Summary

استخدام الموائع الدقيقة والمجهر الفلوري لدراسة ديناميكيات تجميع خيوط وحزم الأكتين المفردة

Published: May 05, 2022
doi:

Summary

نحن نقدم بروتوكولات لفحوصات الموائع الدقيقة البسيطة لخيوط الأكتين ، بالاشتراك مع الفحص المجهري الفلوري ، والتي تسمح للمرء بمراقبة خيوط الأكتين الفردية بدقة في الوقت الفعلي مع تعريضها بالتتابع لحلول البروتين المختلفة.

Abstract

من أجل فك رموز الآليات الجزيئية المعقدة التي تنظم تجميع وتفكيك خيوط الأكتين ، يعد من الأصول العظيمة مراقبة التفاعلات الفردية التي تعيش في ظروف يتم التحكم فيها بشكل جيد. للقيام بذلك ، ظهرت تجارب حية أحادية الخيط على مدى السنوات ال 20 الماضية ، معظمها باستخدام المجهر الفلوري الداخلي الكلي للانعكاس (TIRF) ، وقدمت مجموعة من النتائج الرئيسية. في عام 2011 ، من أجل توسيع إمكانيات هذه التجارب وتجنب القطع الأثرية الإشكالية المتكررة ، أدخلنا الموائع الدقيقة البسيطة في هذه المقاييس. تفصل هذه الدراسة بروتوكولنا الأساسي ، حيث يتم تثبيت خيوط الأكتين الفردية بواسطة طرف واحد على سطح الغطاء المخمل ، وتتماشى مع التدفق ، ويمكن أن تتعرض على التوالي لمحاليل البروتين المختلفة. كما نقدم بروتوكولات لتطبيقات محددة ونشرح كيف يمكن تطبيق القوى الميكانيكية التي يتم التحكم فيها ، وذلك بفضل السحب اللزج للمحلول المتدفق. نسلط الضوء على المحاذير التقنية لهذه التجارب ونقدم بإيجاز التطورات المحتملة بناء على هذه التقنية. هذه البروتوكولات والتفسيرات، جنبا إلى جنب مع توافر اليوم من معدات الموائع الدقيقة سهلة الاستخدام، ينبغي أن تسمح لغير المتخصصين بتنفيذ هذا الفحص في مختبراتهم.

Introduction

يتم التحكم في تجميع وتفكيك خيوط الأكتين وشبكات خيوط الأكتين بواسطة العديد من التفاعلات الكيميائية الحيوية وتعتمد على السياق الميكانيكي. من أجل اكتساب نظرة ثاقبة على هذه الآليات المعقدة ، من غير القيم أن تكون قادرا على مراقبة ردود الفعل الفردية على الخيوط الفردية (بأعداد كبيرة بما فيه الكفاية). على مدى العقود الماضية ، ظهرت مراقبة خيوط الأكتين الديناميكية في الوقت الفعلي ، ومعظمها باستخدام الفحص المجهري الكلي للتألق الداخلي للانعكاس (TIRF) ، كتقنية رئيسية وقدمت قائمة رائعة من النتائج التي لم يكن من الممكن الحصول عليها باستخدام المقايسات الكيميائية الحيوية للمحلول السائب1.

لتحقيق ذلك ، يحتاج المرء إلى الحفاظ على خيوط الأكتين المصنفة بالفلورسنت بالقرب من سطح غطاء المجهر مع تعريضها لمحاليل البروتينات المرتبطة بالأكتين (ABPs) ، والتي يمكن أيضا تصنيفها بالفلورسنت. ويوفر القيام بذلك وسيلة لرصد الأحداث التي تحدث على خيوط فردية في ظروف كيميائية حيوية جيدة التحكم، وبالتالي تحديد معدلات التفاعل كميا. ومع ذلك، ينبغي النظر في عدد من القيود المحددة. يمكن أن يؤدي الحفاظ على خيوط قريبة من السطح بشكل مصطنع ، غالبا بفضل نقاط تثبيت متعددة أو باستخدام عامل ازدحام مثل ميثيل سليلوز ، إلى تغيير سلوكها (على سبيل المثال ، التسبب في توقف مؤقت في البلمرة وإزالة البلمرة2). يمكن أن يكون تتبع محيط كل خيط أمرا صعبا ، خاصة إذا تراكمت خيوط أو شظايا خيوط جديدة في مجال الرؤية بمرور الوقت. تحدث التفاعلات في حجم محدود حيث يمكن أن يختلف تركيز مونومرات الأكتين و ABPs بمرور الوقت ، مما قد يجعل من الصعب اشتقاق ثوابت معدل دقيقة. وأخيرا، من الصعب تجديد أو تغيير محلول ABPs في أقل من 30 ثانية وغالبا ما يؤدي إلى محتوى بروتين غير متجانس في العينة.

