중국 햄스터 난소 세포의 신속한 항체 당공학

1. DsiRNA 설계 및 재구성 Safari, Firefox 또는 Microsoft Edge를 사용하여 IDT 웹 사이트(https://eu.idtdna.com)에 액세스합니다. 홈 페이지에서 제품 및 서비스 탭을 선택한 다음 RNA 간섭을 선택합니다. Fut8 유전자를 대상으로 하는 맞춤형 다이서 기판(DsiRNA) 구문을 생성하려면 설계 도구를 선택한 다음 사용자 지정 DsiRNA 생성 탭을 선택합니다. Fut8 기탁 번호를 입력하거나 수동으로 유전자 서열을 입력하여 시작하십시오. 본 연구에서, “CHO-K1” 및 “차이니즈 햄스터” 엔트리 둘 다로부터 제안된 Fut8 서열을 https://chogenome.org 로부터 수득하고 DsiRNA를 생성하는데 사용하였다. 대부분의 유전자에는 여러 전사체 변이체가 있으며, DsiRNA가 현재 어셈블리에서 보고된 모든 변이체에서 활성일 것임을 확인하는 것이 중요하다. CHO 세포 게놈이 현재 IDT 웹 사이트에서 “참조 게놈”으로 사용할 수 없으므로 “수동 BLAST”검색을 수행하는 옵션을 선택하십시오. 이 단계는 커스텀 DsiRNA 서열과 관심있는 게놈 사이의 일치를 검색한다. 검색을 클릭하여 DsiRNA 서열을 생성합니다. 차례로, 세금 ID : 10029 (CHO 세포주 및 중국 햄스터)와 함께 “수동 BLAST”기능을 사용하여 각 DsiRNA의 특이성을 평가하십시오. 질의 커버리지 결과는 DsiRNA 구축물이 Fut8(Fut8 전사 체 변이체 포함)과 100%에서 일치하는 반면, 의도하지 않은 표적에 대한 상보성은 ≤76임을 나타냅니다. DsiRNA가 Fut8 을 특이적으로 표적하는지 확인하여 GC 함량이 30 % -50 % 사이인지 확인하십시오. 낮은 GC 함량은 약하고 비특이적 결합과 관련이있는 반면, 높은 GC 함량은 siRNA가 RISC 복합체36으로 풀리고 로딩되는 것을 억제합니다. 형질감염 연구에 사용할 세 개의 DsiRNA를 선택하고(표 1), 각각 Fut8 유전자의 다른 위치를 표적화한다. 제어 실험을 위해 IDT로부터 미리 설계된 비표적화 또는 스크램블링된 DsiRNA를 구입하십시오. 도착하자마자 DsiRNA를 13,300 x g에서 1분 동안 원심분리하여 튜브를 열기 전에 펠릿화한다. 각각의 동결건조된 DsiRNA를 뉴클레아제가 없는 듀플렉스 완충액(IDT에 의해 제공됨)에서 100 μM 원액으로 재구성한다. 예를 들어, 20 μL의 완충액을 2 nmol의 DsiRNA에 첨가하여 100 μM 스톡을 얻었다. 충분한 혼합을 보장하기 위해, 원료 용액을 실온에서 30분 동안 인큐베이션하면서 오비탈 진탕기(50 rpm, 16 mm 궤도)에서 부드럽게 흔들어라. Fut8(각 DsiRNA의 100 μM)을 표적으로 하는 각 DsiRNA 구축물 20 μL를 조합하여 마스터 믹스를 생성한다. 분취량을 준비하고 -20°C에서 보관한다. DsiRNA 표적 순서 GC (%) 구조 A 5′ GAGAAGAUAGAAACAGUCAAAUACC 3′ 36% 5′ GGUAUUUGACUGUUUCUAUCUUCUC 3′ 구조 B 5′ AGAAUGAGAAUGGAUGUUUUUCCTT 3′ 32% 5′ AAGGAAAAACAUCCAUUCUCAUUCUGA 3′ 구조 C 5′ AGAGAAGAUAGAAACAGUCAAAUAC 3′ 32% 5′ GUAUUUGACUGUUUCUAUCUUCUCUCG 3′ 표 1. Fut8 녹다운에 사용되는 DsiRNA 서열. 