JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Türkçe

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunology and Infection

Oküler Yüzey Enflamasyonunun İndüklenmesi ve Tutulan Dokuların Toplanması

Published: August 04, 2022
doi:
10.3791/63890
, , , , , ,
1Department of Internal Medicine 3-Rheumatology and Immunology,Friedrich-Alexander-University Erlangen-Nürnberg and Universitätsklinikum Erlangen, 2Deutsches Zentrum für Immuntherapie,Friedrich-Alexander-University Erlangen-Nürnberg and Universitätsklinikum Erlangen

Summary

Oküler yüzey iltihabı oküler yüzey dokularına zarar verir ve gözün hayati fonksiyonlarını tehlikeye atar. Mevcut protokol, oküler inflamasyonu indüklemek ve Meibomian bezi disfonksiyonunun (MGD) bir fare modelinde tehlikeye atılmış dokuları toplamak için bir yöntemi açıklamaktadır.

Abstract

Oküler yüzey hastalıkları, kornea, konjonktiva ve ilişkili oküler yüzey bezi ağının fonksiyonlarını ve yapılarını bozan bir dizi bozukluğu içerir. Meibomian bezleri (MG), gözyaşı filminin sulu kısmının buharlaşmasını önleyen bir kaplama tabakası oluşturan lipitleri salgılar. Nötrofiller ve hücre dışı DNA tuzakları, alerjik göz hastalığının bir fare modelinde MG ve oküler yüzeyi doldurur. Agrega nötrofil hücre dışı tuzakları (aggNET’ler), MG çıkışlarını tıkayan ve MG disfonksiyonunu koşullandıran hücre dışı kromatinden oluşan ağ benzeri bir matris formüle eder. Burada oküler yüzey inflamasyonunu ve MG disfonksiyonunu indüklemek için bir yöntem sunulmuştur. Kornea, konjonktiva ve göz kapakları gibi oküler yüzeyle ilgili organların toplanmasına yönelik prosedürler ayrıntılı olarak açıklanmaktadır. Her organın işlenmesi için belirlenmiş teknikler kullanılarak, MG disfonksiyonunun başlıca morfolojik ve histopatolojik özellikleri de gösterilmiştir. Oküler eksüdalar, oküler yüzeyin enflamatuar durumunu değerlendirme fırsatı sunar. Bu prosedürler topikal ve sistemik antiinflamatuar girişimlerin preklinik düzeyde araştırılmasını sağlar.

Introduction

Bir gözün her yanıp sönmesi, korneanın üzerine dağılmış pürüzsüz gözyaşı filmini doldurur. Oküler yüzey epitelyası, gözyaşı filminin oküler yüzeydeki dağılımını ve doğru yönlendirilmesini kolaylaştırır. Müsinler, göz yüzeyindeki lakrimal bezlerden gelen gözyaşı filminin sulu kısmının konumlandırılmasına yardımcı olmak için kornea ve konjonktiva epitel hücreleri tarafından sağlanır. Son olarak, MG, gözyaşı filmi 1,2,3’ün sulu kısmının buharlaşmasını önleyen bir kaplama tabakası oluşturan lipitleri salgılar. Bu şekilde, tüm oküler organların koordineli fonksiyonları, oküler yüzeyi istilacı patojenlerden veya yaralanmalardan korur ve herhangi bir ağrı veya rahatsızlık olmadan kristal berraklığında görmeyi destekler.

