O presente protocolo descreve uma abordagem conveniente para integrar a captura óptica e a espectroscopia raman (SERS) melhorada pela superfície para manipular nanopartículas plasmônicas para detecção molecular sensível. Sem agentes agregadores, o laser de trapping monta nanopartículas plasmônicas para melhorar os sinais sers de analitos de alvo para medições espectroscópicas in situ .
A espectroscopia raman aprimorada na superfície (SERS) permite a detecção ultrasensível de moléculas de analito em várias aplicações devido ao campo elétrico aprimorado de nanoestruturas metálicas. A agregação de nanopartículas de prata induzida por sal é o método mais popular para a geração de substratos ativos do SERS; no entanto, é limitado pela baixa reprodutibilidade, estabilidade e biocompatibilidade. O presente protocolo integra a manipulação óptica e a detecção de SERS para desenvolver uma plataforma analítica eficiente para lidar com isso. Um laser de captura de 1064 nm e um laser de sonda Raman de 532 nm são combinados em um microscópio para montar nanopartículas de prata, que geram hotspots plasmônicos para medições in situ SERS em ambientes aquosos. Sem agentes agregadores, este conjunto dinâmico de nanopartículas de prata plasmônica permite um aprimoramento de aproximadamente 50 vezes do sinal da molécula de analito. Além disso, fornece controle espacial e temporal para formar o conjunto ativo sers em uma solução de nanopartículas de prata revestida de analitos de 0,05 nM, o que minimiza a potencial perturbação para análise in vivo . Assim, esta plataforma sers integrada de trapping óptico tem grande potencial para análises moleculares eficientes, reprodutíveis e estáveis em líquidos, especialmente em ambientes fisiológicos aquosos.
A espectroscopia raman (SERS) é uma técnica analítica sensível para detectar diretamente a estrutura química de moléculas-alvo em concentrações ultrabaixos ou mesmo no nível de molécula única 1,2,3,4. A irradiação a laser induz a ressonância de plasmon de superfície localizada em nanoestruturas metálicas, usadas como substratos sers para amplificar os sinais de Raman de moléculas-alvo. Os agregados de nanopartículas induzidas por sal são os substratos SERS amplamente utilizados, que se submetem espontaneamente ao movimento browniano em líquidos de suspensão coloidais 5,6. A secagem adicional permite medições estáveis de SERS; no entanto, pode ocorrer concentração de impureza, o que introduz ruídos de fundo e causa danos irreversíveis às amostras biológicas7. Por isso, é pertinente desenvolver agregações de nanopartículas livres de sal, controlar seu movimento em solução e melhorar a biocompatibilidade, mantendo a eficiência da medição.
A captura óptica foi adotada para controlar vários substratos metálicos e facilitar as detecções do SERS 8,9,10,11,12,13,14. Uma armadilha óptica é gerada focando firmemente um raio laser para gerar um campo de força óptica, que atrai pequenos objetos para a região de maior intensidade em torno do foco15,16. Recentemente, armadilhas ópticas têm sido usadas para desenvolver plataformas de sensoriamento plasmônico reprodutíveis e sensíveis para diversas aplicações, exibindo suas vantagens únicas na localização e controle da posição de nanoestruturas metálicas ativas da SERS em soluções 17,18,19,20,21,22,23,24 . O presente protocolo introduz uma abordagem para combinar pinças ópticas e espectro-microscopia Raman para montar dinamicamente nanopartículas de prata (AgNPs) e estabilizá-las contra o movimento browniano em solução para medições sers eficientes. Na região de montagem agNP, o sinal do éster de 3,3′-dithiobis [6-ácido nitrobenómico] bis (succinimida) (DSNB), moléculas de analito revestidas na superfície dos AgNPs, pode ser aumentado em aproximadamente 50 dobras. Esta abordagem é adequada para analisar biomoléculas sensíveis incompatíveis com agentes químicos 25,26,27. Além disso, fornece controle espacial e temporal para gerar o conjunto AgNP ativo do SERS. Isso permite a detecção in situ em ambientes aquosos, o que poderia diminuir o uso de AgNPs e minimizar a perturbação para análise in vivo 28,29,30. Além disso, o conjunto AgNP induzido por trapping óptico é estável, reprodutível e reversível31,32. Por isso, é uma plataforma promissora para detectar moléculas de analito em soluções e em condições fisiológicas onde a agregação induzida por sal não é aplicável.