중국 햄스터 및 CHO K1 세포 게놈에서 Fut8을 표적으로 하는 IDT에 의해 생성된 서열. 각 구축물에 대한 센스 및 안티센스 서열이 (각각) 도시되고, 각 구조체의 GC 내용이 표시된다. Kotidis et al.에서 재인쇄되었습니다. 52년. 2. DsiRNA 형질감염 IgG 모노클로날 항체37 을 발현하는 CHO 세포를 부활시키고 관심있는 세포주에 적합한 배양 조건을 사용한다.참고: 본 연구에 사용된 세포는 글루타민 합성효소(GS) 시스템을 사용하여 생성되었으며, 여기서 내인성 GS는 L-메티오닌 설폭스이민(MSX)에 의해 억제되어 희귀한 고생산 클론의 선택을 강화한다. 따라서 선택한 세포주에서 필요한 경우에만 MSX를 사용하십시오. 세포 바이알을 37°C로 설정된 수조에서 2-3분 동안 해동시킨다. 바이알 외부를 70% (v/v) 에탄올로 청소하고 클래스 II 생물 안전 캐비닛에서 모든 작업을 계속하십시오. 세포 현탁액을 선택한 세포주에 적합한 9 mL의 예열 배지를 함유하는 15 mL 원심분리 튜브로 옮긴다. 세포를 5분 동안 100 x g에서 원심분리하여 펠릿화한다. 세포 펠릿을 방해하지 않고 배지를 조심스럽게 제거하고 폐기하십시오. 이어서, 세포 펠릿을 예열 배지 10 mL에 재현탁시키고 계수를 위한 분취량을 취한다. 혈구계로 계산하거나 자동화 된 세포 카운터를 사용할 때 살아있는 / 죽은 세포를 구별하기위한 적절한 염색으로 계산하는 경우 Trypan 파란색으로 세포를 얼룩지게하십시오. 열거의 두 방법 중 하나에 따라, 적절한 부피의 세포 현탁액을 30 mL의 배지 중 3 x 10 5 세포·mL-1의 생존 가능한 세포 밀도로125 mL 삼각 진탕 플라스크로 옮깁니다 (50 μM MSX의 선택적 보충 포함). 세포를 36.5°C, 5%CO2 로 설정된 인큐베이터로 옮기고 150 rpm (16 mm 궤도)에서 진탕 플랫폼 상에 놓는다. 250 mL 삼각 진탕 플라스크에서 2 x 105 세포·mL-1의 시딩 밀도와 50 mL의 작업 부피로 3-4 일마다 계대 세포. MSX를 사용하는 경우 첫 번째 통과 후 보충을 중단하십시오. 해동 이외에 2x 통과 세포. 형질감염 세포 밀도를 평가하고 세포 생존율이 90%보다 큰지 확인하십시오. 오염을 피하기 위해 70 % (v / v) 에탄올과 RNase 억제제 용액으로 생물 안전 캐비닛 및 모든 장비를 조심스럽게 청소하십시오. 펠릿 세포를 100 x g에서 5분 동안 재현탁시키고, 예열된 배지에서 5 x 106 세포·mL-1의 생존 가능한 세포 밀도로 재현탁시킨다. 8 μL (1 μM에 상당함)의 DsiRNA 마스터 믹스 또는 대조군을 멸균 (0.4 cm) 전기천공 큐벳으로 옮긴다. 그런 다음 800 μL의 세포 현탁액 (4 x 106 세포에 해당)을 동일한 큐벳으로 옮기고 두 성분이 혼합되었는지 확인하십시오. 다음과 같은 펄스 조건을 제공합니다: 1200V, 0.1ms, 정사각형 파형. 셀 서스펜션을 큐벳에서 6웰 플레이트의 한 웰로 옮기고 거품과 같은 물질을 피하십시오. 세포를 10분 동안 진탕 없이 인큐베이터(36.5°C, 5%CO2)에서 회수하였다. 