Sağlıklı bir oküler yüzeyde, oküler akan akıntı veya göz romatı tozu, ölü epitel hücrelerini, bakterileri, mukusları ve bağışıklık hücrelerini süpürür. Agrega nötrofil hücre dışı tuzakları (aggNET’ler), hücre dışı kromatinden oluşan ağ benzeri bir matris formüle eder ve bu bileşenleri göz romatizmine dahil eder. AggNET’ler, pro-inflamatuar sitokinlerin ve kemokinlerin proteolitik yıkımı ile inflamasyonu çözer4. Bununla birlikte, işlevsiz hale geldiklerinde, bu anormal aggNET’ler COVID-195’te vasküler tıkanıklıklar, safra kesesi taşları6 ve sialolitiyazis7 gibi hastalıkların patogenezini yönlendirir. Benzer şekilde, oküler yüzeydeki aggNET’ler koruyucu bir rol oynar ve yüksek oranda maruz kalan yüzey8’in iltihaplanmasının çözülmesine katkıda bulunur. Oküler yüzeyde abartılı bir oluşum veya aggNET eksikliği gözyaşı filmi stabilitesini bozabilir ve/veya kornea yaralarına, sikatrize edici konjonktivite ve kuru göz hastalığına neden olabilir. Örneğin, MG’nin tıkanması, kuru göz hastalığının önde gelen nedenlerinden biridir9. AggNET’lerin ayrıca MG kanallarından lipit sekresyon akışını tıkadığı ve Meibomian bezi disfonksiyonuna (MGD) neden olduğu bilinmektedir. MG deliklerinin aggNET’ler tarafından tıkanıklığı, oküler yüzeyi saran yağlı sıvı eksikliğine ve retrograd şişelenmiş sıvıya neden olarak bez fonksiyonunun işlev bozukluğuna ve asinar hasara neden olur. Bu işlev bozukluğu gözyaşı filmi buharlaşmasına, göz kapaklarındaki kenar boşluklarının fibrozisine, göz iltihabına ve MG10,11’de zararlı hasara neden olabilir.

İnsanlarda MGD’nin patolojik sürecini taklit etmek için yıllar içinde çeşitli hayvan modelleri geliştirilmiştir. Örneğin, 1 yaşındaki C57BL / 6 fareleri, 50 yaş ve üstü12,13,14 yaş ve üstü hastalarda oküler hastalık patolojisini yansıtan kuru göz hastalığı (DED) ve MGD üzerindeki yaşa bağlı etkilerin incelenmesine yardımcı olmuştur. Ayrıca, tavşanlar farmakolojik müdahalelerin etkilerini araştırmak için uygun modellerdir. Bu nedenle, tavşanlarda MGD’nin indüklenmesi, epinefrin topikal uygulaması veya 13-cis-retinoik asidin (izotretinoin) sistemik olarak sokulması ile bildirilmiştir 15,16,17,18,19.

Bu hayvan modelleri, MGD’nin patofizyolojisine katkıda bulunan farklı faktörleri belirlemek için yeterli olmasına rağmen, kullanımları kısıtlanmıştır. Örneğin, yaşa bağlı MGD’nin murin modeli, yalnızca yaşlı yetişkinlerde elementleri deşifre etmek için idealdi ve bu nedenle, tavşanlar, çoklu patofizyolojik mekanizmaların araştırılmasını sağladıkları için oküler yüzey hastalıklarını incelemek için en uygun hayvan modeli olarak ortaya çıktı. Bununla birlikte, oküler yüzeydeki proteinleri tespit etmek için kapsamlı analitik araçların bulunmaması ve tavşan genomunun birçok bölümünün açıklamasız olması nedeniyle,araştırmalar için sınırlıdır 20,21.

Ek olarak, kuru göz hastalığının patogenezini araştırmak için kullanılan bu hayvan modelleri, oküler yüzeyin iltihaplanmasını tetikleyen bozukluğun immünolojik kolunu analiz etmek için yeterli ayrıntı sağlamamıştır. Buna göre, Reyes ve ark. tarafından geliştirilen MGD’nin murin modeli, farelerde alerjik göz hastalığı ile insanlarda MGD arasında bir ilişki olduğunu göstermiş ve obstrüktif MGD21’den sorumlu immün etiyolojiyi vurgulamıştır. Bu model, alerjik göz hastalığını, konjonktiva ve göz kapağına nötrofilleri işe alan, MGD ve kronik oküler inflamasyona neden olan TH17 yanıtı ile ilişkilendirir21. Bu murin modelinde MGD ve oküler inflamasyonun indüksiyonu, devam eden bir bağışıklık tepkisi 21 tarafından yönlendirilen lokal inflamasyonun gelişimi sırasında yukarı akış olaylarını araştırmak için değerli bir araçtır21. Mevcut protokol, obstrüktif MGD’nin eşlik ettiği oküler yüzey inflamasyonunu tanımlamaktadır. Bu yöntemde, fareler bağışıklanır ve 2 hafta sonra, 7 gün boyunca immünojen ile oküler yüzeyde meydan okunur. Ayrıca, akut inflamasyon sırasında oküler eksüda ve ilişkili oküler organları izole etme adımları ve kornea, konjonktiva ve göz kapaklarının diseksiyonu anlatılmaktadır.