No presente estudo, um laser de captura de 1064 nm, módulo de detecção de força e fonte de iluminação de campo brilhante são integrados ao sistema óptico de microscopia de pinça para manipulação óptica e visualização de partículas. Um laser de sonda Raman de 532 nm também foi incorporado ao microscópio e alinhado com o laser de trapping na câmara de amostra. Para aquisição espectral, a luz rescattered foi coletada e redirecionada para um espectrômetro (Figura 1).
O presente estudo relata uma plataforma analítica que combina trapping óptico e detecção de SERS para caracterizações moleculares in situ . Um feixe de sonda Raman de 532 nm foi combinado com um raio laser de 1064 nm através de vias de camada dupla estéreo para combinar foco e coletar para medições espectroscópicas adicionais na geometria de backscattering. O raio laser de captura montou AgNPs para formar hotspots plasmônicos, seguido pela excitação do raio laser da sonda Raman para gerar o sinal SERS das moléculas de analito na solução. Como prova de conceito, foi demonstrada a detecção de DSNB, que foi revestida na superfície dos AgNPs. Na região de montagem agNP controlada pelo feixe laser de trapping, foi alcançado um aprimoramento de aproximadamente 50 vezes no sinal de DSNB em comparação com os AgNPs dispersos ao redor. Uma amplificação de alto sinal semelhante de moléculas de analito nas medições sers fase de solução na plataforma apresentada foi obtida de forma reprodutivelmente.
A etapa crítica que afeta a amplificação do sinal SERS está formando um conjunto AgNP induzido por armadilhas ópticas. O sinal SERS das moléculas de analito pode ser otimizado por parâmetros experimentais de ajuste fino, como o poder de captura do laser, o tempo de irradiação e a concentração de AgNP. Como mostrado na Figura 8, o uso de uma potência laser de captura mais alta pode aumentar a eficiência da formação de montagem AgNP. Conjuntos AgNP reprodutíveis foram obtidos aumentando a potência do laser de captura de 450 mW para 700 mW. No entanto, uma potência laser de captura superior a 950 mW pode induzir superaquecimento e geração debolhas 38. Assim, recomenda-se uma potência laser de trapping moderada para criar um conjunto AgNP dinâmico. Analogamente, um tempo de irradiação mais longo é útil para promover a formação de conjuntos AgNP. A Figura 8B mostra que uma clara montagem esférica de AgNP foi formada quando o tempo de irradiação aumentou de 5-20 s. No entanto, a montagem agnp foi distorcida após a irradiação de 60 s. Além disso, a formação do conjunto AgNP foi acelerada em uma maior concentração agnp, de 0,01 nM para 0,05 nM, enquanto foi rapidamente superaquecida em 0,25 nM, como mostrado na Figura 8C. Se não houver formação de montagem AgNP aparente, é recomendado o aumento da potência do laser de captura e o tempo de irradiação. Após a geração de um conjunto AgNP estável, o laser de captura deve ser desligado para evitar possíveis danos térmicos.
A atividade sers do conjunto AgNP induzido por armadilha óptica foi atribuída a um aumento na concentração local de AgNP na região de irradiação a laser de trapping, que é o ponto escuro na Figura 6B. Na solução AgNP fluidica, a armadilha óptica pode atrair continuamente AgNPs para acumular e formar hotspots plasmônicos em um espaço confinado nas junções interpartículas. Isso produz um campo elétrico aprimorado que melhora o efeito SERS. Verificou-se ainda pelo sinal sers mais forte obtido em maior concentração de AgNP (1,00 nM) em comparação com o sinal sers mais fraco adquirido em uma menor concentração de AgNP (0,05 nM) sem o laser de trapping, como mostrado na Figura 6E.
