オリゴヌクレオチドの化学的三リン酸化

1. 固体支持体上での5′-ヒドロキシルオリゴヌクレオチドの自動固相合成 自動DNA/RNA合成機を試薬およびホスホロアミダイトとともに調製し、標的オリゴヌクレオチド組成および機器の指示に従ってください。 固体支持体を含む合成カラムをシンセサイザーにロードし、シンセサイザーの機器プロトコルに従ってオリゴヌクレオチドを合成する。注:三リン酸化手順は、1μmoleスケールで調製したオリゴヌクレオチド用に最適化されています。 5′-ジメトキシトリチル保護基を除去し、前の工程でオリゴヌクレオチド合成の一部として、または合成器器具のプロトコルに従って末端脱トリチル化工程を行うことによって、固体支持オリゴヌクレオチド5′-ヒドロキシルを得る。 固体支持体上の5′-ヒドロキシルオリゴヌクレオチドを含むカラムをシンセサイザーから取り出し、ハウス真空下で10分間乾燥させて残留溶媒を除去し、トリリン酸化のための材料が調製されたら(セクション3および4)に進む(セクション2)。注:すぐに使用しない場合、乾燥カラムは、-20°Cの乾燥剤を含む密閉プラスチック容器に通常の雰囲気下で保存することができます。 セクション 3 のトリリン酸化の前にカラムが完全に乾燥されるため、この段階ではさらなる乾燥は必要ありません。 2. 三リン酸化材料の準備 圧力調節可能なドライアルゴン源を少なくとも2本のラインでガスマニホールドに取り付け、バブラーに接続します。反応装置への接続を容易にするために、ラインが1mLのプラスチックシリンジで終端していることを確認してください。 1 mL のプラスチックシリンジ、三方ポリプロピレン活栓、ノンコアリング針、1.5 mL ポリプロピレンチューブ、小型金属ヘラなど、三リン酸化時に使用する収集装置。使用前に少なくとも1日間、室温で乾燥剤と一緒に密閉容器またはデシケータに保管してください。 少なくとも1日前に、無水1,4-ジオキサン、3:1ジオキサン:ピリジン、N,N-ジメチルホルムアミド(DMF)、およびアセトニトリル(ACN)を、乾燥トラップ(密閉膜パケット中の4Åモレキュラーシーブ)を備えた乾燥30mLガラス瓶にそれぞれ30mLずつ調製する。ゴムセプタでシールし、乾燥剤を入れたデシケーターに保管してください。 固体2-クロロ-4H-1,3,2-ベンゾジオキサホスホリン-4-オン(サリチルホスホロクロリダイト、SalPCl)を、4°Cで乾燥剤を入れた密閉瓶の中の元の容器に保管してください。 使用の合間には常にコンテナをアルゴンでフラッシュしてください。 トリフェニル化反応の少なくとも5日前にトリブチルアンモニウムピロホスフェート(TBAP)溶液を調製する: 乾燥した30mLガラス瓶に1〜5gの固体TBAPを計量し、TBAP1gあたり1mLのDMFおよび0.5mLのトリブチルアミンに溶解します。 3つの乾燥トラップを追加し、アルゴン下のゴム中隔でボトルを密封し、アルゴンで30分間泡立てて脱気します。 モレキュラーシーブがすべての微量水を吸収できるように、4°Cの乾燥剤を入れた密封瓶の中に5日間保管してください。瓶を-20°Cで保管し、6ヶ月後に新鮮なものを用意してください。 3. 三リン酸化装置の組み立てと使用 -20°Cで貯蔵から取り出す場合は、合成カラムを室温まで昇温させます。 図 2 に示す反応チャンバーを組み立てます。 前室を準備する:乾燥した1mLシリンジからプランジャーを取り外し、はさみまたはカミソリブレードを使用してシリンジの上部を切り取り、シリンジを合成カラムに取り付けます。三方活栓をシリンジの上部に取り付け、活栓の側面入口をバブラーで乾燥アルゴン源に取り付け、活栓の上部入口が試薬注入口になるようにします。 この装置をクランプ付きのスタンドに固定し、すべての上流ジョイントをワックスシーリングフィルムでシールします。