Protocol

Hayvanları içeren tüm prosedürler, hayvan refahı ile ilgili kurumsal kılavuzlara göre yürütülmüş ve Friedrich-Alexander-University Erlangen-Nuremberg (FAU) hayvan refahı komisyonu tarafından onaylanmıştır (izin numarası: 55.2.2-2532-2-1217). Bu çalışmada 7-9 haftalık dişi C57Bl/6 fareler kullanılmıştır. Fareler ticari kaynaklardan elde edildi ( bakınız Malzeme Tablosu) ve 12 saat gündüz / gece döngüleri ile spesifik patojensiz koşullarda tutuldu. <p class="jove_title…

Representative Results

Bu protokol, oküler yüzey inflamasyonunun murin modelini oluşturmak için sıralı adımları açıklamaktadır. Protokoller, terapötiklerin lokal olarak nasıl uygulanacağını, oküler eksüdaların nasıl elde edileceğini ve sağlıklı ve iltihaplı göz kapakları (Şekil 2), kornea ve konjonktiva gibi ilişkili aksesuar organların nasıl çıkarılacağını göstermeyi amaçlamaktadır. Konjonktivanın izolasyonu için üst göz kapakları diseke edildiğinde dikkat edilmeli ve…

Discussion

Meibomian bezlerinin yağlı salgılanması sağlıklı bir göz için büyük önem taşımaktadır22. Bununla birlikte, bu yağ bezlerinin, her iki göz kapağının tarsal plakalarında bulunan paralel iplikçikler olarak sıralanan toplanmış nötrofil hücre dışı tuzaklar (aggNET’ler) tarafından tıkanması, gözyaşı filmi23’ü bozabilir. Bu bozulma Meibomian bezi disfonksiyonu (MGD)1 ve hızlandırılmış gözyaşı buharlaşması ile s…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma kısmen Alman Araştırma Vakfı (DFG) 2886 PANDORA Projesi-No.B3 tarafından desteklenmiştir; SCHA 2040/1-1; MU 4240/2-1; CRC1181(C03); TRR241(B04), H2020-FETOPEN-2018-2020 Proje 861878 ve Volkswagen-Stiftung (Hibe 97744) tarafından MH’ye.

