Oligonükleotidlerin Kimyasal Trifosforilasyonu

1. Katı bir destek üzerinde 5′-hidroksil oligonükleotidlerin otomatik katı faz sentezi Hedef oligonükleotid bileşimine ve cihaz talimatlarına göre reaktifler ve fosforamiditlerle otomatik DNA / RNA sentezleyicisini hazırlayın. Sentezleyici üzerine katı destek içeren bir sentez sütunu yükleyin ve sentezleyici cihaz protokollerine göre oligonükleotidleri sentezleyin.NOT: Trifosforilasyon prosedürü, 1 μmol ölçeğinde hazırlanan oligonükleotidler için optimize edilmiştir. Önceki adımda oligonükleotid sentezinin bir parçası olarak katı destekli oligonükleotid 5′-hidroksil üretmek için 5′-dimetoksitritil koruma grubunu çıkarın veya sentezleyici cihaz protokollerine göre bir terminal detritilasyon adımı gerçekleştirin. Katı destek üzerindeki 5′-hidroksil oligonükleotid içeren sütunu sentezleyiciden çıkarın, artık çözücüyü çıkarmak için 10 dakika boyunca bir ev vakumu altında kurutun ve trifosforilasyon malzemeleri hazırlandıktan sonra trifosforilasyona (bölüm 3 ve 4) devam edin (bölüm 2).NOT: Hemen kullanılmazsa, kurutulmuş kolon normal bir atmosfer altında, -20 °C’de kurutucu ile kapalı plastik bir kapta saklanabilir. Bu aşamada daha fazla kurumaya gerek yoktur, çünkü kolon bölüm 3’teki trifosforilasyondan önce iyice kurutulur. 2. Trifosforilasyon için malzeme hazırlama Ayarlanabilir basınca sahip kuru bir argon kaynağını en az iki hatlı bir gaz manifolduna takın ve bir kabarcığa bağlayın. Reaksiyon aparatına bağlantıyı kolaylaştırmak için hatların 1 mL plastik şırıngalarda sonlandığından emin olun. 1 mL plastik şırıngalar, üç polipropilen tapa, ilişkisiz iğneler, 1,5 mL polipropilen tüpler ve küçük bir metal spatula dahil olmak üzere trifosforilasyon sırasında kullanılacak ekipmanları toplayın. Kullanımdan en az 1 gün önce oda sıcaklığında kurutucu ile kapalı bir kapta veya kurutucuda saklayın. Kullanımdan en az 1 gün önce susuz 1,4-dioksan, 3:1 dioksan:hacimce piridin, N,N-dimetilformamid (DMF) ve asetonitrilin (ACN) her birini, kurutma kapanlı kurutulmuş 30 mL cam şişelerde (kapalı membran paketlerinde 4 şmoleküler elekler) 30 mL hazırlayın. Kauçuk septa ile kapatın ve kurutuculu bir kurutucuda saklayın. Katı 2-kloro-4H-1,3,2-benzodioksafosforin-4-one (salisil fosforokloridit, SalPCl) orijinal kabında 4 ° C’de kurutucu ile kapalı bir kavanoz içinde saklayın. Kullanımlar arasında kabı daima argon ile yıkayın. Trifosforilasyon reaksiyonundan en az 5 gün önce bir tributylammonium pyrophosphate (TBAP) çözeltisi hazırlayın: Kurutulmuş 30 mL cam şişede 1-5 g katı TBAP tartın ve TBAP başına 1 mL DMF ve 0.5 mL tributilamin içinde çözün. Üç kurutma kapanı ekleyin, şişeyi argon altında kauçuk bir septumla kapatın ve gazı gidermek için 30 dakika boyunca argon ile kabarcıklayın. Moleküler eleklerin tüm eser suyu emmesini sağlamak için 5 gün boyunca 4 ° C’de kurutucu ile kapalı bir kavanozun içinde saklayın. Kavanozu -20 ° C’de saklayın ve 6 ay sonra taze hazırlayın. 