活栓を調整して、注入口が閉じ、装置がアルゴン源に対して開かれるようにします。バブラーを閉じ、低圧(<10psi)のアルゴンが反応チャンバ内を5分間流れるようにします。注:複数の反応チャンバは、トリホスホリル酸2〜4オリゴヌクレオチドに並列に設定することができる。ただし、マニホールドからの1本のラインは、試薬ボトルにアルゴンを供給するために予約する必要があります。 バブラーを再度開き、合成カラムの底部にシリンジを取り付けます。廃棄物シリンジを使用してカラムにアルゴンを繰り返し引き出します。次に、プランジャーを完全に押し込んだ状態でシリンジを取り付け直します。メモ: 図2Aに示すように、試薬をロードしない限り、活栓は注入ポートが閉じられ、装置がアルゴン源に対して開くように設定する必要があります。同様に、廃シリンジを取り付け、試薬を積極的に除去しない限り、合成カラムにジョイントをワックス封止フィルムで密封する必要があります。 試薬または溶媒を追加するには: 針を乾燥アルゴン源に取り付け、試薬または溶媒ボトルの隔壁に挿入し、針をボトルの内容物に浸さないように注意してください。 針で乾いたシリンジを組み立て、ボトルの内容物に浸さずに試薬または溶媒ボトルセプタムに挿入します。シリンジをアルゴンで満たし、中隔から針を抜き取り、アルゴンを排出する。シリンジをアルゴンで満たし、再び排出する。次に、アルゴン圧力下で必要な量の溶媒または試薬をシリンジに充填する。 アルゴン源が閉じ、注入ポートが開くように装置の活栓を調整します(図2B)。充填されたシリンジと針をソースボトルから素早く取り出し、針の側面または先端に付着した溶媒を拭き取り、針を注射口に挿入します。試薬を装置の前室に排出し、針を取り外し、注入口を閉じ、アルゴン源に装置を再度開放する。 すべての液体が廃棄物シリンジに保持されるように、廃液シリンジを使用して、前室から合成カラムを通って液体を静かに引き出します。次に、溶液をゆっくりと合成カラムに押し戻し、カラムに気泡がないことを確認します。混合または攪拌するには、廃シリンジで溶液をカラム上で静かに上下に引っ張ります。メモ:液体を反応チャンバ内をゆっくりと穏やかに動かして、シールが破られないようにして、空気が装置に入るようにしてください。 カラムから試薬または溶媒を除去するには: 溶液をゆっくりと廃シリンジに引き込みます。溶液の大部分が廃シリンジに渡されたら、アルゴンを通してカラムから残りの溶媒を洗い流します。 廃シリンジジョイントの周りのワックスシーリングフィルムを取り外し、シリンジを取り外して廃液を捨てます。廃シリンジを新しいドライシリンジに交換し、ワックスシーリングフィルムでジョイントを再シールします。 図2:三リン酸化装置。 混合中または反応中、装置(A)はアルゴン源(i)に対して開放され、三方活栓(ii)を調整することによって空気に対して閉じられる。試薬は、廃棄物シリンジ(v)を用いて前室(iii)から合成カラム(iv)に引き出される。試薬は、すべての液体を廃シリンジ(v)に引き込み、それを廃棄することによって除去される。試薬(B)を装填する場合、三方活栓(ii)は大気に開放され、試薬はシリンジと針(vi)によって前室(iii)に装填される。(C)(A)のように試薬混合反応用に組み立てられた装置の写真。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 4. 合成 5′-ヒドロキシルオリゴヌクレオチドのオンカラムトリリン酸化 SalPClおよびTBAP溶液を-20°Cの保管から取り出し、使用前に室温まで温めるようにします。 200 μLのピリジン/ジオキサンを、ステップ3.3.1-3.3.3に従って前室に加える。ただし、ステップ 4.4 まで合成カラムに溶媒をロードしないでください。 