منذ ما يزيد قليلا عن 10 سنوات ، مستوحاة مما تم القيام به بالفعل لدراسة خيوط حمض ديوكسي ريبونوكلييك (DNA) الفردية3 ، قدمنا تقنية جديدة تعتمد على الموائع الدقيقة لمراقبة خيوط الأكتين الفردية ومعالجتها4. يسمح للمرء بالتحايل على القيود المذكورة أعلاه لتقنيات الخيوط المفردة الكلاسيكية. في مقايسات الموائع الدقيقة هذه ، تزرع خيوط الأكتين من بذور الطيف الأكتين الممتصة على الغطاء. وبالتالي يتم تثبيت الخيوط من طرف واحد فقط في الجزء السفلي من غرفة الموائع الدقيقة وتتقلب فوق السطح دون الالتصاق. تتماشى الخيوط مع تدفق المحاليل الواردة ، وبالتالي تسهيل مراقبة طول محيطها والحفاظ عليها في منطقة ضحلة فوق الغطاء حيث يمكن استخدام TIRF. يتم تدفق حلول مختلفة في وقت واحد إلى الغرفة دون خلط ، ويمكن أن تتعرض الخيوط لها بالتتابع والسرعة.

هنا ، نقترح سلسلة من البروتوكولات الأساسية لإعداد اختبارات الموائع الدقيقة أحادية الأكتين في المختبر. يمكن تحضير غرف الأغطية والموائع الدقيقة مقدما (في نصف يوم) ، ويتم إجراء التجربة نفسها ، حيث يمكن اختبار العديد من الظروف الكيميائية الحيوية ، في أقل من يوم.

Protocol

1. إعداد غرفة الموائع الدقيقة حدد قالب رئيسي SU-8 مع العديد من أنماط الغرفة. الغرف النموذجية متقاطعة الشكل مع ثلاثة مداخل ومنفذ واحد ، بارتفاع 20 ميكرومتر وعرض 800 ميكرومتر (الشكل 1). يمكن شراء هذه القوالب الرئيسية من شركات خارجية أو صنعها في مختبرات أكاديمية (على س…

Representative Results

بالنسبة لجميع التجارب الموصوفة أعلاه ، يجب أن تكون خيوط الأكتين المصنفة بالفلورسنت مرئية بوضوح ، مع تباين جيد ، مما يدل على التألق المنخفض للخلفية من السطح (الشكل 4 ، انظر الملف التكميلي 1 لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها للمشكلات الشائعة). يجب ألا تلتصق خيوط الأكتين أيض?…

Discussion

بالمقارنة مع الطرق القياسية أحادية الخيط حيث يتم تثبيت خيوط الأكتين على السطح بواسطة نقاط متعددة على طولها أو الحفاظ عليها بالقرب منه بواسطة عامل ازدحام مثل ميثيل السليلوز ، توفر الموائع الدقيقة عددا من المزايا. نظرا لأن التفاعلات مع السطح ضئيلة ، فإن التوقفات الاصطناعية التي يمكن أن تحد…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ونحن ممتنون ل B. Ladoux و R.-M. مختبر Mège لاستخدام معدات التنظيف بالأشعة فوق البنفسجية الخاصة بهم ، و J. Heuvingh و 0. دو روور للتدريب الأولي الذي تلقيناه على إعداد القوالب على رقائق السيليكون وتقديم نصائح حول الموائع الدقيقة. نحن نقر بالتمويل المقدم من منحة مجلس البحوث الأوروبي StG-679116 (إلى A.J.) والوكالة الوطنية للبحث العلمي Muscactin و Conformin (إلى G.R.-L).