3. Trifosforilasyon aparatının montajı ve kullanılması Sentez kolonunun -20 °C’de depodan alınması durumunda oda sıcaklığına ısınmasına izin verin. Şekil 2’de gösterilen reaksiyon odasını monte edin: Ön odacığı hazırlayın: pistonu kuru bir 1 mL şırıngadan çıkarın, şırınganın üstünü makas veya tıraş bıçağı kullanarak kesin ve şırıngayı sentez kolonuna takın. Üç yönlü stopcock’u şırınganın üstüne takın ve stopcock’un yan girişini bubbler ile kuru argon kaynağına takın, böylece stopcock’un üst girişi reaktif enjeksiyon portu olur. Bu aparatı kelepçeli bir standa sabitleyin ve tüm yukarı akış derzlerini balmumu sızdırmazlık filmi ile kapatın. Durdurma musluğunu, enjeksiyon portu kapalı olacak ve aparat argon kaynağına açık olacak şekilde ayarlayın. Kabarcığı kapatın ve düşük basınçta (<10 psi) argon'un reaksiyon odasından 5 dakika boyunca akmasına izin verin.NOT: Çoklu reaksiyon odaları, trifosforilat 2-4 oligonükleotidlere paralel olarak ayarlanabilir. Bununla birlikte, manifolddan bir hat, reaktif şişelerine argon tedarik etmek için ayrılmalıdır. Kabarcığı tekrar açın ve atık şırınga olacak sentez sütununun dibine bir şırınga takın. Atık şırıngayı kullanarak argonu sütundan tekrar tekrar çekin; daha sonra, şırıngayı piston tamamen içeri itilerek yeniden takın.NOT: Reaktifler yüklenmediği sürece, durdurma, Şekil 2A’da gösterildiği gibi, enjeksiyon portu kapalı ve aparat argon kaynağına açılacak şekilde ayarlanmalıdır. Benzer şekilde, atık şırınga bağlanmalı ve reaktifleri aktif olarak çıkarmadıkça sentez kolonuna eklem balmumu sızdırmazlık filmi ile kapatılmalıdır. Bir reaktif veya çözücü eklemek için: Kuru argon kaynağına bir iğne takın ve iğneyi şişe içeriğine batırmamaya dikkat ederek reaktif veya çözücü şişe septumuna yerleştirin. Kuru bir şırıngayı iğneyle birleştirin ve şişe içeriğine batırmadan reaktif veya çözücü şişe septumuna yerleştirin. Şırıngayı argon ile doldurun, iğneyi septumdan çekin ve argonu dışarı atın. Şırıngayı argon ile doldurun ve tekrar dışarı atın; Daha sonra, şırıngayı argon basıncı altında gerekli miktarda çözücü veya reaktif ile doldurun. Aparat üzerindeki durdurmayı, argon kaynağı kapalı olacak ve enjeksiyon portu açık olacak şekilde ayarlayın (Şekil 2B). Doldurulmuş şırıngayı ve iğneyi kaynak şişeden hızla çıkarın, iğnenin yanına veya ucuna yapışmış çözücüleri silin ve iğneyi enjeksiyon portuna yerleştirin. Reaktifi aparatın ön odasına atın, iğneyi çıkarın ve enjeksiyon portunu kapatın, aparatı argon kaynağına yeniden açın. Atık şırıngayı kullanarak sıvıyı ön odadan sentez sütunu boyunca yavaşça çekin, böylece tüm sıvı artık atık şırıngada tutulur. Şimdi, çözeltiyi yavaşça sentez sütununa geri iterek sütunda gaz kabarcığı olmadığından emin olun. Karıştırmak veya çalkalamak için, çözeltiyi atık şırınga ile sütunun üzerinde yavaşça yukarı ve aşağı çekin.NOT: Contaların kırılmadığından emin olmak için sıvıyı her zaman reaksiyon odasından yavaşça ve nazikçe hareket ettirin, bu da havanın aparata girmesine izin verir. Bir reaktifi veya çözücüyü sütundan çıkarmak