Het huidige protocol beschrijft een handige benadering voor het integreren van optische vangmethoden en oppervlakte-verbeterde Raman-spectroscopie (SERS) om plasmonische nanodeeltjes te manipuleren voor gevoelige moleculaire detectie. Zonder aggregeringsmiddelen assembleert de vanglaser plasmonische nanodeeltjes om de SERS-signalen van doelanalyten te verbeteren voor in situ spectroscopische metingen.
Surface-enhanced Raman spectroscopie (SERS) maakt de ultragevoelige detectie van analytmoleculen in verschillende toepassingen mogelijk vanwege het verbeterde elektrische veld van metalen nanostructuren. Zout-geïnduceerde zilver nanodeeltjesaggregatie is de meest populaire methode voor het genereren van SERS-actieve substraten; het wordt echter beperkt door slechte reproduceerbaarheid, stabiliteit en biocompatibiliteit. Het huidige protocol integreert optische manipulatie en SERS-detectie om een efficiënt analytisch platform te ontwikkelen om dit aan te pakken. Een 1064 nm trapping laser en een 532 nm Raman probe laser worden gecombineerd in een microscoop om zilveren nanodeeltjes te assembleren, die plasmonische hotspots genereren voor in situ SERS-metingen in waterige omgevingen. Zonder aggregeringsmiddelen maakt deze dynamische plasmonische zilveren nanodeeltjesassemblage een ongeveer 50-voudige verbetering van het analytmolecuulsignaal mogelijk. Bovendien biedt het ruimtelijke en temporele controle om de SERS-actieve assemblage te vormen in zo laag als 0,05 nM analyt-gecoate zilveren nanodeeltjesoplossing, die de potentiële verstoring voor in vivo analyse minimaliseert. Vandaar dat dit optisch trapping-geïntegreerde SERS-platform een groot potentieel heeft voor efficiënte, reproduceerbare en stabiele moleculaire analyses in vloeistoffen, vooral in waterige fysiologische omgevingen.
Surface-enhanced Raman spectroscopie (SERS) is een gevoelige analytische techniek voor het direct detecteren van de chemische structuur van doelmoleculen bij ultralage concentraties of zelfs op het niveauvan één molecuul 1,2,3,4. Laserbestraling induceert gelokaliseerde oppervlakteplasmonresonantie in metalen nanostructuren, gebruikt als SERS-substraten om de Raman-signalen van doelmoleculen te versterken. Zout-geïnduceerde nanodeeltjesaggregaten zijn de veelgebruikte SERS-substraten, die spontaan Brownse beweging ondergaan in colloïdale suspensievloeistoffen 5,6. Verder drogen maakt stabiele SERS-metingen mogelijk; er kan echter een onzuiverheidsconcentratie optreden die achtergrondgeluid veroorzaakt en onomkeerbare schade aan biologische monsters veroorzaakt7. Daarom is het relevant om zoutvrije nanodeeltjesaggregaties te ontwikkelen, hun beweging in oplossing te regelen en de biocompatibiliteit te verbeteren met behoud van meetefficiëntie.
Optische trapping is toegepast om verschillende metalen substraten te controleren en SERS-detecties 8,9,10,11,12,13,14 te vergemakkelijken. Een optische val wordt gegenereerd door een laserstraal strak te focussen om een optisch krachtveld te genereren, dat kleine objecten aantrekt naar het gebied met de hoogste intensiteit rond de focus15,16. Onlangs zijn optische vallen gebruikt om reproduceerbare en gevoelige plasmonische detectieplatforms voor verschillende toepassingen te ontwikkelen, die hun unieke voordelen weergeven bij het lokaliseren en regelen van de positie van SERS-actieve metalen nanostructuren in oplossingen 17,18,19,20,21,22,23,24 . Het huidige protocol introduceert een aanpak om optische pincetten en Raman-spectromicroscopie te combineren om zilvernanodeeltjes (AgNP’s) dynamisch samen te stellen en te stabiliseren tegen Brownse beweging in oplossing voor efficiënte SERS-metingen. In het AgNP-assemblagegebied kan het signaal van de 3,3′-dithiobis[6-nitrobenzoëzuur] bis(succinimide)ester (DSNB), analytmoleculen gecoat op het oppervlak van AgNP’s, met ongeveer 50 vouwen worden versterkt. Deze aanpak is geschikt voor het analyseren van gevoelige biomoleculen die onverenigbaar zijn met chemische afdekmiddelen 25,26,27. Bovendien biedt het ruimtelijke en temporele controle om de SERS-actieve AgNP-assemblage te genereren. Dit maakt in situ detectie in waterige omgevingen mogelijk, wat het gebruik van AgNP’s kan verlagen en verstoring voor in vivo analyse kan minimaliseren 28,29,30. Bovendien is de door optische vangmethoden geïnduceerde AgNP-assemblage stabiel, reproduceerbaar en omkeerbaar 31,32. Daarom is het een veelbelovend platform voor het detecteren van analytmoleculen in oplossingen en onder fysiologische omstandigheden waar zoutgeïnduceerde aggregatie niet van toepassing is.