Materials

β-Casein Merck C6905 Used at 8 mg/mL
Biopsy punch (with plunger) Ted Pella 15115-2 ID 0.75 mm, OD 1.07 mm
Biotin-BSA Merck A8549 Used at 1 mg/mL
BSA Merck A8022 Used at 50 mg/mL
Coverslip Mini-Rack
Teflon holder
Invitrogen C14784 for 8 coverslips
Coverslips 22x40mm
Thickness #1.5
Menzel Gläser 631-1370
DABCO Merck D27802 component in f-buffer
DTT Euromedex EU0006-D component in f-buffer
Ester NHS Alexa Fluor 488 Invitrogen A20000 Fluorophore for actin labeling on Lys328.
EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin Thermo Scientific 21338 To biotinylate actin on Lys328
Hellmanex III Hellma 9-307-011-4-507 Glass cleaning detergent
ImageJ NIH N/A open source software
Laboport KNF 811kn.18 vacuum pump (ultimate vacuum: 240 mbar)
Magic invisible tape Scotch 7100024666 standard transparent office tape
Micrewtube Simport T341-6T 2 mL microfluidic reservoir tubes
Microfluidic device Part 1: Flow Unit S Fluigent FLU-S-D-PCKB Flowmeter
Microfluidic device Part 2: Fluiwell-4C-2 mL Fluigent 14002001PCK Reservoir holder
Microfluidic device Part 3: MFCS-EZ Fluigent EZ-11000001
EZ-00345001
Pressure controller
Model 42 – UVO-Cleaner Jelight Inc. 42-220 Ultraviolet cleaner
N6-(6-Aminohexyl)-ATP-ATTO-488 Jena Bioscience NU-805-488 ATP-ATTO used to label actin
neutravidin Thermo Scientific 31000
PLL-PEG SuSoS PLL(20)-g[3.5]- PEG(2) Use at 1 mg/mL in PBS.
Polydimethylsiloxane (PDMS) Sylgard 184 Silicon Elastomer Dow Corning 1673921 Contains PDMS base and curing agent
Polyetheretherketone (PEEK) tubing Merck Z226661 “Blue” : I.D. = 0.25 mm
Safety blow gun Coilhose Pneumatics 700-S filtered air
Silicon tubing VWR 228-0701P connect PEEK to coupler
Stainless steel catheter coupler Prime Bioscience SC22/15 Inserted into PDMS inlets and outlet to connect to PEEK tubing
Thermoplastic film Sigma Aldrich PM996 Standard "parafilm"
Ultrapure ethanol VWR 64-17-5
Ultrasonic cleaning bath VWR USC200TH To accomodate 1 L beakers
Vacuum dessicator SP Bel-Art F42022-0000 to degas the PDMS or solutions