için: Çözeltiyi yavaşça atık şırıngaya çekin. Çözeltinin büyük kısmı atık şırıngaya geçtikten sonra, kalan çözücüyü kolondan temizlemek için argon’u çekin. Atık şırınga ekleminin etrafındaki balmumu sızdırmazlık filmini çıkarın, ardından şırıngayı çıkarın ve atık çözeltisini atın. Atık şırıngayı yeni, kuru bir şırınga ile değiştirin ve eklemi balmumu sızdırmazlık filmi ile yeniden kapatın. Resim 2: Trifosforilasyon aparatı. Karıştırma veya reaksiyonlar sırasında, cihaz (A) argon kaynağına (i) açıktır ve üç yönlü stopcock (ii) ayarlanarak havaya kapatılır. Reaktifler, ön odacıktan (iii) atık şırınga (v) vasıtasıyla sentez kolonuna (iv) çekilir. Reaktifler, tüm sıvıyı atık şırıngaya (v) çekerek ve atarak uzaklaştırılır. Reaktifleri (B) yüklerken, üç stopcock (ii) atmosfere açıktır ve reaktif bir şırınga ve iğne (vi) vasıtasıyla ön odaya (iii) yüklenir. (C) Reaktif karıştırma ve reaksiyona sokma için (A)’da olduğu gibi ayarlanmış monte edilmiş aparatın bir fotoğrafı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. 4. Sentetik 5′-hidroksil oligonükleotidin kolon üstü trifosforilasyonu SalPCl ve TBAP çözeltisini -20 ° C’de depolamadan çıkarın ve kullanmadan önce oda sıcaklığına ısınmalarını bekleyin. 3.3.1-3.3.3 adımlarına göre ön odaya 200 μL piridin / dioksan ekleyin. Bununla birlikte, 4.4. adıma kadar çözücüyü sentez kolonuna yüklemeyin. 6-12 mg SalPCl’yi kuru bir 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne tartmak için kuru bir metal spatula kullanın ve çözücüyü mikrosantrifüj tüpü içinde yavaşça yukarı ve aşağı şırınga ederek 100 μL dioksan içinde çözün. Çözünmüş SalPCl’yi ön odaya ekleyin ve adım 3.3’ü izleyerek sentez sütununa yükleyin. 15 dakika boyunca reaksiyona girmesine izin verin, çözeltiyi her 5 dakikada bir çalkalayın. SalPCl çözümünü adım 3.4’e göre çıkarın ve atın.NOT: SalPCl büyük miktarda eklenir ve reaksiyon odasına hazırlık ve yükleme sırasında emilen suyu temizler. Bununla birlikte, 4.5 ve 4.6. adımlar sırasında herhangi bir nemin sokulması, nihai oligonükleotid 5′-trifosfat verimini tehlikeye atacaktır. Ön odaya 250 μL TBAP çözeltisi ekleyin ve adım 3.3’ü izleyerek sentez sütununa yükleyin. Her 5 dakikada bir çalkalayarak 20 dakika boyunca tepki vermesine izin verin. TBAP çözümünü adım 3.4’e göre çıkarın ve atın. Kolonu 0,5 mL DMF, ardından 0,5 mL ACN ile yıkayın, her eklemeden sonra çözücüyü adım 3.3 ve 3.4’e göre çıkarın. Ön odaya 250 μL oksitleyici çözelti (tetrahidrofuran (THF) / piridin / su içinde 0.1 M iyot, 88: 10: 2) ekleyin ve adım 3.3’ü izleyerek sentez sütununa yükleyin. Her 10 dakikada bir çalkalayarak 30 dakika boyunca tepki vermesine izin verin. Oksitleyici çözeltiyi adım 3.4’e göre çıkarın ve atın. Kolonu 0,5 mL ACN ile yıkayın ve 3.3 ve 3.4 numaralı adımlara göre çıkarın. Reaksiyon aparatını sökün. Sentez kolonunu 5 mL ACN ile yıkayın ve kolonu kurutun. 