الفسفرة الثلاثية الكيميائية لأوليغونوكليوتيدات
Summary
Oligonucleotide 5′-triphosphates هي مكونات في كل مكان في المسارات البيولوجية الأساسية وشهدت استخداما متزايدا في تطبيقات التكنولوجيا الحيوية. هنا ، نصف تقنيات التوليف الروتيني وتنقية oligonucleotide 5′-triphosphates ، بدءا من oligonucleotides التي أعدتها تقنيات التوليف الآلي القياسية.
Abstract
ال 5′-triphosphate هو تعديل أساسي للحمض النووي موجود طوال الحياة ويستخدم بشكل متزايد كتعديل وظيفي للأوليغونوكليوتيدات في التكنولوجيا الحيوية والبيولوجيا التركيبية. تم تحضير Oligonucleotide 5′-triphosphates تاريخيا في المختبر بطرق إنزيمية. ومع ذلك ، تقتصر هذه الطرق على أوليغونوكليوتيدات الحمض النووي الريبي الطبيعية ، ولها تفضيلات تسلسل قوية ، وتميل إلى إنتاج منتجات غير متجانسة. تكمل الطرق الجديدة للفسفرة الثلاثية الكيميائية كلا من التكلفة المخفضة لتخليق أوليغونوكليوتيد الآلي بواسطة كيمياء الفوسفوراميديت ومجموعة متنوعة من تعديلات النيوكليوتيدات المتاحة الآن. وبالتالي ، فإن تخليق ثلاثي فوسفات oligonucleotide من التسلسل والطول التعسفيين ، والذي يحتوي اختياريا على تعديلات غير طبيعية مختلفة ، أصبح الآن متاحا الآن.
تعرض هذه الورقة الطرق والتقنيات المناسبة للفسفرة الثلاثية الكيميائية للأوليغونوكليوتيدات باستخدام فوسفوروكلوريد الساليسيل والبيروفوسفات. تستخدم هذه الطريقة الكواشف المتاحة تجاريا ، وهي متوافقة مع معظم النوكليوتيدات القليلة التي يتم إعدادها بواسطة طرق توليف الطور الصلب القياسية ، ويمكن إكمالها في 2 ساعة بعد تخليق oligonucleotide ، قبل إزالة الحماية والتنقية. تم توضيح استخدامين لأوليغونوكليوتيدات ثلاثي الفوسفوريلات كيميائيا كركائز لإنزيمات الحمض النووي الريبي الحفازة ، بما في ذلك تخليق نسخة صورة طبق الأصل من ريبوزيم رأس المطرقة من ثلاثي الفوسفات L-RNA غير البيولوجي.
Introduction
شكل 5′-triphosphorylated من الحمض النووي الريبي هو في كل مكان في علم الأحياء كما يتم إنشاؤه عن طريق نسخ الحمض النووي الريبي في جميع مجالات الحياة وعن طريق تكرار الحمض النووي الريبي خلال دورة حياة العديد من فيروسات الحمض النووي الريبي. هذه التريفوسفات بمثابة الركيزة لتشكيل mRNA 7-methylguanylate المغطاة في حقيقيات النوى ، وبالتالي ، تلعب دورا أساسيا في التعبير عن البروتين1. في المقابل ، يتم الاحتفاظ بالفوسفات الثلاثي في البكتيريا والفيروسات. وبالتالي ، يتم التعرف على الحمض النووي الريبي 5 ′ ثلاثي الفوسفات من قبل منظمي الاستجابة للمناعة الفطرية في حقيقيات النوى2،3،4،5،6،7. خارج علم الأحياء ، تم تطوير مجموعة من ريبوزيمات الحمض النووي الريبي ليغاز لاستخدام 5 ′ ثلاثي الفوسفات في المختبر8 وتعديلها للاستخدام في الفحوصات التشخيصية9،10،11،12،13،14،15. يمكن استخدام أحد هذه الإنزيمات الريبوزية للتخليق المعتمد على القالب ل L-RNA ، وهو enantiomer “صورة مرآة” غير بيولوجي ل D-RNA الطبيعي ، من قليل النوكليوتيد L-RNA 5 ′ – ثلاثي الفوسفات16،17،18. يعد التحضير الروتيني لأوليغونوكليوتيدات ثلاثي الفوسفوريلات ذات التسلسل المختلف وتكوين العمود الفقري أمرا ضروريا للتحقيق في هذه الأنظمة.
