل ميثيل سليلوز ، إلى تغيير سلوكها (على سبيل المثال ، التسبب في توقف مؤقت في البلمرة وإزالة البلمرة2). يمكن أن يكون تتبع محيط كل خيط أمرا صعبا ، خاصة إذا تراكمت خيوط أو شظايا خيوط جديدة في مجال الرؤية بمرور الوقت. تحدث التفاعلات في حجم محدود حيث يمكن أن يختلف تركيز مونومرات الأكتين و ABPs بمرور الوقت ، مما قد يجعل من الصعب اشتقاق ثوابت معدل دقيقة. وأخيرا، من الصعب تجديد أو تغيير محلول ABPs في أقل من 30 ثانية وغالبا ما يؤدي إلى محتوى بروتين غير متجانس في العينة.
منذ ما يزيد قليلا عن 10 سنوات ، مستوحاة مما تم القيام به بالفعل لدراسة خيوط حمض ديوكسي ريبونوكلييك (DNA) الفردية3 ، قدمنا تقنية جديدة تعتمد على الموائع الدقيقة لمراقبة خيوط الأكتين الفردية ومعالجتها4. يسمح للمرء بالتحايل على القيود المذكورة أعلاه لتقنيات الخيوط المفردة الكلاسيكية. في مقايسات الموائع الدقيقة هذه ، تزرع خيوط الأكتين من بذور الطيف الأكتين الممتصة على الغطاء. وبالتالي يتم تثبيت الخيوط من طرف واحد فقط في الجزء السفلي من غرفة الموائع الدقيقة وتتقلب فوق السطح دون الالتصاق. تتماشى الخيوط مع تدفق المحاليل الواردة ، وبالتالي تسهيل مراقبة طول محيطها والحفاظ عليها في منطقة ضحلة فوق الغطاء حيث يمكن استخدام TIRF. يتم تدفق حلول مختلفة في وقت واحد إلى الغرفة دون خلط ، ويمكن أن تتعرض الخيوط لها بالتتابع والسرعة.
هنا ، نقترح سلسلة من البروتوكولات الأساسية لإعداد اختبارات الموائع الدقيقة أحادية الأكتين في المختبر. يمكن تحضير غرف الأغطية والموائع الدقيقة مقدما (في نصف يوم) ، ويتم إجراء التجربة نفسها ، حيث يمكن اختبار العديد من الظروف الكيميائية الحيوية ، في أقل من يوم.
بالمقارنة مع الطرق القياسية أحادية الخيط حيث يتم تثبيت خيوط الأكتين على السطح بواسطة نقاط متعددة على طولها أو الحفاظ عليها بالقرب منه بواسطة عامل ازدحام مثل ميثيل السليلوز ، توفر الموائع الدقيقة عددا من المزايا. نظرا لأن التفاعلات مع السطح ضئيلة ، فإن التوقفات الاصطناعية التي يمكن أن تحد…
The authors have nothing to disclose.
ونحن ممتنون ل B. Ladoux و R.-M. مختبر Mège لاستخدام معدات التنظيف بالأشعة فوق البنفسجية الخاصة بهم ، و J. Heuvingh و 0. دو روور للتدريب الأولي الذي تلقيناه على إعداد القوالب على رقائق السيليكون وتقديم نصائح حول الموائع الدقيقة. نحن نقر بالتمويل المقدم من منحة مجلس البحوث الأوروبي StG-679116 (إلى A.J.) والوكالة الوطنية للبحث العلمي Muscactin و Conformin (إلى G.R.-L).
β-Casein | Merck | C6905 | Used at 8 mg/mL |
Biopsy punch (with plunger) | Ted Pella | 15115-2 | ID 0.75 mm, OD 1.07 mm |
Biotin-BSA | Merck | A8549 | Used at 1 mg/mL |
BSA | Merck | A8022 | Used at 50 mg/mL |
Coverslip Mini-Rack Teflon holder |
Invitrogen | C14784 | for 8 coverslips |
Coverslips 22x40mm Thickness #1.5 |
Menzel Gläser | 631-1370 | |
DABCO | Merck | D27802 | component in f-buffer |
DTT | Euromedex | EU0006-D | component in f-buffer |
Ester NHS Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A20000 | Fluorophore for actin labeling on Lys328. |
EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin | Thermo Scientific | 21338 | To biotinylate actin on Lys328 |
Hellmanex III | Hellma | 9-307-011-4-507 | Glass cleaning detergent |
ImageJ | NIH | N/A | open source software |
Laboport | KNF | 811kn.18 | vacuum pump (ultimate vacuum: 240 mbar) |
Magic invisible tape | Scotch | 7100024666 | standard transparent office tape |
Micrewtube | Simport | T341-6T | 2 mL microfluidic reservoir tubes |
Microfluidic device Part 1: Flow Unit S | Fluigent | FLU-S-D-PCKB | Flowmeter |
Microfluidic device Part 2: Fluiwell-4C-2 mL | Fluigent | 14002001PCK | Reservoir holder |
Microfluidic device Part 3: MFCS-EZ | Fluigent | EZ-11000001 EZ-00345001 |
Pressure controller |
Model 42 – UVO-Cleaner | Jelight Inc. | 42-220 | Ultraviolet cleaner |
N6-(6-Aminohexyl)-ATP-ATTO-488 | Jena Bioscience | NU-805-488 | ATP-ATTO used to label actin |
neutravidin | Thermo Scientific | 31000 | |
PLL-PEG | SuSoS | PLL(20)-g[3.5]- PEG(2) | Use at 1 mg/mL in PBS. |
Polydimethylsiloxane (PDMS) Sylgard 184 Silicon Elastomer | Dow Corning | 1673921 | Contains PDMS base and curing agent |
Polyetheretherketone (PEEK) tubing | Merck | Z226661 | “Blue” : I.D. = 0.25 mm |
Safety blow gun | Coilhose Pneumatics | 700-S | filtered air |
Silicon tubing | VWR | 228-0701P | connect PEEK to coupler |
Stainless steel catheter coupler | Prime Bioscience | SC22/15 | Inserted into PDMS inlets and outlet to connect to PEEK tubing |
Thermoplastic film | Sigma Aldrich | PM996 | Standard "parafilm" |
Ultrapure ethanol | VWR | 64-17-5 | |
Ultrasonic cleaning bath | VWR | USC200TH | To accomodate 1 L beakers |
Vacuum dessicator | SP Bel-Art | F42022-0000 | to degas the PDMS or solutions |