乾燥金属ヘラを使用して、乾燥した1.5mLの微量遠心管に6〜12mgのSalPClを計量し、微量遠心管内で溶媒を上下に静かにシリンディングして100μLのジオキサンに溶解する。 溶解したSalPClを前室に加え、ステップ3.3に従って合成カラムにロードします。15分間反応させ、5分ごとに溶液を攪拌する。手順 3.4 に従って SalPCl ソリューションを取り出し、廃棄します。注:SalPClは大過剰に添加され、調製および反応チャンバへの装填中に吸収された水を捕捉します。しかし、ステップ4.5および4.6の間に水分を導入すると、最終的なオリゴヌクレオチド5′-三リン酸収率が損なわれます。 250 μL の TBAP 溶液を前室に加え、ステップ 3.3 に従って合成カラムにロードします。5分ごとにかき混ぜながら、20分間反応させます。手順 3.4 に従って TBAP ソリューションを取り外して破棄します。 カラムを 0.5 mL の DMF、次いで 0.5 mL の ACN で洗浄し、ステップ 3.3 および 3.4 に従って各添加後に溶媒を除去します。 250 μL の酸化剤溶液 (0.1 M ヨウ素 in テトラヒドロフラン (THF)/ピリジン/水、88:10:2) をアンテチャンバーに加え、ステップ 3.3 に従って合成カラムにロードします。10分ごとに攪拌しながら、30分間反応させます。ステップ3.4に従って酸化剤溶液を取り出して廃棄する。 カラムを 0.5 mL の ACN で洗浄し、ステップ 3.3 および 3.4 に従って除去します。 反応装置を分解します。合成カラムを 5 mL の ACN で洗浄し、カラムを乾燥させます。 5. 固体支持体からの切断、脱保護、精製 乾燥した固体支持樹脂を合成カラムから取り出し、シリコーンOリング付きの1.5mLポリプロピレン製スクリューキャップシールチューブに移します。 28%-30%アンモニア水と40%メチルアミン水溶液(AMA)の1:1混合物1mLに樹脂を懸濁させ、チューブをしっかりと密封します。穏やかに反転39による間欠混合で65°Cで10分間インキュベートする。40 ntより長いオリゴヌクレオチドについては、室温で2時間、より穏やかな処理を使用する。警告: AMA 溶液を加熱すると、チューブに高圧がかかります。チューブがしっかりと密封されていない場合、またはアンモニアと相溶する(シリコーン)Oリングを使用しない場合、チューブはガスを排出したり、溶媒を漏らしたりして、安全性や最終製品の歩留まりを損なう可能性があります。高温のAMA溶液はガスを激しく発生させる可能性があるため、周囲温度を超えている間はチューブを開けないでください。 チューブを氷の上で冷やし、短時間遠心分離します(6,000-12,000 × g を10秒間)。樹脂から上清を取り出し、0.2μmフィルターを備えたシリンジでろ過し、新しい滅菌ポリプロピレンチューブに移します。アンモニア中和化学トラップを取り付けた真空遠心分離機を使用して、溶液を蒸発乾固させる。注:合成オリゴヌクレオチドに2′-シリル保護基を有するRNAヌクレオチドが含まれていない場合は、ステップ5.8に進んでください。 乾燥した材料を1mLの1 Mテトラブチルアンモニウムフルオリド(TBAF)をTHFに溶解し、55°Cに加熱し、必要に応じて振とうしてオリゴヌクレオチドを完全に溶解させ、室温で16〜24時間インキュベートすることによってシリル保護基を除去する40、41。 TBAF溶液を1 mLの1 M Tris緩衝液(pH 7.5)でクエンチし、真空遠心分離機を使用してTHFを除去します。 TBAF塩は、製造元の指示に従って、使い捨てのサイズ除外カラムを使用して除去します。15ntより短いオリゴヌクレオチドについては、溶出液を画分に集めて生成物の溶出を確認し、UV-Vis分光光度計上の260nmの吸光度により主生成物画分を同定する。 