الطريقة الأكثر شيوعا والتي يمكن الوصول إليها لإعداد الحمض النووي الريبي 5′-ثلاثي الفوسفات في المختبر هي عن طريق النسخ في المختبر. ومع ذلك ، فإن الحمض النووي الريبي الذي تنتجه هذه الطريقة مقيد في التسلسل والحجم حسب متطلبات المروج والركيزة لإنزيم بوليميراز الحمض النووي الريبي. بوليميراز الحمض النووي الريبي T7 ومشتقاته المتخصصة هي البوليميراز الأكثر شيوعا المستخدمة لهذا الغرض19،20،21،22. يجب أن يبدأ الحمض النووي الريبي المنسوخ في المختبر المحضر بهذه الإنزيمات باستخدام البيورين المكون من 5 أطراف وهو منحاز بشدة نحو البيورينات في أول 10 نيوكليوتيدات23,24. علاوة على ذلك ، فإن الدمج الأنزيمي للنيوكليوتيدات المعدلة بالقاعدة أو العمود الفقري غير فعال في أحسن الأحوال وغالبا ما يكون مستحيلا مع البوليميراز الطبيعي ، مما يحد من فرصة إنتاج أوليغونوكليوتيد 5 ′ ثلاثي الفوسفات يتكون من أي شيء باستثناء الحمض النووي الريبي D-RNA الطبيعي. عامل آخر مقيد هو أن الحمض النووي الريبي الناتج عن النسخ في المختبر يمكن أن يحتوي على عدم تجانس كبير 5 و 3 ويتم إنتاجه كمنتجات غير متجانسة للغاية عندما يكون أقصر من 20 nt 23,24,25,26,27.
في المقابل، يمكن استخدام الفسفرة الثلاثية الكيميائية لأوليغونوكليوتيدات المحضرة بواسطة تخليق الفوسفوراميديت ذي الطور الصلب28،29،30،31،32،33،34،35 لإعداد أوليغونوكليوتيد 5 ′-ثلاثي الفوسفات 3-50 نانوت طويلة، من أي تسلسل. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن إضافة مجموعة واسعة من تعديلات الحمض النووي التي يمكن الوصول إليها لتخليق الفوسفوراميديت إلى oligonucleotides قبل 5′-triphosphorylation 14,15,16,17,18,29,36. تستخدم العديد من هذه الطرق كاشف الفوسفيتيل ساليسيل فوسفوروكلوريديت ، الذي طوره لودفيغ وإيكشتاين لمرحلة الحل ثلاثية الفسفرة من أحادي النوكليوسيدات37. يتم تحقيق الفسفرة الثلاثية للأوليغونوكليوتيدات مع هذا الكاشف في المرحلة الصلبة عن طريق فوسفيتيل أوليغونوكليوتيد 5′-هيدروكسيل ، وتحويله إلى ثلاثي الفوسفات عن طريق التفاعل مع بيروفوسفات والأكسدة ، تليها الإجراءات القياسية لانقسام أوليغونوكليوتيد من الدعم الصلب ، وإزالة الحماية ، والتنقية (الشكل 1) 28.
الشكل 1: مخطط للفسفرة الثلاثية للأوليغونوكليوتيدات الاصطناعية. في الخطوة الأولى ، يتم فوسفيتيل oligonucleotide 5ʹ-hydroxyl مع SalPCl. في الخطوة التالية ، يتم تفاعل فوسفيت 5ʹ-salicyl مع TBAP لتشكيل metaphosphite الدوري ، ثم في الخطوة الثالثة يتأكسد لتوليد الفوسفات الدوري 5ʹ-trimetametasphate في محلول أكسدة مركب الحمض النووي / الحمض النووي الريبي (0.1 M Iodine / pyridine / H2O / THF) ، والذي يتم تحلله بسرعة لإنتاج الخطي 5ʹ-triphosphate في نفس المحلول28,33 ، 37. سيؤدي الانقسام القلوي اللاحق من دعم CPG الصلب وإزالة الحماية من oligonucleotide في MeNH2 / الأمونيا المائية إلى تحلل أي ثلاثي ميتافوسفات دوري متبقي إلى الشكل الخطي. الاختصارات: SalPCl = ساليسيل فوسفوروكلوريديت; TBAP = ثلاثي التيلامونيوم بيروفوسفات; THF = رباعي هيدروفوران. CPG = زجاج المسام الذي يتم التحكم فيه ؛ MeNH2 = ميثيل أمين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
على الرغم من أن التقارير المنشورة في وقت مبكر باستخدام هذه الطريقة غالبا ما عانت من ضعف الغلة والمنتجات الجانبية غير المرغوب فيها28،37،38 ، إلا أن الصيانة الدقيقة للظروف اللامائية هي كل ما هو ضروري للحصول على غلات عالية بشكل روتيني. يمكن تحقيق ذلك عن طريق التحضير الدقيق للكواشف واستخدام جهاز تفاعل بسيط يتم تجميعه من مكونات بلاستيكية قياسية. هنا ، نوضح الخطوات المناسبة للفسفرة الثلاثية الكيميائية للأوليغونوكليوتيدات ، بما في ذلك تحضير الكواشف ، وتجميع غرفة التفاعل ، وتفاعل الفسفرة الثلاثية ، وإزالة الحماية والتنقية اللاحقة من أوليغونوكليوتيدات ثلاثي الفوسفوريلات. ويشمل أيضا الاستخدام التمثيلي ل 5′-triphosphorylated oligonucleotides كركائز لريبوزيمات الليغاز لتخليق منتجات الأحماض النووية الأكبر مع الحمض النووي الريبي D-RNA الطبيعي والعمود الفقري L-RNA اللاأحيائي.