800 μL의 예열 배지를 첨가하여 웰 당 1.6 mL의 최종 부피를 만들고, 형질감염된 세포를 150 rpm (16 mm 궤도)에서 진탕하면서 성장을 위해 인큐베이터 (36.5°C, 5%CO2)로 복귀시킨다. 형질감염 후 48 h에서 상청액 및 세포를 수확한다.정지점: 세포 배양 상청액은 -20°C에서 유지될 수 있고; 그러나 단백질 분해를 피하기 위해 세포 펠릿 수집 직후에 세포 용해를 수행하는 것이 좋습니다. 상청액은 단계 3, 단계 4 및 단계 5에서 사용되는 반면, 세포 펠릿은 단계 6에서 사용된다. 3. IgG 정량화 및 정제 생물층 간섭 측정 또는 다른 선택 방법을 사용하여 IgG 농도를 측정하십시오. 수화물 단백질 A 바이오 센서는 10-30 분 동안 샘플 희석제에 팁을줍니다. 그 동안, 세포 현탁액을 15 mL 원심분리 튜브 내로 옮기고 5분 동안 100 x g에서 펠릿 세포를 옮기거나 0.45 μm 니트로셀룰로스 필터를 통해 여과하여 세포를 제거하였다. 펠렛을 교란시키지 않고, IgG를 함유하는 분리된 상청액을 깨끗한 원심분리 튜브 내로 조심스럽게 옮긴다. 바이오층 간섭 측정에 다음 설정을 사용하십시오 : 쉐이커 속도, 2200 rpm; 런타임, 60 초. 이 매개 변수는 모든 샘플 및 컨트롤을 측정하는 데 사용됩니다. 바이오센서 팁이 수화되면 IgG 표준(각 농도의 4μL)을 사용하여 표준 곡선을 만듭니다. 세포 상청액 4 μL를 로딩하여 샘플 농도를 정량화한다. 각 샘플 사이에 보풀이 없는 물티슈로 장치를 청소합니다. 표준 곡선을 알 수 없는 샘플에 연결하여 알 수 없는 샘플의 결합 속도를 보간합니다. 데이터를 저장하고 csv 또는 PDF 파일로 내보냅니다. IgG 정제 0.2 M 글리신 (pH 2.5)을 함유하는 용출 완충액을 준비하고 0.22 μm 필터를 통과시켜 멸균한다. 분리된 상청액 1 mL를 전체 상청액이 통과할 때까지 0.22 μm 마이크로원심분리 필터 튜브를 사용하여 실온에서 여과한다. 펠릿 150-200 μL의 단백질 A 아가로스 비드를 1.5 mL 원심분리 튜브에서 3분 동안 100 x g에서 상청액을 버린다. 이어서, 단백질 A 비드를 150-200 μL의 세포 배양 배지로 세척하고 원심분리를 반복한다. 상층액을 버리십시오. 평형화된 단백질 A 비드를 단계 3.2.3으로부터 제조된 상청액 1 mL와 재현탁시킨다. 1 mL 폴리프로필렌 튜브에 로딩한다. 폴리프로필렌 튜브를 회전식 혼합기 (15 mm 궤도)에 부착하고 실온에서 60-90분 동안 또는 4°C에서 하룻밤 동안 30 rpm으로 회전시킨다. 인큐베이션이 완료된 후, 플로스루를 수집하고, 비드를 1 mL의 1x PBS로 세척하여 임의의 결합되지 않은 단백질을 제거하였다. 세척 분율도 수집하십시오. 3 mL의 용출 완충액을 폴리프로필렌 컬럼에 첨가함으로써 단백질 A 비드로부터 IgG를 떼어낸다. 컬럼으로부터 배출되는 순차적 분획(각각 500 μL)을 표지된 튜브로 수집한다. 선택사항: 정제된 항체가 저장될 경우, 1 M 트리스 pH 9.5의 25 μL를 첨가하여 용출 완충액을 중화시킨다. 항체가 완충액 교환 등을 통해 즉시 처리되는 경우이 단계를 건너 뜁니다.참고: 정제의 모든 부분(유동, 세척 및 모든 용출 분획)은 표적 단백질이 손실되지 않도록 유지되어야 합니다. 이러한 샘플은 또한 정제가 성공적이지 않은 경우 문제 해결 중에 도움이 될 수 있습니다. 