5. Katı destek, korumasızlık ve saflaştırmadan ayrılma Kurutulmuş katı destek reçinesini sentez kolonundan çıkarın ve silikon o-ringli 1,5 mL polipropilen vidalı kapaklı sızdırmaz bir tüpe aktarın. Reçineyi% 28-30% sulu amonyak ve% 40 sulu metilamin (AMA) 1: 1 karışımının 1 mL’sinde askıya alın ve tüpü sıkıca kapatın. Nazik inversiyon39 ile aralıklı karıştırma ile 10 dakika boyunca 65 ° C’de inkübe edin. 40 nt’den daha uzun oligonükleotidler için oda sıcaklığında 2 saat daha hafif bir tedavi kullanın.DİKKAT: AMA çözeltisinin ısıtılması, tüpü yüksek basınç altına sokacaktır. Tüp sıkıca kapatılmazsa veya amonyak uyumlu (silikon) bir o-ring kullanmazsa, tüp gazı tahliye edebilir veya çözücü sızdırabilir, bu da potansiyel olarak güvenliği veya nihai ürün verimini tehlikeye atabilir. Sıcak AMA çözümü gazı şiddetli bir şekilde evrimleştirebileceğinden, tüpü ortam sıcaklığının üzerindeyken asla açmayın. Tüpü buz üzerinde soğutun ve kısaca santrifüj yapın (10 s için 6.000-12.000 × g). Süpernatantı reçineden çıkarın, 0,2 μm filtre ile donatılmış bir şırıngadan süzün ve yeni, steril bir polipropilen tüpe aktarın. Amonyak nötrleştirici kimyasal tuzak ile donatılmış bir vakum santrifüjü kullanarak çözeltiyi kuruluğa buharlaştırın.NOT: Sentetik oligonükleotid, 2′-silil koruma gruplarına sahip herhangi bir RNA nükleotidi içermiyorsa, adım 5.8’e atlayın. Kurutulmuş malzemeyi THF’de 1 mL 1 M tetrabütilamonyum florür (TBAF) içinde çözerek, 55 ° C’ye ısıtarak, oligonükleotidi tamamen çözmek için gerekirse çalkalayarak ve oda sıcaklığında 16-24 saat40,41 saat inkübe ederek silil koruma gruplarını çıkarın. TBAF çözeltisini 1 mL 1 M Tris tamponu, pH 7,5 ile söndürün ve bir vakum santrifüjü kullanarak THF’yi çıkarın. TBAF tuzlarını, üreticinin talimatlarını izleyerek tek kullanımlık bir boyut hariç tutma sütunu kullanarak çıkarın. 15 nt’den kısa oligonükleotidler için, elüatı fraksiyonlar halinde toplayarak ve ana ürün fraksiyonlarını bir UV-Vis spektrofotometresinde 260 nm’de absorbans ile tanımlayarak ürünün elüsyonunu onaylayın. Korumasız RNA oligonükleotidi, 15 nt’den azsa liyofilizasyon veya vakum santrifüjü veya 15 nt’den büyükse etanol çökeltisi ile konsantre edin. Oligonükleotid boyutu, jel plakası ve standı için uygun protokollere göre, 19:1 mono:bis akrilamid stoğu kullanarak% 10-20% poliakrilamid / 8 M üre / 1x TBE jel hazırlayın. Jel plakasını rezervuarlarda 1x TBE ile jel standına monte edin ve en az 30 dakika boyunca 35 W’ta (veya jel plaka formatına uygun olarak) ön çalıştırma yapın. Katı oligonükleotidi üre jeli yükleme tamponunda (8 M üre,% 10 sakaroz, 50 mM Tris, pH 8, bromofenol ve ksilen siyanol çalışan boyalarla 1 mM EDTA) çözün ve 80 ° C’ye ısıtın. Poliakrilamid jeli üzerine yükleyin ve 25-35 W’ta 1-2 saat boyunca çalıştırın (veya jel plaka formatı ve oligonükleotid boyutu için uygun olduğu şekilde).NOT: Bromofenol mavisi veya ksilen siyanol, ürünle birlikte göç ederse, 15 nt’den kısa oligonükleotidler için jel yükleme tamponundan çıkarılmalıdır, çünkü bu boyaların etanol çökeltmesi olmadan salınan oligonükleotidden çıkarılması zordur. Jel elektroforezi tamamlandığında, jel plakasını jel standından çıkarın, jel plakasını sökün ve jeli polivinilklorür filmine sarın. 