Protocol
Representative Results
Discussion
إجراء الفسفرة الثلاثية الموصوف هنا متوافق على نطاق واسع مع تخليق أوليغونوكليوتيد باستخدام كيمياء الفوسفوراميديت القياسية. يجب أن تحتوي الفوسفوراميدات النيوكليوزيدية على مجموعات حماية أساسية متوافقة مع إزالة الحماية السريعة في AMA39 ، بما في ذلك مجموعات β-cyanoethyl القياسية على الفوسفيت ، والأيزوبوتيريل ، أو ثنائي ميثيل فورماميديل ، أو الأسيتيل ، أو فينوكسي أسيتيل ، أو 4-isopropylphenoxyacetyl على الأمينات الخارجية الحلقية للقواعد النووية. يجب حماية مجموعات الريبوز 2′-هيدروكسيل بواسطة مجموعات حماية سيليل ، إما t-butyldimethylsilyl (TBDMS) أو tri-iso-propylsilyloxymethyl (TOM) 40,41. كما تم الإبلاغ عن أن مجموعة pivaloyloxymethyl (PivOM) ذات الأساس الشفوي متوافقة مع الفسفرة الثلاثية الكيميائية30.
تم وصف طرق متعددة للفسفرة الثلاثية الكيميائية لأوليغونوكليوتيدات قليلة النوكليوتيدات الاصطناعية28،29،30،31،32،33،34،35. لقد وجدنا أن الفسفرة الثلاثية باستخدام كاشف Ludwig-Eckstein37 هي واحدة من أكثر الكواشف التي يمكن الوصول إليها ، ولا تتطلب أي توليف متخصص للكواشف ولا معدات متخصصة. تم استخدام Oligonucleotide 5′-triphosphates المحضر بهذه الطريقة بشكل روتيني كركائز لريبوزيمات RNA ligase ، بما في ذلك استخدام ثلاثي فوسفات L-RNA oligonucleotide ثلاثي الفوسفات الذي يتعذر الوصول إليه إنزيميا لتحقيق التوليف المعتمد على القالب وتكرار هذا الحمض النووي “الصورة المرآة”14,16,17,18 . هذه الطريقة مناسبة أيضا لإعداد الحمض النووي الريبي الصغير ذو الحلقة الجذعية 5 ′ ثلاثي الفوسفوريلات التي تعد منشطات قوية للاستجابة المناعية الفطرية في الفقاريات 6,7.
كاشف لودفيغ-إيكشتاين ، ساليسيل فوسفوروكلوريديت37 ، يتفاعل بشكل كبير مع الماء ، ويزيل بشكل فعال أي ماء يتم إدخاله عند إذابة الكاشف قبل تحميله على عمود أوليغونوكليوتيد. بعد هذه النقطة ، ومع ذلك ، فإن oligonucleotide 5 ′ الفوسفيتيل سوف يتفاعل بشكل تفضيلي مع أي ماء يتم إدخاله في النظام على pyrophosphate ، مما يشكل منتجا جانبيا 5′-H-phosphonate بعد العمل28,37,38. يضمن التحضير الدقيق لكواشف الفسفرة الثلاثية وغرفة تفاعل الفسفرة الثلاثية عدم تكوين هذا المنتج الجانبي. لتجفيف المذيبات ، تباع المناخل الجزيئية من النوع 4 Å معبأة مسبقا في أكياس تفلون متوافقة مع معظم المذيبات العضوية تحت أسماء تجارية مختلفة من قبل معظم شركات كاشف توليف أوليغونوكليوتيدات. الاحتياطات الإضافية ، مثل إجراء الفسفرة الثلاثية في صندوق قفازات تحت جو لا مائي ، ليست ضرورية بشكل عام.
يشكل تفاعل أوليغونوكليوتيد 5′-فوسفيتيل مع TBAP وسيطا دوريا 5′-trimetaphosphite ، والذي يتأكسد بعد ذلك إلى 5′-trimetametaphosphate الدوري باستخدام محلول مؤكسد توليف oligonucleotide (اليود في الماء / البيريدين / THF). تجدر الإشارة إلى أن محاليل المؤكسدات التجارية تستخدم كميات متفاوتة من اليود ، ومن الضروري استخدام تركيز اليود العالي 0.1 M لضمان الأكسدة الكاملة لثلاثي الفوسفات. يتم تحلل المنتج الدوري إلى الخيط الخطي النهائي 5′-triphosphate في نفس المحلول37 ، ويجب استخدام محاليل المؤكسدة اللامائية البديلة إذا كان الخطية مع النيوكليوفيلات بخلاف الماء مطلوبة (انظر أدناه للتطبيقات)33. ومع ذلك ، فإن أي ثلاثي ميتافوسفات دوري متبق ، سيتم خطيه أثناء إزالة الحماية القلوية اللاحقة من oligonucleotide. التحلل المائي للثلاثي فوسفات الدوري 5′-trimetasphate لا ينتج عنه سوى ثلاثي الفوسفات الخطي بدلا من ثلاثي الفوسفات المتفرع 37,46.