다운스트림 처리를 위해 첫 번째 용출 (용출 A)을 사용하지만 나중에 필요할 경우 다른 모든 분획을 유지하십시오. 4. 버퍼 교환 및 샘플 농도 IgG 용출 완충액을 1x PBS로 교환한다. 하중 용리 A를 3 kDa 분자량 컷오프 원심 농축기 상에 로딩한다. 적절한 MWCO 컬럼을 선택할 때 제조업체 가이드를 참조하십시오. 이 실험에서, 더 작은 기공 크기는 분비된 단백질의 최대 보유를 보장하지만 또한 원심분리 시간을 증가시킨다. 4°C에서 40-50분 동안 13,300 x g에서 원심분리한다. 원심분리는 일단 잔류 부피가 50 μL 이하이면 완료된다. 유동을 버리고 500 μL의 예비냉각된(4°C) 1x PBS를 첨가하여 잔류 상청액을 희석시킨다. 50 μL의 잔류 상청액이 남아있을 때까지 동일한 조건(4°C에서 40-50분 동안 13,300 x g)을 사용하여 샘플을 다시 원심분리한다. 500 μL의 예비 냉각된 (4°C) 1x PBS를 첨가하여 잔류 상층액을 희석하고 다시 원심분리 과정을 반복하여 상층액의 100x 희석액을 얻었다. 상층액을 ~2.5 g· L-1을 40 μL 이하에서 글리칸 분석 방법과의 상용성을 보장한다.참고: 글리칸 분석을 위해 100μg를 로딩해야 합니다.정지점: 농축된 IgG (1x PBS 중)는 -20°C에서 저장될 수 있고 글리칸 분석 전에 해동될 수 있다. 5. 글리칸 분석 제조업체의 지시에 따라 모세관 겔 전기영동을 사용하여 글리칸 분석을 수행하십시오. 자성 비드 용액 200 μL를 0.2 mL PCR 튜브에 옮기고 자기 스탠드 상에 올려 놓고 상청액으로부터 비드를 분리한다. 조심스럽게 상층액을 제거하고 마그네틱 스탠드에서 튜브를 제거하십시오. 정제 된 단백질 샘플과 와류를 추가하여 완전한 혼합을 보장합니다. 변성 완충액(제공됨)을 샘플 튜브에 첨가하고, 60°C에서 8분 동안 인큐베이션한다. 최적의 반응 성능을 위해 시료 튜브를 열어 두십시오. PNGase F (샘플 당 500 유닛)를 첨가하고, 정제된 항체로부터 글리칸을 절단하기 위해 60°C에서 20분 동안 인큐베이션한다. N- 글리 칸의 방출 후, 샘플 튜브와 소용돌이를 닫으십시오. 아세토니트릴, 소용돌이를 첨가하고, 실온에서 1분 동안 인큐베이션한다. 샘플 튜브를 자기 스탠드에 놓고 용액에서 비드를 분리하십시오. 피펫을 사용하여 비드를 만지지 않고 상층액을 조심스럽게 제거하십시오. 흄 후드에서 형광단을 포함하는 글리칸 표지 용액을 샘플에 첨가하십시오. 충분한 혼합을 보장하기 위해 소용돌이(open lids)를 60°C에서 20분 동안 인큐베이션한다. 샘플을 아세토니트릴로 3x 세척하여 과량의 염료를 제거한다. 이어서, 표지된 글리칸을 DDI 물(공급됨)에서 용출시킨다. 샘플 튜브를 자기 스탠드에 두어 정제되고 표지된 글리칸을 함유하는 상등액으로부터 비드를 분리한다. 포도당 사다리 표준, 브라케팅 표준 및 샘플을 준비하고 지정된 트레이 위치에 로드합니다. 글리칸 분석 프로토콜을 실행하십시오. 적절한 소프트웨어를 사용하여 샘플에 존재하는 글리 칸을 분석하고 확인하십시오.주: 효율적인 인큐베이션을 위해 열 블록의 온도가 정확한지 확인하십시오. 6. 웨스턴 블롯 항-α-1,6-푸코실트랜스퍼라제 항체를 사용한 웨스턴 블롯 분석을 사용하여 녹다운 효율을 정량화한다. 폴리아크릴아미드 겔 및 완충제 제조법은 상업적 공급업체38,39로부터 입수할 수 있다. 