254 nm UV ışığı ile arka gölgeleme yaparak ürün bantlarını tanımlayın ve bir tıraş bıçağı kullanarak ana ürün bandını tüketin. Oligonükleotidi eksize edilmiş jelden ezme ve ıslatma yöntemi42 ile ekstrakte edin. Eksize edilmiş jeli plastik bir şırıngadan veya mekanik olarak ekstrüzyon yaparak ezin. 15 nt’den uzun oligonükleotidler için: 3x hacimli ezilme ve ıslatma tamponunda (300 mM NaCl; 10 mM Tris, pH 8; 1 mM EDTA) ajitasyon veya sallama ile en az 12 saat boyunca süzün. Çözeltiyi 0,2 μm filtre ile donatılmış bir şırıngadan geçirerek katı jel parçalarını çıkarın ve oligonükleotidi etanol çökeltisi ile konsantre edin. 15 nt’den kısa oligonükleotid için: 3x hacim nükleaz içermeyen suda ajitasyon veya sallama ile en az 12 saat boyunca süzün. Çözeltiyi 0,2 μm filtre ile donatılmış bir şırıngadan geçirerek katı jel parçalarını çıkarın ve liyofilizasyon ile konsantre edin. Adım 5.6’da olduğu gibi tek kullanımlık boyut hariç tutma sütunu kullanarak artık tuzları ve çözünürleri çıkarın. Liyofilizasyon ile konsantre olun. Saflaştırılmış trifosforile oligonükleotidleri -20 °C’de TE tamponunda (10 mM Tris, pH 8; 1 mM EDTA) veya benzer bir oligonükleotid depolama tamponunda saklayın. Bir UV-Vis spektrofotometresi kullanarak absorbansı 260 nm’de ölçerek oligonükleotidin konsantrasyonunu belirleyin.NOT: Oligonükleotidin tahmini yok olma katsayısı, 5′-fosforilasyon durumundan etkilenmemelidir ve bir oligonükleotid yok olma katsayısı hesaplayıcısı kullanılarak dizisinden hesaplanabilir. Trifosforilasyonu kütle spektrometrisi ile doğrulayın. 5′-hidroksil oligonükleotidinkine göre +239.94 Da’lık beklenen bir kütle arayın.NOT: Matris yardımlı lazer desorpsiyonu/iyonizasyonu veya elektrosprey iyonizasyon kütle spektrometresi (sırasıyla MALDI-MS veya ESI-MS), nükleik asitler için optimize edilmiş protokolleri kullanırken oligonükleotidin trifosforilasyon durumunu tanımlamak için uygundur. Bununla birlikte, ESI-MS, daha düşük iyon parçalanma oranları nedeniyle daha tutarlı sonuçlar sağlar; Malzeme Tablosunda temsili bir ticari hizmet verilmektedir. 6. Ribozimin kendi kendini kopyalaması için substratlar olarak trifosforile oligonükleotidler DİKKAT: 32P radyoaktif bir izotoptur ve aşağıdaki adımlar, bir laboratuvarda radyoaktif malzemelerle çalışmak için standart güvenlik protokolleri kullanılarak ve ilgili Çevre Sağlığı ve Güvenliği departmanları tarafından radyoaktif malzemelerin kullanımı için onaylanmış bir araştırmacı tarafından gerçekleştirilmelidir. Alternatif olarak, kendi kendini kopyalayan ribozim substratı A, 5′-floresein etiketi14 ile sentetik olarak hazırlanabilir ve adım 7.9’da olduğu gibi floresan olarak görüntülenebilir. A çözeltisini, kendi kendini çoğaltan ribozim E ve 5′-32 P etiketli RNA substratı A14’ün bir karışımı olarak sırasıyla 0.30μM ve 30 μM konsantrasyonlarına hazırlayın. Sırasıyla 75 mM EPPS tamponunda, pH 8.5 ve 37.5 MgCl 2’de in vitro transkripsiyon 