脱保護RNAオリゴヌクレオチドを、15nt未満の場合は凍結乾燥または真空遠心分離機によって、または15ntを超える場合はエタノール沈殿によって濃縮する。 オリゴヌクレオチドサイズ、ゲルプレート、およびスタンドの適切なプロトコルに従って、19:1 mono:bisアクリルアミドストックを使用して、分取スケール10%〜20%ポリアクリルアミド/8 M 尿素/1x TBEゲルを調製します。ゲルプレートを1x TBEのリザーバーでゲルスタンドに組み立て、35W(またはゲルプレートフォーマットの場合は適宜)で少なくとも30分間プレランします。 固体オリゴヌクレオチドを尿素ゲルローディングバッファー(8 M 尿素、10% スクロース、50 mM Tris、ブロモフェノールおよびキシレンシアノールランニング色素と共にpH 8、1 mM EDTA)に溶解し、80°Cに加熱する。 ポリアクリルアミドゲルに負荷をかけ、25〜35W(またはゲルプレートフォーマットおよびオリゴヌクレオチドサイズに適したもの)で1〜2時間実行する。注:ブロモフェノールブルーまたはキシレンシアノールは、エタノール沈殿なしで溶出オリゴヌクレオチドからこれらの色素を除去することは困難であるため、どちらかが生成物と共移行する場合、15ntより短いオリゴヌクレオチドのゲルローディングバッファーから除外する必要があります。 ゲル電気泳動が終了したら、ゲルスタンドからゲルプレートを取り外し、ゲルプレートを分解し、ゲルをポリ塩化ビニルフィルムで包みます。254 nm UV光でバックシャドーイングして製品バンドを特定し、カミソリブレードを使用して主要な製品バンドを切除します。 破砕・浸漬法42により切り出したゲルからオリゴヌクレオチドを抽出する。 切り出したゲルをプラスチックシリンジを通して押し出すか、機械的に押し出して粉砕する。 15 ntより長いオリゴヌクレオチドの場合: 3倍量の破砕バッファー(300 mM NaCl、10 mM Tris、pH 8、1 mM EDTA)に、攪拌または振とうしながら少なくとも12時間浸します。 溶液を0.2 μmフィルターを取り付けたシリンジに通して固体ゲル片を除去し、エタノール沈殿によりオリゴヌクレオチドを濃縮する。 15 ntより短いオリゴヌクレオチドの場合: 3倍の量のヌクレアーゼフリーの水を少なくとも12時間、攪拌または振盪しながら溶出する。 0.2 μmフィルターを取り付けたシリンジに溶液を通して固体ゲル片を除去し、凍結乾燥により濃縮する。 ステップ 5.6 のように使い捨てサイズ排除カラムを使用して、残留塩および溶質を除去します。凍結乾燥により濃縮する。 精製トリリン酸化オリゴヌクレオチドを -20 °C で TE バッファー (10 mM Tris、pH 8; 1 mM EDTA) または類似のオリゴヌクレオチド保存バッファーに保存します。 UV-Vis分光光度計を用いて260nmにおける吸光度を測定することによりオリゴヌクレオチドの濃度を求める。注:オリゴヌクレオチドの推定吸光係数は、その5′-リン酸化状態の影響を受けるべきではなく、オリゴヌクレオチド吸光係数計算機を使用してその配列から計算することができる。 質量分析により三リン酸化を検証する。5′-ヒドロキシルオリゴヌクレオチドの質量に対して+239.94Daの期待質量を探します。注:マトリックス支援レーザー脱離/イオン化またはエレクトロスプレーイオン化質量分析(それぞれMALDI-MSまたはESI-MS)は、核酸に最適化されたプロトコルを使用する場合、オリゴヌクレオチドの三リン酸化状態を特定するのに適しています。しかし、ESI-MSはイオンフラグメンテーションの速度が低いため、より一貫した結果を提供します。代表的な商用サービスは、 材料表で提供されています。 