Além disso, o controle de posição do conjunto Plasmônico AgNP em solução, contra o movimento browniano, por trapping óptico melhorou significativamente a eficiência e estabilidade das medições sers. A detecção de alto rendimento pode ser conduzida quando conectada ao sistema microfluido. Em comparação com a tradicional agregação induzida por sal de nanopartículas para gerar substratos ativos do SERS, nossa plataforma permite a formação dinâmica de conjuntos AgNP plasmônicos, no local e momento projetados, com alta flexibilidade26,28. Além disso, ele funciona eficientemente em concentrações agnp nanomolares e permite a manipulação espaço-temporal de hotspots ativos do SERS para medições espectroscópicas in situ em soluções. Este conjunto agNP dinâmico gradualmente desmontado em poucos minutos quando o laser de trapping foi desligado. Sem o laser de trapping, o conjunto AgNP quase desapareceu em 20 minutos, como mostrado na Figura Suplementar 1. Isso pode minimizar a influência no sistema de detecção e apresenta grande potencial para várias biossulicações, especialmente a detecção de biomoléculas (DNA, RNA e proteína) em condições fisiológicas e in vivo. No entanto, este conjunto agNP dinâmico fornece um fator de aprimoramento menor do que os agregados agNP induzidos por sal2 e, portanto, novas modificações e desenvolvimento são necessárias.
Em conclusão, a integração da captura óptica e da detecção de SERS fornece um método conveniente para controlar nanopartículas plasmônicas e alcançar o aprimoramento de sinal SERS reprodutível para detectar moléculas de analito em soluções com alta eficiência, estabilidade e biocompatibilidade.
The authors have nothing to disclose.
Reconhecemos o apoio de financiamento da Comissão de Ciência, Tecnologia e Inovação do Município de Shenzhen (Nº. JCYJ20180306174930894), Secretaria Municipal de Ciência e Tecnologia de Zhongshan (2020AG003) e Conselho de Bolsas de Pesquisa de Hong Kong (Projeto 26303018). Também reconhecemos o Prof. Chi-Ming Che e seu apoio de financiamento do “Laboratório de Química Sintética e Biologia Química” no âmbito do Programa Health@InnoHK lançado pela Comissão de Inovação e Tecnologia, Região Administrativa Especial do Governo de Hong Kong da República Popular da China.
1064 nm trapping laser | IPG Photonics, United States | 1064 nm CW Yb fiber laser, 10W | ||
3,3'-Dithiobis[6-nitrobenzoic acid] bis(succinimide) ester | Biosynth Carbosynth | FD15467 | ||
532 nm Raman excitation source | CNI, China | MLL-III-532 | ||
Bluelake software | LUMICKS, Netherlands | version 1.6.12 | optical tweezer control software | |
Frame tape | Thermo Fisher Scientific, Inc | AB-0576 | ||
Immersion oil | Cargille Laboratories, Inc | 16482 | ||
Liquid nitrogen-cooled charge-coupled device (CCD) camera | Teledyn Princeton Instrument, United States | 400B eXcelon | ||
Long-pass dichroic mirror | AHF, Germany | F48-801 | ||
Magnetic laser safety screen | ThorLabs | TPSM2 | ||
Optical tweezer microscope | LUMICKS, Netherlands | m-trap | ||
Silver nitrate | Sigma-Aldrich China, Inc. | S8157 | ||
Spectrometer | Teledyn Princeton Instrument, United States | IsoPlane SCT-320 | ||
Trisodium citrate | Sigma-Aldrich China, Inc. | S4641 | ||
WinSpec software | Teledyn Princeton Instrument, United States | version 2.6.24.0 | spectrum software |