14 veya yukarıdaki gibi kimyasal trifosforilasyon ile hazırlanan15 μM trifosforile RNA substratı B ile B transkriptlenmiş ve B-sentetik çözeltiler hazırlayın. Her iki çözümü de 42 °C’ye getirin.NOT: Tüm RNA bileşenleri Malzeme Tablosunda listelenmiştir. Kendi kendini çoğaltmayı başlatmak için, 5 μL A çözeltisini 10 μL B transkribe edilmiş veya B-sentetik çözeltisi ile 0,1 μM E, 10 μM A, 10 μM B, 25 mM MgCl2 ve 50 mM EPPS tamponu, pH 8,5 nihai konsantrasyonuna hızla karıştırın. Reaksiyon karışımını 42 °C’de inkübe edin. Düzenli aralıklarla, 0.5 μL alikot alın ve 9.5 μL formamid jel yükleme tamponunda (% 95 formamid; 10 mM EDTA, pH 8) söndürün. Jel plakası ve standı için uygun protokollere göre analitik bir poliakrilamid / 8 M üre / 1x TBE jel hazırlayın. Dökme jeli ve plakayı bir jel standına monte edin, rezervuarları 1x TBE ile doldurun ve 30 dakika boyunca 40 W’ta (veya farklı jel plakalar ve standlar için uygun şekilde) ön çalıştırma yapın. Söndürülmüş reaksiyon numunelerini 80 °C’ye ısıtın, numunenin 5 μL’sini her bir kuyucuğa yükleyin ve jeli yaklaşık 40 dakika boyunca 40 W’ta çalıştırın (veya farklı jel plakaları ve standları için uygun olduğu şekilde). Jel plakasını jel standından çıkarın, sökün ve jeli polivinilklorür filmine sarın. Jeli bir fosfor perdesi ile örtün ve 1 saat boyunca maruz bırakın (veya 32P cpm için uygun şekilde); floresan/fosforesan jel tarayıcı kullanarak ekranı tarayın. Jel görüntü ölçme yazılımını kullanarak reaksiyon verimini ölçün. Analiz Araç Kutusu’nu kullanarak jel görüntüyü açın, Analiz | Şekil Tanımı, dikdörtgen şekli | Alanlar’ı seçin ve her seferinde ve her iki reaksiyonda da reaksiyona girmemiş A ve ürün E’ye karşılık gelen bantların etrafına aynı boyutta dikdörtgenler çizin. Analiz |’ni seçin Arka Plan Çıkarma, dikdörtgen şekli | Alanlar’ı seçin ve jel görüntüsünün boş bir bölümüne aynı boyutta bir dikdörtgen çizin. Tüm dikdörtgenler için arka plan çıkarma yöntemini Görüntü Dikdörtgeni olarak değiştirin. Pencere | 2 Alan Penceresi’ni ve ardından | Düzenle’yi seçin Niceliklendirilmiş bant piksel birimlerini bir elektronik tablo dosyasına aktarmak için Excel’e dışa aktar. E ürününün zamana karşı konsantrasyonunu çizin ve istatistiksel veri sığdırma yazılımı kullanarak verileri lojistik büyüme Eq (1) değerine sığdırın:[E] = (1)A’nın reaksiyonun maksimum derecesi olduğu yerde, b sigmoidisite derecesidir ve c üstel büyüme oranıdır. Dışa aktarılan elektronik tabloda, her seferinde ve her iki reaksiyonda ürünün fraksiyonel verimini belirlemek için ürün E hacmini A substratı ve ürün E hacimlerinin toplamına bölün. Zamanın bir fonksiyonu olarak E ürününün verimini belirlemek için A substratının (10 μM) başlangıç konsantrasyonu ile çarpın. İstatistiksel veri sığdırma yazılımında Dosya |’ni seçin Yeni | Yeni Proje Dosyası, Yeni Tablo ve Grafik altında XY’yi seçin ve Oluştur’a tıklayın. Bitişik sütunlarda hem reaksiyonların reaksiyon sürelerini hem de ürün E verimlerini girin ve sütunları buna uygun şekilde etiketleyin (örneğin; “zaman”, “transkripte edilmiş B”, “sentetik B”). | Ekle’yi seçin Yeni Analiz, XY analizlerini seçin | Doğrusal olmayan regresyon (eğriye sığma) ve ardından Tamam’ı tıklatın. Büyüme eğrileri | seçin Lojistik büyüme ve Tamam’a tıklayın; diğer parametreleri ayarlamayın. Sonuçlar altındaki sığdırma parametrelerini ve güven aralıklarını ve Grafikler altındaki veri noktalarının ve takılı eğrilerin grafiğini gözlemleyin. 