References

  1. Wioland, H., Jégou, A., Romet-Lemonne, G. Celebrating 20 years of live single-actin-filament studies with five golden rules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (3), 2109506119 (2022).
  2. Kuhn, J. R., Pollard, T. D. Real-time measurements of actin filament polymerization by total internal reflection fluorescence microscopy. Biophysical Journal. 88 (2), 1387-1402 (2005).
  3. Brewer, L. R., Bianco, P. R. Laminar flow cells for single-molecule studies of DNA-protein interactions. Nature Methods. 5 (6), 517-525 (2008).
  4. Jégou, A., et al. Individual actin filaments in a microfluidic flow reveal the mechanism of ATP hydrolysis and give insight into the properties of profilin. PLoS Biology. 9 (9), 1001161 (2011).
  5. Gicquel, Y., et al. Microfluidic chips for in situ crystal x-ray diffraction and in situ dynamic light scattering for serial crystallography. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57133 (2018).
  6. Chandradoss, S. D., et al. Surface passivation for single-molecule protein studies. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (86), e50549 (2014).
  7. Schaedel, L., et al. Microtubules self-repair in response to mechanical stress. Nature Materials. 14 (11), 1156-1163 (2015).
  8. Zimmermann, D., Morganthaler, A. N., Kovar, D. R., Suarez, C. In vitro biochemical characterization of cytokinesis actin-binding proteins. Methods in Molecular Biology. 1369, 151-179 (2016).
  9. Funk, J., et al. Profilin and formin constitute a pacemaker system for robust actin filament growth. eLife. 8, 50963 (2019).
  10. Pandit, N. G., et al. Force and phosphate release from Arp2/3 complex promote dissociation of actin filament branches. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (24), 13519-13528 (2020).
  11. Wioland, H., et al. ADF/Cofilin accelerates actin dynamics by severing filaments and promoting their depolymerization at both ends. Current Biology: CB. 27 (13), 1956-1967 (2017).
  12. Pollard, T. D., Mooseker, M. S. Direct measurement of actin polymerization rate constants by electron microscopy of actin filaments nucleated by isolated microvillus cores. The Journal of Cell Biology. 88 (3), 654-659 (1981).
  13. Kovar, D. R., Harris, E. S., Mahaffy, R., Higgs, H. N., Pollard, T. D. Control of the assembly of ATP- and ADP-actin by formins and profilin. Cell. 124 (2), 423-435 (2006).
  14. Jégou, A., Carlier, M. -. F., Romet-Lemonne, G. Formin mDia1 senses and generates mechanical forces on actin filaments. Nature Communications. 4, 1883 (2013).
  15. Breitsprecher, D., et al. Rocket launcher mechanism of collaborative actin assembly defined by single-molecule imaging. Science. 336 (6085), 1164-1168 (2012).
  16. Courtemanche, N., Lee, J. Y., Pollard, T. D., Greene, E. C. Tension modulates actin filament polymerization mediated by formin and profilin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (24), 9752-9757 (2013).
  17. Niedermayer, T., et al. Intermittent depolymerization of actin filaments is caused by photo-induced dimerization of actin protomers. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (27), 10769-10774 (2012).
  18. Gateva, G., et al. Tropomyosin isoforms specify functionally distinct actin filament populations in vitro. Current Biology: CB. 27 (5), 705-713 (2017).
  19. Aratyn, Y. S., Schaus, T. E., Taylor, E. W., Borisy, G. G. Intrinsic dynamic behavior of fascin in filopodia. Molecular Biology of the Cell. 18 (10), 3928-3940 (2007).
  20. Pollard, T. D. Rate constants for the reactions of ATP- and ADP-actin with the ends of actin filaments. The Journal of Cell Biology. 103, 2747-2754 (1986).
  21. Wioland, H., Jegou, A., Romet-Lemonne, G. Torsional stress generated by ADF/cofilin on cross-linked actin filaments boosts their severing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (7), 2595-2602 (2019).
  22. Colombo, J., et al. A functional family of fluorescent nucleotide analogues to investigate actin dynamics and energetics. Nature Communications. 12 (1), 548 (2021).
  23. Spudich, J. A., Watt, S. The regulation of rabbit skeletal muscle contraction. I. Biochemical studies of the interaction of the tropomyosin-troponin complex with actin and the proteolytic fragments of myosin. The Journal of Biological Chemistry. 246 (15), 4866-4871 (1971).
  24. Romet-Lemonne, G., Guichard, B., Jégou, A. Using microfluidics single filament assay to study formin control of actin assembly. Methods in Molecular Biology. 1805, 75-92 (2018).
  25. Gieselmann, R., Kwiatkowski, D. J., Janmey, P. A., Witke, W. Distinct biochemical characteristics of the two human profilin isoforms. European Journal of Biochemistry. 229 (3), 621-628 (1995).
  26. Lin, D. C., Lin, S. Actin polymerization induced by a motility-related high-affinity cytochalasin binding complex from human erythrocyte membrane. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (5), 2345-2349 (1979).
  27. Casella, J. F., Maack, D. J., Lin, S. Purification and initial characterization of a protein from skeletal muscle that caps the barbed ends of actin filaments. The Journal of Biological Chemistry. 261 (23), 10915-10921 (1986).
  28. Kremneva, E., et al. Cofilin-2 controls actin filament length in muscle sarcomeres. Developmental Cell. 31 (2), 215-226 (2014).
  29. Le Clainche, C., Carlier, M. -. F. Actin-based motility assay. Current Protocols in Cell Biology. , 1-20 (2004).
  30. Vignjevic, D., et al. Formation of filopodia-like bundles in vitro from a dendritic network. The Journal of Cell Biology. 160 (6), 951-962 (2003).
  31. Duellberg, C., Cade, N. I., Holmes, D., Surrey, T. The size of the EB cap determines instantaneous microtubule stability. eLife. 5, 13470 (2016).
  32. Duellberg, C., Cade, N. I., Surrey, T. Microtubule aging probed by microfluidics-assisted tubulin washout. Molecular Biology of the Cell. 27 (22), 3563-3573 (2016).
  33. Suzuki, E. L., et al. Geometrical constraints greatly hinder formin mDia1 activity. Nano Letters. 20 (1), 22-32 (2020).
  34. Wioland, H., Suzuki, E., Cao, L., Romet-Lemonne, G., Jegou, A. The advantages of microfluidics to study actin biochemistry and biomechanics. Journal of Muscle Research and Cell Motility. 41 (1), 175-188 (2020).

Play Video

Cite This Article
Wioland, H., Ghasemi, F., Chikireddy, J., Romet-Lemonne, G., Jégou, A. Using Microfluidics and Fluorescence Microscopy to Study the Assembly Dynamics of Single Actin Filaments and Bundles. J. Vis. Exp. (183), e63891, doi:10.3791/63891 (2022).

View Video