Materials

1x PBS Gibco
Aluminium Hydroxide Imject alum Adjuvant 77161 40 mg/ mL
Final Concentration: in vivo: 1 mg/ 100 µL
C57Bl/6 mice, aged 7–9 weeks Charles River Laboratories 
Calcium Carl roth CN93.1 1 M
Final Concentration: 5 mM
Curved forceps FST by Dumont SWITZERLAND 5/45 11251-35
Fine sharp scissor FST Stainless steel, Germany 15001-08
Laminar safety cabinet Herasafe
Macrophotography Camera Canon EOS6D
Macrophotography Camera (without IR filter) Nikon D5300
Mnase New England biolabs M0247S 2 x 106 gel U/mL
Multi-analyte flow assay kit (Custom mouse 13-plex panel) Biolegend CLPX-200421AM-UERLAN
NaCl 0,9% (Saline) B.Braun
Ovalbumin (OVA) Endofit, Invivogen 9006-59-1 10 mg/200 µL in saline
Pertussis toxin  ThermoFisher Scientific  PHZ1174 50 µg/ 500 µL in saline
Final Concentration: in vivo: 100 µg/ 100 µL
Petridish Greiner bio-one 628160
Scalpel Feather disposable scalpel No. 21  Final Concentration: in vivo:  300 ng/ 100 µL
Stereomicroscope Zaiss Stemi508
Syringe (corneal/iris washing) BD Microlane 27 G x 3/4 – Nr.20 0,4 x 19 mm
Syringe (i.p immunization) BD Microlane 24 G1"-Nr 17, 055* 25 mm
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gilbard, J. P., Rossi, S. R., Heyda, K. G. Tear film and ocular surface changes after closure of the meibomian gland orifices in the rabbit. Ophthalmology. 96 (8), 1180-1186 (1989).
  2. Mishima, S., Maurice, D. M. The oily layer of the tear film and evaporation from the corneal surface. Experimental Eye Research. 1, 39-45 (1961).
  3. Gipson, I. K. The ocular surface: The challenge to enable and protect vision: The Friedenwald lecture. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 48 (10), 4391-4398 (2007).
  4. Hahn, J., et al. Aggregated neutrophil extracellular traps resolve inflammation by proteolysis of cytokines and chemokines and protection from antiproteases. The FASEB Journal. 33 (1), 1401-1414 (2019).
  5. Leppkes, M., et al. Vascular occlusion by neutrophil extracellular traps in COVID-19. EBioMedicine. 58, 102925 (2020).
  6. Munoz, L. E., et al. Neutrophil extracellular traps initiate gallstone formation. Immunity. 51 (3), 443-450 (2019).
  7. Schapher, M., et al. Neutrophil extracellular traps promote the development and growth of human salivary stones. Cells. 9 (9), 2139 (2020).
  8. Mahajan, A., et al. Frontline science: Aggregated neutrophil extracellular traps prevent inflammation on the neutrophil-rich ocular surface. Journal of Leukocyte Biology. 105 (6), 1087-1098 (2019).
  9. DEWS Definition and Classification Subcommittee. The definition and classification of dry eye disease: Report of the Definition and Classification Subcommittee of the International Dry Eye Workshop. The Ocular Surface. 5 (2), 75-92 (2007).
  10. Nichols, K. K., et al. The international workshop on meibomian gland dysfunction: Executive summary. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 52 (4), 1922-1929 (2011).
  11. Mahajan, A., et al. Aggregated neutrophil extracellular traps occlude Meibomian glands during ocular surface inflammation. The Ocular Surface. 20, 1-12 (2021).
  12. Jester, B. E., Nien, C. J., Winkler, M., Brown, D. J., Jester, J. V. Volumetric reconstruction of the mouse meibomian gland using high-resolution nonlinear optical imaging. The Anatomical Record. 294 (2), 185-192 (2011).
  13. Nien, C. J., et al. Age-related changes in the meibomian gland. Experimental Eye Research. 89 (6), 1021-1027 (2009).
  14. Parfitt, G. J., Xie, Y., Geyfman, M., Brown, D. J., Jester, J. V. Absence of ductal hyper-keratinization in mouse age-related meibomian gland dysfunction (ARMGD). Aging. 5 (11), 825-834 (2013).
  15. Lambert, R. W., Smith, R. E. Pathogenesis of blepharoconjunctivitis complicating 13-cis-retinoic acid (isotretinoin) therapy in a laboratory model. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 29 (10), 1559-1564 (1988).
  16. Jester, J. V., Nicolaides, N., Kiss-Palvolgyi, I., Smith, R. E. Meibomian gland dysfunction. II. The role of keratinization in a rabbit model of MGD. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 30 (5), 936-945 (1989).
  17. Jester, J. V., et al. In vivo biomicroscopy and photography of meibomian glands in a rabbit model of meibomian gland dysfunction. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 22 (5), 660-667 (1982).
  18. Lambert, R., Smith, R. E. Hyperkeratinization in a rabbit model of meibomian gland dysfunction. American Journal of Ophthalmology. 105 (6), 703-705 (1988).