لا تحتاج إزالة الحماية من أوليغونوكليوتيد عادة إلى تعديل لاستيعاب 5 ′-triphosphorylation ، ولكن يجب اتخاذ بعض الاحتياطات. الثلاثي الفوسفات مستقر نسبيا للتعرض لفترة وجيزة للظروف القلوية ، ولكن يجب توخي الحذر لعدم تعريض ثلاثي الفوسفات ل AMA لفترة أطول من اللازم. يجب تجنب حماية المجموعات التي تتطلب علاجا مطولا في الأمونيا أو AMA لأكثر من 10 دقائق عند 65 درجة مئوية. العلاجات الأكثر لطفا ، مثل 2 ساعة في الأمونيا في درجة حرارة الغرفة مقبولة عندما تكون متوافقة مع مجموعات حماية الفوسفوراميديت الأخرى. تستخدم طريقة شائعة وسريعة لإزالة الحماية من الحمض النووي الريبي الاصطناعي oligonucleotides المحمية من السيليل ثلاثي إيثيلامين ثلاثي هيدروفلوريد ودرجة حرارة عالية47 ؛ ومع ذلك ، ينبغي تجنب ذلك عند تحضير الحمض النووي الريبي 5 ′ ثلاثي الفوسفات حيث تم العثور على الظروف الحمضية المطولة لتسريع التحلل المائي ثلاثي الفوسفات31,32.
وقد أثبتت الصفحة التحضيرية أنها الطريقة الأبسط والأكثر موثوقية لتنقية أوليغونوكليوتيدات 5 ثلاثي الفوسفوريلات بعد الحماية (الشكل 3 والشكل 4). ومع ذلك ، يمكن أيضا استخدام HPLC في المرحلة العكسية التحضيرية لتنقية المنتجات ثلاثية الفوسفوريلات. ويلاحظ وجود 5′-ثنائي الفوسفات، وبدرجة أقل، منتجات 5′-monophosphate بشكل روتيني عند التحقق من الفسفرة الثلاثية عن طريق قياس الطيف الكتلي. لقد لاحظنا تفتيت 5 ′ ثلاثي الفوسفات أثناء قياس الطيف الكتلي من مواد عالية النقاء يتم إعدادها عن طريق التوليف الكيميائي أو النسخ ، خاصة إذا لم يتم تحسين الأداة لتحليل oligonucleotides. ومع ذلك ، غالبا ما يظهر تحليل RP-LC أن 10٪ -20٪ من المنتج الجانبي 5 ′ ثنائي الفوسفات موجود في أوليغونوكليوتيدات أطول 5 ′ ثلاثي الفوسفور (الشكل 4). يمكن أن تكون المستحضرات التجارية لبيروفوسفات تريبوتيلامونيوم ملوثة بما يصل إلى 20٪ أحادي الفوسفات ، مما سيؤدي إلى 5 ′-diphosphate كمنتج جانبي أثناء الفسفرة الثلاثية30,31. يمكن أن يؤدي الإعداد الدقيق لهذا الكاشف في المنزل إلى إنتاج مخزون TBAP أكثر نقاء31. ومع ذلك ، فقد وجدنا أن oligonucleotides triphosphorylated باستخدام مصادر تجارية من TBAP لا تزال تظهر تفاعلا مماثلا أو أكبر عند استخدامها كركائز في التفاعلات الأنزيمية (الشكل 5B) ، مقارنة بالمواد التي يتم إعدادها بواسطة النسخ في المختبر.
أحد الاستخدامات الأخرى البارزة لفسفرة أوليغونوكليوتيد ثلاثية الفسفرة مع كاشف لودفيغ-إيكشتاين يستفيد من ثلاثي الميتافوسفيت الدوري الوسيط33. إذا تم إجراء خطوة الأكسدة اللاحقة باستخدام بيروكسيد 1 M t-butyl في الهكسانات ، والذي يستخدم غالبا لأكسدة oligonucleotide في ظل الظروف اللامائية ، تحدث أكسدة الفوسفيت دون التحلل المائي لفتح الحلقة ، مما يؤدي إلى ثلاثي ميتافوسفات دوري. يمكن بعد ذلك تفاعل هذا الوسيط مع الأمين الأولي أو نيوكليوفيلات الكحول لإنتاج 5 ′ ثلاثي الفوسفات مع تعديلات في γ الفوسفات. وتشمل هذه التعديلات إضافة علامة محبة للدهون مرتبطة برابطة فوسفوراميدات ، مما يسهل التنقية السريعة الخاصة بثلاثي الفوسفات بواسطة RP-LC ، تليها التحلل المائي الحمضي للعلامة من ثلاثي الفوسفات33. يمكن أيضا إدخال تعديلات الفلورسنت في موقع γ الفوسفات لاستخدامها كمراسلين فلورسنت في الوقت الفعلي لتفاعلات الربط المحفزة بالريبوزيم15,33.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
المؤلفون ممتنون لجريج سبرينجستين وناتاشا بول وتشارلز أوليا جونيور وجوناثان شيبانسكي وكاترينا تجونج على المناقشات المفيدة حول أفضل الممارسات لتفاعلات الفسفرة الثلاثية الكيميائية ولجيرالد جويس على التعليقات المفيدة. تم دعم هذا العمل من خلال منحة MCB 2114588 من المؤسسة الوطنية للعلوم.