6. リボザイムの自己複製の基質としてのトリリン酸化オリゴヌクレオチド 警告: 32P は放射性同位元素であり、実験室で放射性物質を扱うための標準的な安全プロトコルを使用して、および関連する環境安全衛生部門によって放射性物質の使用が認定された研究者によって、次の手順を実行する必要があります。代替として、自己複製リボザイム基質Aを、5’−フルオレセイン標識14 を用いて合成的に調製し、ステップ7.9のように蛍光で画像化することができる。 溶液Aを、自己複製子リボザイムEおよび5′-32P標識RNA基質A14の混合物として、それぞれ0.30μMおよび30μMの濃度に調製する。75 mM EPPS緩衝液、pH 8.5、および37.5MgCl2中で、それぞれ上記のようにインビトロ転写14または化学的トリリン酸化によって調製した、15 μMトリリン酸化RNA基質Bを用いてB転写およびB合成した溶液を調製する。両方の溶液を42°Cにしてください。注: すべての RNA コンポーネントは、 材料表に記載されています。 自己複製を開始するには、5 μL の A 溶液と、転写または B 合成の 10 μL を終濃度 0.1 μM E、10 μM A、10 μM B、25 mM MgCl2、および 50 mM EPPS バッファー pH 8.5 に迅速に混合します。反応混合物を42°Cでインキュベートする。 一定の間隔で、0.5 μL のアリコートを取り、9.5 μL のホルムアミドゲルローディングバッファー (95% ホルムアミド; 10 mM EDTA、pH 8) でクエンチします。 分析用ポリアクリルアミド/8 M 尿素/1x TBEゲルを、ゲルプレートおよびスタンドの適切なプロトコールに従って調製します。キャストゲルとプレートをゲルスタンドに組み立て、リザーバを1x TBEで満たし、40W(または異なるゲルプレートとスタンドに適宜)で30分間プリランします。 クエンチした反応サンプルを80°Cに加熱し、各ウェルに5 μLのサンプルを負荷し、ゲルを40 Wで約40分間(または異なるゲルプレートおよびスタンドに適宜)実行します。 ゲルスタンドからゲルプレートを取り出し、分解し、ゲルをポリ塩化ビニルフィルムで包みます。ゲルを蛍光体スクリーンで覆い、1時間(または 32Pcpmの場合)露光する。蛍光/燐光ゲルスキャナーを使用して画面をスキャンします。 ゲル画像定量ソフトを用いて反応収率を定量する。 分析ツールボックスを使用してゲル画像を開き、[分析|[形状定義]で、[長方形の形状|領域]を選択し、各時間および両方の反応について、未反応Aと生成物Eに対応するバンドの周りに同じサイズの長方形を描画します。 分析|の選択背景減算で、長方形の形状|領域を選択し、ゲル画像の空の部分に同じサイズの長方形を描画します。すべての四角形の背景減算方法を [画像四角形] に変更します。 「ウィンドウ」|「2領域ウィンドウ」を選択し、「|を編集」を選択します。Excelにエクスポートして、定量化されたバンドピクセルボリュームをスプレッドシートファイルにエクスポートします。 時間に対する製品Eの濃度をプロットし、統計データフィッティングソフトウェアを使用してデータをロジスティック成長Eq(1)に当てはめます。[E] = (1)ここで、a は反応最大程度、b はシグモイディシティの程度、c は指数関数的成長速度です。 エクスポートされたスプレッドシートで、生成物 E 体積を基質 A と生成物 E 体積の合計で除算し、各時間および両方の反応の生成物の分数収率を決定します。基質Aの初期濃度(10 μM)を掛けて、生成物Eの収率を時間の関数として求めます。 統計データフィッティングソフトウェアで、[ファイル|] を選択します。新|新しいプロジェクト ファイル、[新しいテーブルとグラフ] の下の [XY] を選択して、[作成] をクリックします。