형질감염 후 48 h에서, 혈구측정기 또는 자동화된 세포 계수기를 사용하여 세포를 계수하고, 5 x 106 세포에 상응하는 세포 현탁액의 부피를 결정한다. 각 실험 조건으로부터 적절한 부피의 세포 현탁액을 멸균된 1.5 mL 원심분리 튜브로 옮기고 펠렛을 4°C에서 10분 동안 13,200 x g로 옮긴다. 상층액을 버리십시오. 세포를 실온에서 10분 동안 1% v/v 프로테아제 억제제 칵테일을 함유하는 용해 완충액 200μL(포유동물 세포로부터 단백질 추출에 적합함)로 용해시킨다. 인큐베이션 동안 혼합물을 부드럽게 흔들어 준다 (50 rpm, 16 mm 궤도). 세포 파편을 제거하기 위해, 용해물을 13,200 x g에서 10분 동안 원심분리한 다음, 클리어링된 용해물을 멸균된 1.5 mL 튜브로 옮긴다. 280 nm에서 분광광도계를 사용하여 각 용해물의 단백질 농도를 측정하였다. 이어서, 동일한 단백질 농도를 갖도록 조정된 각 샘플의 분취량을 준비한다. 단백질 샘플을 DTT-SDS 샘플 로딩 염료에서 10-15분 동안 100°C에서 인큐베이션하여 변성시키는 단계; 최종 염료 농도는 1x이다. 15 μL의 변성된 샘플과 5 μL의 예비염색된 단백질 사다리를 효율적인 분리를 위해 12.5% 분해능 겔이 있는 SDS-PAGE 겔에 로딩한다. 샘플을 겔 당 25mA에서 90분 동안 또는 염료 전면이 겔의 끝에 도달할 때까지 실행한다. 카세트로부터 겔을 조심스럽게 제거하고 메탄올을 함유하는 1x 전사 완충액에서 인큐베이션한다. 습식 이송 시스템을 준비하고 메탄올로 PVDF 막을 활성화시킨다. 습식 이송을 위해 젤과 PVDF 멤브레인을 조립하고, 이송 탱크에 얼음 블록을 놓고, 이송 조건이 차가워 지도록 탱크 전체를 얼음에 잠기십시오. 350mA/100V에서 60분 동안 작동합니다. 블로킹 용액에서 실온에서 30분 동안 인큐베이션하면서 50 rpm (16 mm 궤도)의 오비탈 진탕기 상에서 부드럽게 진탕함으로써 멤브레인을 차단한다. 멤브레인을 멸균수로 5 분 동안 헹구고 반복하십시오. 그런 다음 깨끗한 메스를 사용하여 눈에 보이는 단백질 사다리를 가이드로 사용하여 ~ 50kDa에서 수평으로 멤브레인을 조심스럽게 자릅니다. 막 보유 단백질을 50 kDa 초과의 항-α-1,6-푸코실트랜스퍼라제 항체와 함께 항체 희석제 완충액에서 1:1000에 인큐베이션한다. 멤브레인을 희석제 완충액 중 1:10,000에 항-GAPDH와 함께 50 kDa 미만의 고정화된 단백질로 인큐베이션한다. 멤브레인은 실온에서 1시간 동안 또는 4°C에서 밤새 인큐베이션될 수 있다. 멤브레인을 5분 동안 세척한 다음(x3) 실온에서 적어도 30분 동안 적절한 이차 항체와 함께 인큐베이션한다. 5 분 동안 세척 완충액으로 3x 세척을 수행 한 다음 물로 3x 세척하십시오. 그런 다음 밴드가 나타날 때까지 발색 기질 (또는 적절한 검출 시약)으로 멤브레인을 개발하십시오 (1-60 분). 멤브레인을 물로 2x 헹구고 건조시킵니다. 멤브레인의 이미지를 캡처하고 밀도 분석(40)을 수행한다. 각 샘플에서 상대적 단백질 발현을 계산하려면 먼저 샘플에서 GAPDH 신호의 비율을 계산하십시오. 이는 샘플 로딩의 불일치를 보정하는 각 샘플의 정규화 계수입니다. FUT8 신호 세기(각 레인에 대해)를 해당 레인의 정규화 인자로 나누어 상대적인 FUT8 단백질 발현을 얻는다.