Materials
| 0.22 µm polyethersulfone syringe filter | MilliporeSigma | SLMP025SS | Syringe filter for removing crushed polyacrylamide gel particles (Section 5) |
| 0.22 µm PTFE syringe filter | MilliporeSigma | SLLG013SL | Syringe filter for removing CPG resin (Section 5) |
| 1 mL plastic syringes | ThermoFisher Scientific | 14-823-434 (BD 309659) | Components of triphosphorylation apparatus (sections 2–4) |
| 1,4-Dioxane, anhydrous | MilliporeSigma | 296309 | Triphosphorylation solvent (sections 2–4) |
| 2-Chloro-4H-1,3,2-benzodioxaphosphorin-4-one, Salicyl Phosphorochloridite (SalPCl) | MilliporeSigma | 324124 | Triphosphorylation reagent (sections 2–4) |
| 30 mL glass bottles | MilliporeSigma | 23232 | Bottles for preparing triphosphorylation solvents and TBAP solution (section 2) |
| 3-way Stopcock, polycarbonate/polypropylene | Bio-Rad Laboratories | 7328103 | Component of triphosphorylation apparatus (sections 2–4) |
| 40% acrylamide/bis-acrylamide solution, 19:1 | Bio-Rad Laboratories | 1610144 | For PAGE (sections 5–7) |
| Acetonitrile, anhydrous, 100 mL | Glen Research | 40-4050-50 | Triphosphorylation solvent (sections 2–4) |
| Ammonia-neutralizing Trap | ThermoFisher Scientific | ANT100 and ANS121 | For use with Speedvac DNA130 (section 5) |
| Ammonium persulfate (APS) | Bio-Rad Laboratories | 1610700 | For PAGE, catalyst for acrylamide polymerization (sections 5–7) |
| Aqueous ammonia, 28% | MilliporeSigma | 338818 | For preparing AMA deprotection reagent (section 5) |
| Aqueous methylamine, 40% | TCI America | TCI-M0137 | For preparing AMA deprotection reagent (section 5) |
| Automated DNA/RNA oligonucleotide synthesizer | PerSeptive Biosystems | Expedite 8909 DNA/RNA Synthesizer | any column-based synthesizer is acceptable (section 1) |
| Bead-capture magnet | ThermoFisher Scientific | 12320D | For streptavidin bead capture (section 7) |
| Bromophenol blue | Bio-Rad Laboratories | 1610404 | For PAGE urea loading buffer (section 5) |
| Deep vacuum oil pump | ThermoFisher Scientific | VLP200-115 | For use with lyophilizer (section 5) |
| Drierite dessicant, 10-20 mesh | MilliporeSigma | 737828 | Desiccant for storing triphosphorylation chemicals and equipment (sections 1–2) |
| D-RNA 27.3t cross-chiral polymerase | prepared in house18 | 5′-GGUGGUGGAC GUGAUCAUUA CGGAUCACUA ACUCGUCAGU GCAUUGAGAA GGAGAAUAAA AUGCACAUAG GUCGAAAGAC CUUAUACAAG AACUGUAUCA CCGGAGGGCG AGCACCACC-3′ | For cross-chiral ribozyme reactions (section 7) |
| D-RNA CPG solid supports, 1,000Å, prepackaged 1 µmole synthesis columns | Glen Research | 20-3404-41E, 20-3415-41E, 20-3424-41E, 20-3430-41E | representative, for D-RNA oligonucleotide synthesis (section 1) |
| D-RNA TOM-protected phosphoramidites | ChemGenes | ANP-3201, 3202, 3203, 3205 | representative, for D-RNA oligonucleotide synthesis (section 1) |
| Empty Expedite Synthesis Columns, 1µm | Glen Research | 20-0021-01 | Synthesis columns for use with Expedite DNA/RNA synthesizer (section 1) |
| EPPS, N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(3-propanesulfonic acid), solid | MilliporeSigma | E1894 | Ribozyme reaction buffer component (section 6) |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), solid | MilliporeSigma | EDS | Divalent metal ion chelator for use in various buffers (sections 5–7) |
| Filters for Expedite synthesis columns | Glen Research | 20-0021-0F | Expedite-style synthesis column filters, for use with empty synthesis columns (section 1) |
| Fluorescent/phosphorescent gel scanner | Cytiva | Amersham Typhoon RGB, 29187193 | For visualizing analytical PAGE (sections 6–7) |
| Formamide, deionized | VWR Life Science | 97062 | For PAGE formamide gel loading buffer (sections 6–7) |
| Gel image quantitation software | Cytiva | ImageQuant TL | For quantifying scanned gel images (section 6) |
| Glass desiccator | MilliporeSigma | CLS3121150 | Triphosphorylation solvent storage (section 2) |
| L-RNA CPG solid supports, 1,000Å, bulk | ChemGenes | N-4691-10, N-4692-10, N-4693-10, N-4694-10 | L-RNA oligonucleotide synthesis (section 1) |
| L-RNA hammerhead template | prepared in house18 | 5′-GCGCCUCAUC AGUCGAGCC-3′ | For cross-chiral ribozyme reactions (section 7) |
| L-RNA primer | prepared in house18 | 5′-fluorescein-GGCUCGA-3′ | For cross-chiral ribozyme reactions (section 7) |
| L-RNA TOM-protected phosphoramidites | ChemGenes | OP ANP-5201, 5202, 5203, 5205 | L-RNA oligonucleotide synthesis (section 1) |
| Lyophilizer/Freeze Dryer | VirTis | Benchtop K | For concentrating oligonucleotides (section 5) |
| Magnesium Chloride Hexahydrate, solid | MilliporeSigma | M2670 | For ribozyme reactions (sections 6–7) |
| N,N-Dimethylformamide, anhydrous | MilliporeSigma | 227056 | Triphosphorylation solvent (section 2) |
| NAP-25 Desalting column (Sephadex G-25 resin) | ThermoFisher Scientific | 45000150 | Disposable gravity-flow size exclusion chromatography columns containing Sephadex G-25 resin (section 5) |