隣接するカラム、およびラベルカラムに対応する両方の反応の反応時間と生成物E収率を入力します(例えば、「時間」、「転写B」、「合成B」)。 [|の挿入] を選択します。[新しい解析]、[XY解析]|選択非線形回帰 (カーブフィット) をクリックし、「OK」をクリックします。成長曲線|を選択ロジスティック成長をクリックし、「OK」をクリックします。他のパラメータは調整しないでください。結果の下の適合パラメータと信頼区間を、グラフの下のデータ点と適合曲線のプロットを観察します。 7. L-RNAのクロスキラルコピー 20 μM D-RNA 27.3t クロスキラルポリメラーゼ、2 μM 5′-フルオレセイン標識 L-RNA プライマー、4 μM ビオチン化 L-RNA ハンマーヘッド テンプレート、および 20 μM の L-RNA pppCUG、pppAUG、pppAGG、および pppCGC の各 20 μM を含む RNA 溶液 10 μL を、50 mM Tris、pH 8.3 の 10 μL で調製します。RNA を 90 °C に 1 分間加熱し、PCR サーモサイクラーで 0.2 °C/s で 23 °C まで冷却してアニーリングします。ポリメラーゼ、プライマー、およびテンプレートの詳細については、 材料表 を参照してください。 RNA 溶液を 17 °C でインキュベートし、10 μL の 2x 開始バッファー (400 mM MgCl2、500 mM NaCl、および 50 mM Tris、pH 8.3) を加えて反応を開始します。反応のすべての成分の最終濃度が、10 μM ポリメラーゼ、1 μM プライマー、2 μM テンプレート、10 μM 各トリヌクレオチド 5′-三リン酸、200 mM MgCl2、250 mM NaCl、および 50 mM トリス、pH 8.3 であることを確認します。 反応が進行するにつれて、10 μLのアリコートを取り、5 μLの0.5 M EDTA、pH 8でクエンチする。 クエンチした各反応サンプルに、0.05%中性洗剤を含むTEバッファー中の1 M NaCl 10 μLに懸濁した0.1 mgのストレプトアビジン被覆磁気ビーズ(20 pmolビオチン-オリゴヌクレオチド結合能)を加え、ビオチン化テンプレート を介して 3量体延長プライマーを捕捉し、振とうしながら室温で30分間インキュベートします。 ビーズをビーズ捕捉磁石に捕捉し、液体を除去して廃棄し、50 μL の洗浄液 (0.05% 中性洗剤を含む TE 中の 250 mM NaCl) を加えます。ビーズを混ぜ合わせ、もう一度捕まえて、洗浄液を取り除きます。もう一度繰り返します。 ビーズから伸長プライマーを溶出するには、50 μL の溶出溶液 (0.05% 中性洗剤を含む 25 mM NaOH) を加え、ビーズを混合します。ビーズを再回収し、溶出溶液を除去し、100mMトリス(pH7.5)でクエンチし、エタノールで沈殿させた。 分析用ポリアクリルアミド/8 M 尿素/1x TBEゲルを、ゲルプレートおよびスタンドの適切なプロトコールに従って調製します。キャストゲルとプレートをゲルスタンドに組み立て、リザーバを1x TBEで満たし、40W(または異なるゲルプレートとスタンドに適宜)で30分間プリランします。 沈殿したRNAを10 μLのホルムアミドゲルローディングバッファーに溶解し、ホルムアミドゲルローディングバッファーに0.5 μMで未反応末端標識プライマーを調製した。サンプルを80°Cに加熱し、各ウェルにサンプルの5μLを負荷し、ゲルを40Wで約40分間(または異なるゲルプレートおよびスタンドに適宜)流す。 ゲルプレートをスタンドから取り出し、蛍光/燐光ゲルスキャナーを使用してスキャンし、クロスキラルL-RNA伸長生成物を視覚化します。