  19. Knop, E., Knop, N., Millar, T., Obata, H., Sullivan, D. A. The international workshop on meibomian gland dysfunction: Report of the subcommittee on anatomy, physiology, and pathophysiology of the meibomian gland. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 52 (4), 1938-1978 (2011).
  20. Huang, W., Tourmouzis, K., Perry, H., Honkanen, R. A., Rigas, B. Animal models of dry eye disease: Useful, varied and evolving (Review). Experimental and Therapeutic Medicine. 22 (6), 1394 (2021).
  21. Reyes, N. J., et al. Neutrophils cause obstruction of eyelid sebaceous glands in inflammatory eye disease in mice. Science Translational Medicine. 10 (451), (2018).
  22. Knop, E., Korb, D. R., Blackie, C. A., Knop, N. The lid margin is an underestimated structure for preservation of ocular surface health and development of dry eye disease. Developments in Ophthalmology. 45, 108-122 (2010).
  23. Knop, N., Knop, E. Meibomian glands. Part I: anatomy, embryology and histology of the Meibomian glands. Ophthalmologe. 106 (10), 872-883 (2009).
  24. Nien, C. J., et al. Effects of age and dysfunction on human meibomian glands. Archives of Ophthalmology. 129 (4), 462-469 (2011).
  25. Lio, C. T., Dhanda, S. K., Bose, T. Cluster analysis of dry eye disease models based on immune cell parameters – New insight into therapeutic perspective. Frontiers in Immunology. 11, 1930 (2020).
  26. Nguyen, D. D., Luo, L. J., Lai, J. Y. Thermogels containing sulfated hyaluronan as novel topical therapeutics for treatment of ocular surface inflammation. Materials Today Bio. 13, 100183 (2022).
  27. Lin, P. H., et al. Alleviation of dry eye syndrome with one dose of antioxidant, anti-inflammatory, and mucoadhesive lysine-carbonized nanogels. Acta Biomaterialia. 141, 140-150 (2022).
  28. Yu, D., et al. Loss of beta epithelial sodium channel function in meibomian glands produces pseudohypoaldosteronism 1-like ocular disease in mice. American Journal of Pathology. 188 (1), 95-110 (2018).
  29. Mauris, J., et al. Loss of CD147 results in impaired epithelial cell differentiation and malformation of the meibomian gland. Cell Death & Disease. 6 (4), 1726 (2015).
  30. Ibrahim, O. M., et al. Oxidative stress induced age dependent meibomian gland dysfunction in Cu, Zn-superoxide dismutase-1 (Sod1) knockout mice. PloS One. 9 (7), 99328 (2014).
  31. McMahon, A., Lu, H., Butovich, I. A. A role for ELOVL4 in the mouse meibomian gland and sebocyte cell biology. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 55 (5), 2832-2840 (2014).
  32. Miyake, H., Oda, T., Katsuta, O., Seno, M., Nakamura, M. Meibomian gland dysfunction model in hairless mice fed a special diet with limited lipid content. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 57 (7), 3268-3275 (2016).
  33. Schaumberg, D. A., et al. The international workshop on meibomian gland dysfunction: Report of the subcommittee on the epidemiology of, and associated risk factors for, MGD. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 52 (4), 1994-2005 (2011).
  34. Lee, S. Y., et al. Analysis of tear cytokines and clinical correlations in Sjogren syndrome dry eye patients and non-Sjogren syndrome dry eye patients. American Journal of Ophthalmology. 156 (2), 247-253 (2013).
  35. Nakae, S., et al. Antigen-specific T cell sensitization is impaired in IL-17-deficient mice, causing suppression of allergic cellular and humoral responses. Immunity. 17 (3), 375-387 (2002).
  36. von Vietinghoff, S., Ley, K. IL-17A controls IL-17F production and maintains blood neutrophil counts in mice. Journal of Immunology. 183 (2), 865-873 (2009).
  37. Langrish, C. L., et al. IL-23 drives a pathogenic T cell population that induces autoimmune inflammation. Journal of Experimental Medicine. 201 (2), 233-240 (2005).
  38. Chen, Y., et al. Anti-IL-23 therapy inhibits multiple inflammatory pathways and ameliorates autoimmune encephalomyelitis. Journal of Clinical Investigation. 116 (5), 1317-1326 (2006).

Tags

Ocular Surface InflammationMeibomian Gland DysfunctionNeutrophil Extracellular TrapsImmunogenOvalbuminOcular ExudatesConjunctivaCornea

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Singh, J., Shan, X., Mahajan, A., Herrmann, M., Schauer, C., Knopf, J., Muñoz, L. E. Induction of Ocular Surface Inflammation and Collection of Involved Tissues. J. Vis. Exp. (186), e63890, doi:10.3791/63890 (2022).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image