| Non-coring stainless steel needle, 20 G | ThermoFisher Scientific | 14-815-410 | Needles for piercing rubber septa (sections 2–4) |
| Oligonucleotide extinction coefficient calculator | Integrated DNA Technologies | OligoAnalyzer Tool | Nearest-Neighbor Model Short Oligonucleotide 260nm extinction coefficient calculator (section 5) |
| Oxidizer solution, 0.1 M Iodine in THF/pyridine/water | ChemGenes | RN-1456 | Triphosphorylation reagent (section 4) |
| PAGE plates | Timberrock/CBS | NGP-250-BO and NO | For PAGE (sections 5–7) |
| PAGE power supply | Bio-Rad Laboratories | PowerPac HV 1645056 | For PAGE (sections 5–7) |
| PAGE spacers and combs (analytical) | Timberrock/CBS | VGS-0725 and VGC-0714 | For PAGE (sections 6–7) |
| PAGE spacers and combs (preparative) | Timberrock/CBS | VGS-3025R and VGC-3001 | For PAGE (section 5) |
| PAGE stand | Timberrock/CBS | ASG-250 | For PAGE (sections 5–7) |
| Parafilm M | ThermoFisher Scientific | 13-374-12 (Bemis PM999) | Wax sealing film for triphosphorylation apparatus (sections 2–4) |
| PCR thermocycler | Bio-Rad Laboratories | C1000 Touch Thermalcycler | For cross-chiral ribozyme reactions (section 7) |
| PD 10 Desalting column (Sephadex G-10 resin) | MilliporeSigma | GE17-0010-01 | Disposable gravity-flow size exclusion chromatography columns containing Sephadex G-10 resin, for oligonucleotides < 15 nt (section 5) |
| Phosphor screens | Cytiva | 28956480 | For visualizing 32P-labeled RNA (section 6) |
| Phosphoramidite synthesis reagents | Glen Research | 30-3142-52, 40-4050-53, 40-4012-52, 40-4122-52, 40-4132-52, 40-4060-62 | representative, for standard RNA/DNA synthesis (section 1) |
| Polypropylene screw-cap sealable tube | MilliporeSigma | BR780752 | 1.5 mL microcentrifuge tubes with screw-cap and silicone O-ring, for safe AMA deprotection (section 5) |
| Pyridine, anhydrous | MilliporeSigma | 270970 | Triphosphorylation solvent (section 2) |
| Reverse-phase liquid chromatography/electrospray ionization mass spectrometry (RP-LC/ESI-MS) | Novatia | n/a | Commercial service for LC/MS specializing in oligonucleotides (section 5) |
| Rubber Septa (ID x OD 7.9 mm x 14 mm), white | MilliporeSigma | Z564702 | Septa for preparing triphosphorylation solvents and TBAP (section 2) |
| Self-replicator ribozyme E | prepared in house14 | 5′-GGAAGUUGUG CUCGAUUGUU ACGUAAGUAA CAGUUUGAAU GGUUGAAGUA UGAGACCGCA ACUUA-3′ | For self-replicator ribozyme reactions (section 6) |
| Self-replicator substrate A | prepared in house14 | 5′-32P-GGAAGUUGUG CUCGAUUGUU ACGUAAGUAA CAGUUUGAAU GGUUGAAGUA U-3′-OH | For self-replicator ribozyme reactions (section 6) |
| Self-replicator substrate B, transcribed | prepared in house14 | 5′-pppGAGACCGCAA CUUA-3′ | For self-replicator ribozyme reactions (section 6) |
| Small Drying Traps, 4 Å molecular sieves | ChemGenes | DMT-1975 | Drying traps for DNA/RNA synthesizer phosphoramidites and triphosphorylation reagents (sections 1–2) |
| Sodium Chloride (NaCl), solid | MilliporeSigma | S7653 | Salt for use in various buffers (sections 5–7) |
| Sodium Hydroxide (NaOH), solid | MilliporeSigma | S8045 | Salt for use in various buffers (sections 5–7) |
| Statistical data-fitting software | GraphPad | Prism | For fitting data from analytical PAGE to kinetic models (section 6) |
| Streptavidin-coated magnetic beads | ThermoFisher Scientific | 65002 | For capturing biotin-labeled RNA in cross-chiral ribozyme reactions (section 7) |
| Sucrose | MilliporeSigma | 84097 | For PAGE urea loading buffer (section 5) |
| TBE running buffer, 10x | ThermoFisher Scientific | AAJ62788K3 | For PAGE (sections 5–7) |
| Tetrabutylammonium Fluoride, 1.0 M solution in Tetrahydrofuran | Aldrich | 216143 | For removing 2′-silyl protecting groups (section 5) |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Bio-Rad Laboratories | 1610801 | For polymerizing acrylamide for PAGE (sections 5–7) |
| Tributylamine | MilliporeSigma | 90781 | Triphosphorylation reagent (section 2) |
| Tributylammonium pyrophosphate (TBAP) | MilliporeSigma | P8533 | Triphosphorylation reagent (section 2) |
| Tris base | MilliporeSigma | T6666 | Buffering agent for use in various buffers (sections 5–7) |
| TWEEN20 polysorbate detergent | MilliporeSigma | P7949 | Neutral detergent for use with magnetic beads (Section 7) |
| Urea | MilliporeSigma | U5378 | For PAGE and gel loading buffer (sections 5–7) |
| UV-Vis spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | NanoDrop 2000, ND2000 | For measuring oligonucleotide concentrations (section 5) |
| Vacuum centrifuge | ThermoFisher Scientific | Savant Speedvac DNA130-115 Vacuum Concentrator | For removing AMA and THF (section 5) |
| Xylene cyanol | Bio-Rad Laboratories | 1610423 | For PAGE urea loading buffer (section 5) |
References
- Shuman, S. What messenger RNA capping tells us about eukaryotic evolution. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 3 (8), 619-625 (2002).