7. L-RNA’nın çapraz kiral kopyalanması 20 μM D-RNA 27.3t çapraz kiral polimeraz, 2 μM 5′-floresein etiketli L-RNA primer, 4 μM biyotinile L-RNA çekiç kafası şablonu ve L-RNA pppCUG, pppAUG, pppAGG ve pppCGC’nin her biri 20 μM içeren 10 μL RNA çözeltisini, 50 mM Tris, pH 8.3’te hazırlayın. RNA’yı 1 dakika boyunca 90 ° C’ye ısıtarak ve bir PCR termosiklusunda 0.2 ° C / s’de 23 ° C’ye soğutarak tavlayın. Polimeraz, astar ve şablon hakkında ayrıntılar için Malzeme Tablosu’na bakın. RNA çözeltisini 17 °C’de inkübe edin ve 10 μL 2x başlangıç tamponu (400 mM MgCl2, 500 mM NaCl ve 50 mM Tris, pH 8.3) ekleyerek reaksiyona başlayın. Reaksiyonun tüm bileşenlerinin nihai konsantrasyonlarının 10 μM polimeraz, 1 μM astar, 2 μM şablon, her trinükleotid 5′-trifosfat, 200 mM MgCl2, 250 mM NaCl ve 50 mM Tris, pH 8.3 olduğundan emin olun. Reaksiyon ilerledikçe, 10 μL alikot alın ve 5 μL 0.5 M EDTA, pH 8 ile söndürün. Her söndürülmüş reaksiyon numunesine, biyotinillenmiş şablon aracılığıyla trimer uzatılmış primerleri yakalamak için TE tamponunda 10 μL 1 M NaCl’de asılı duran 0,1 mg streptavidin kaplı manyetik boncuk (20 pmol biyotin-oligonükleotid bağlama kapasitesi) ekleyin ve çalkalama ile oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Boncukları bir boncuk yakalama mıknatısı üzerinde yakalayın, sıvıyı çıkarın ve atın ve 50 μL yıkama çözeltisi ekleyin (% 0,05 nötr deterjanla TE’de 250 mM NaCl). Boncukları karıştırın, tekrar yakalayın ve yıkama solüsyonunu çıkarın. Bir kez daha tekrarlayın. Uzatılmış astarı boncuklardan çıkarmak için, 50 μL elüsyon çözeltisi (% 0,05 nötr deterjanla 25 mM NaOH) ekleyin ve boncukları karıştırın. Boncukları yeniden yakalayın, elüsyon çözeltisini çıkarın, 100 mM Tris (pH 7.5) ile söndürün ve etanol ile çökeltin. Jel plakası ve standı için uygun protokollere göre analitik bir poliakrilamid / 8 M üre / 1x TBE jel hazırlayın. Dökme jeli ve plakayı bir jel standına monte edin, rezervuarları 1x TBE ile doldurun ve 30 dakika boyunca 40 W’ta (veya farklı jel plakalar ve standlar için uygun şekilde) ön çalıştırma yapın. Çökeltilmiş RNA’yı 10 μL formamid jel yükleme tamponunda çözün ve formamid jel yükleme tamponunda 0,5 μM’de reaksiyona girmemiş son etiketli astar hazırlayın. Numuneleri 80 °C’ye ısıtın, numunenin 5 μL’sini her bir kuyucuğa yükleyin ve jeli yaklaşık 40 dakika boyunca 40 W’ta çalıştırın (veya farklı jel plakaları ve standları için uygun olduğu şekilde). Jel plakasını standdan çıkarın ve çapraz kiral L-RNA uzatma ürünlerini görselleştirmek için floresan/fosforesan jel tarayıcı kullanarak tarayın.