- Pichlmair, A., et al. RIG-I-mediated antiviral responses single-stranded RNA bearing 5′-phosphates. Science. 314 (5801), 997-1001 (2006).
- Hornung, V., et al. 5′-Triphosphate RNA is the ligand for RIG-I. Science. 314 (5801), 994-997 (2006).
- Myong, S., et al. Cytosolic viral sensor RIG-I is a 5′-triphosphate-dependent translocase on double-stranded RNA. Science. 323 (5917), 1070-1074 (2009).
- Takeuchi, O., Akira, S. Pattern recognition receptors and inflammation. Cell. 140, 805-820 (2010).
- Wang, Y., et al. Structural and functional insights into 5′-ppp RNA pattern recognition by the innate immune receptor RIG-I. Nature Structural & Molecular Biology. 17 (7), 781-787 (2010).
- Goubau, D., et al. Antiviral immunity via RIG-I-mediated recognition of RNA bearing 5′-diphosphates. Nature. 514 (7522), 372-375 (2014).
- Joyce, G. F. Forty years of in vitro evolution. Angewandte Chemie. 46 (34), 6420-6436 (2007).
- Robertson, M. P., Ellington, A. D. In vitro selection of an allosteric ribozyme that transduces analytes to amplicons. Nature Biotechnology. 17 (1), 62-66 (1999).
- Robertson, M. P., Hesselberth, J. R., Ellington, A. D. Optimization and optimality of a short ribozyme ligase that joins non-Watson-Crick base pairings. RNA. 7 (4), 513-523 (2001).
- Hesselberth, J. R., Robertson, M. P., Knudsen, S. M., Ellington, A. D. Simultaneous detection of diverse analytes with an aptazyme ligase array. Analytical Biochemistry. 312 (2), 106-112 (2003).
- Lam, B. J., Joyce, G. F. Autocatalytic aptazymes enable ligand-dependent exponential amplification of RNA. Nature Biotechnology. 27 (3), 288-292 (2009).
- Lam, B. J., Joyce, G. F. An isothermal system that couples ligand-dependent catalysis to ligand-independent exponential amplification. Journal of the American Chemical Society. 133 (9), 3191-3197 (2011).
- Olea, C., Horning, D. P., Joyce, G. F. Ligand-dependent exponential amplification of a self-replicating L-RNA enzyme. Journal of the American Chemical Society. 134 (19), 8050-8053 (2012).
- Olea, C., Joyce, G. F. Real-Time Detection of a Self-Replicating RNA Enzyme. Molecules. 21 (10), (2016).
- Sczepanski, J. T., Joyce, G. F. A cross-chiral RNA polymerase ribozyme. Nature. 515 (7527), 440-442 (2014).
- Tjhung, K. F., Sczepanski, J. T., Murtfeldt, E. R., Joyce, G. F. RNA-catalyzed cross-chiral polymerization of RNA. Journal of the American Chemical Society. 142 (36), 15331-15339 (2020).
- Bare, G. A. L., Joyce, G. F. Cross-chiral, RNA-catalyzed exponential amplification of RNA. Journal of the American Chemical Society. 143 (45), 19160-19166 (2021).
- Milligan, J. F., Groebe, D. R., Witherell, G. W., Uhlenbeck, O. C. Oligoribonucleotide synthesis using T7 RNA polymerase and synthetic DNA templates. Nucleic Acids Research. 15 (21), 8783-8798 (1987).
- Chelliserrykattil, J., Ellington, A. D. Evolution of a T7 RNA polymerase variant that transcribes 2′-O-methyl RNA. Nature Biotechnology. 22 (9), 1155-1160 (2004).
- Ibach, J., et al. Identification of a T7 RNA polymerase variant that permits the enzymatic synthesis of fully 2′-O-methyl-modified RNA. Journal of Biotechnology. 167 (3), 287-295 (2013).
- Esvelt, K. M., Carlson, J. C., Liu, D. R. A system for the continuous directed evolution of biomolecules. Nature. 472 (7344), 499-503 (2011).
- Pleiss, J. A., Derrick, M. L., Uhlenbeck, O. C. T7 RNA polymerase produces 5′ end heterogeneity during in vitro transcription from certain templates. RNA. 4 (10), 1313-1317 (1998).
- Schenborn, E. T., Mierendorf, R. C. A novel transcription property of SP6 and T7 RNA polymerases: dependence on template structure. Nucleic Acids Research. 13 (17), 6223-6236 (1985).
- Martin, C. T., Muller, D. K., Coleman, J. E. Processivity in early stages of transcription by T7 RNA polymerase. Biochemistry. 27 (11), 3966-3974 (1988).
- Gholamalipour, Y., Karunanayake Mudiyanselage, A., Martin, C. T. 3′ end additions by T7 RNA polymerase are RNA self-templated, distributive and diverse in character-RNA-Seq analyses. Nucleic Acids Research. 46 (18), 9253-9263 (2018).
- Vasilyev, N., Serganov, A. Preparation of short 5′-triphosphorylated oligoribonucleotides for crystallographic and biochemical studies. Nucleic Acid Crystallography: Methods and Protocols. , 11-20 (2016).
- Lebedev, A. V., Koukhareva, I. I., Beck, T., Vaghefi, M. M. Preparation of oligodeoxynucleotide 5′-triphosphates using solid support approach. Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids. 20 (4-7), 1403-1409 (2001).
- Paul, N., Springsteen, G., Joyce, G. F. Conversion of a ribozyme to a deoxyribozyme through in vitro evolution. Chemistry & Biology. 13 (3), 329-338 (2006).
- Zlatev, I., et al. Efficient solid-phase chemical synthesis of 5′-triphosphates of DNA, RNA, and their analogues. Organic Letters. 12 (10), 2190-2193 (2010).
- Zlatev, I., Manoharan, M., Vasseur, J. -. J., Morvan, F. Solid-phase chemical synthesis of 5′-triphosphate DNA, RNA, and chemically modified oligonucleotides. Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry. , (2012).
- Zlatev, I., et al. Automated parallel synthesis of 5′-triphosphate oligonucleotides and preparation of chemically modified 5′-triphosphate small interfering RNA. Bioorganic & Medicinal Chemistry. 21 (3), 722-732 (2013).
- Goldeck, M., Tuschl, T., Hartmann, G., Ludwig, J. Efficient solid-phase synthesis of pppRNA by using product-specific labeling. Angewandte Chemie. 53 (18), 4694-4698 (2014).
- Sarac, I., Meier, C. Efficient automated solid-phase synthesis of DNA and RNA 5′-triphosphates. Chemistry-A European Journal. 21 (46), 16421-16426 (2015).
- Sarac, I., Meier, C. Solid-phase synthesis of DNA and RNA 5′-O-triphosphates using cycloSal chemistry. Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry. 64 (1), 4-67 (2016).
- Perez, J. T., et al. Influenza A virus-generated small RNAs regulate the switch from transcription to replication. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (25), 11525-11530 (2010).
- Ludwig, J., Eckstein, F. Rapid and efficient synthesis of nucleoside 5′-0-(1-thiotriphosphates), 5′-triphosphates and 2′,3′-cyclophosphorothioates using 2-chloro-4H-1,3,2-benzodioxaphosphorin-4-one. The Journal of Organic Chemistry. 54 (3), 631-635 (1989).
- Gaur, R. K., Sproat, B. S., Krupp, G. Novel solid phase synthesis of 2′-o-methylribonucleoside 5′-triphosphates and their α-thio analogues. Tetrahedron Letters. 33 (23), 3301-3304 (1992).
- Reddy, M. P., Hanna, N. B., Farooqui, F. Fast cleavage and deprotection of oligonucleotides. Tetrahedron Letters. 35 (25), 4311-4314 (1994).
- Hogrefe, R. I., McCaffrey, A. P., Borozdina, L. U., McCampbell, E. S., Vaghefi, M. M. Effect of excess water on the desilylation of oligoribonucleotides using tetrabutylammonium fluoride. Nucleic Acids Research. 21 (20), 4739-4741 (1993).
- Pitsch, S., Weiss, P. A., Jenny, L., Stutz, A., Wu, X. Reliable chemical synthesis of oligoribonucleotides (RNA) with 2′-O-[(Triisopropylsilyl)oxy]methyl(2′-O-tom)-protected phosphoramidites. Helvetica Chimica Acta. 84 (12), 3773-3795 (2001).
- Green, M. R., Sambrook, J. Isolation of DNA fragments from polyacrylamide gels by the crush and soak method. Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (2), (2019).
- Paul, N., Joyce, G. F. A self-replicating ligase ribozyme. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (20), 12733-12740 (2002).
- Lincoln, T. A., Joyce, G. F. Self-sustained replication of an RNA enzyme. Science. 323 (5918), 1229-1232 (2009).
- Robertson, M. P., Joyce, G. F. Highly efficient self-replicating RNA enzymes. Chemistry & Biology. 21 (2), 238-245 (2014).
- Singh, J., et al. Synthesis of modified nucleoside oligophosphates simplified: fast, pure, and protecting group free. Journal of the American Chemical Society. 141 (38), 15013-15017 (2019).
- Bellon, L. Oligoribonucleotides with 2′-O-(tert-butyldimethylsilyl) groups. Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry. , (2001).