In de huidige studie zijn een 1064 nm trappinglaser, krachtdetectiemodule en brightfield-verlichtingsbron geïntegreerd in het optische pincetmicroscopiesysteem voor optische manipulatie en visualisatie van deeltjes. Een 532 nm Raman-sondelaser werd ook in de microscoop opgenomen en uitgelijnd met de vanglaser in de monsterkamer. Voor spectrale acquisitie werd backscattered licht verzameld en omgeleid naar een spectrometer (figuur 1).
De huidige studie rapporteert een analytisch platform dat optische trapping en SERS-detectie combineert voor in situ moleculaire karakteriseringen. Een 532 nm Raman-sondestraal werd gecombineerd met een 1064 nm trapping laserstraal via stereo dubbellaagse paden om focus te combineren en te verzamelen voor extra spectroscopische metingen in backscattering-geometrie. De trappinglaserstraal assembleerde AgNP’s om plasmonische hotspots te vormen, gevolgd door excitatie van de Raman-sondelaserstraal om het SERS-signaal van de analytmoleculen in oplossing te genereren. Als proof of concept werd de detectie van DSNB gedemonstreerd, die op het oppervlak van AgNP’s werd gecoat. In het AgNP-assemblagegebied dat wordt bestuurd door de vanglaserstraal, werd een ongeveer 50-voudige verbetering van het signaal van DSNB bereikt in vergelijking met de omringende verspreide AgNP’s. Een vergelijkbare hoogsignaalversterking van analytmoleculen in de oplossingsfase SERS-metingen op het gepresenteerde platform werd reproduceerbaar verkregen.
De kritieke stap die van invloed is op de versterking van het SERS-signaal is het vormen van een door optische vangmethoden geïnduceerde AgNP-assemblage. Het SERS-signaal van de analytmoleculen kan worden geoptimaliseerd door experimentele parameters zoals het opvanglaservermogen, de bestralingstijd en de AgNP-concentratie te verfijnen. Zoals te zien is in figuur 8, kan het gebruik van een hoger vanglaservermogen de efficiëntie van AgNP-assemblagevorming verhogen. Reproduceerbare AgNP-assemblages werden verkregen door het vermogen van de vanglaser te verhogen van 450 mW naar 700 mW. Een vanglaservermogen hoger dan 950 mW kan echter oververhitting en bubbelgeneratie38 veroorzaken. Daarom wordt een matig vanglaservermogen aanbevolen om een dynamische AgNP-assemblage te creëren. Analoog is een langere bestralingstijd nuttig voor het bevorderen van de vorming van AgNP-assemblages. Figuur 8B laat zien dat een duidelijke bolvormige AgNP-assemblage werd gevormd toen de bestralingstijd toenam van 5-20 s. De AgNP-assemblage was echter vervormd na 60 s bestraling. Bovendien werd de vorming van de AgNP-assemblage versneld bij een hogere AgNP-concentratie, van 0,01 nM tot 0,05 nM, terwijl deze snel oververhit raakte bij 0,25 nM, zoals weergegeven in figuur 8C. Als er geen duidelijke AgNP-assemblagevorming is, wordt het verhogen van het vanglaservermogen en de bestralingstijd aanbevolen. Bij het genereren van een stabiele AgNP-assemblage moet de vanglaser worden uitgeschakeld om mogelijke thermische schade te voorkomen.
De SERS-activiteit van de door optische vangmethoden geïnduceerde AgNP-assemblage werd toegeschreven aan een toename van de lokale AgNP-concentratie in het vanglaserbestralingsgebied, de donkere vlek in figuur 6B. In de fluidische AgNP-oplossing kan de optische val continu AgNP’s aantrekken om zich op te hopen en plasmonische hotspots te vormen in een besloten ruimte in de interdeeltje-juncties. Dit levert een versterkt elektrisch veld op dat het SERS-effect versterkt. Het werd verder geverifieerd door het sterkere SERS-signaal verkregen bij een hogere AgNP-concentratie (1,00 nM) in vergelijking met het zwakkere SERS-signaal verkregen bij een lagere AgNP-concentratie (0,05 nM) zonder de trappinglaser, zoals weergegeven in figuur 6E.
Bovendien heeft de positieregeling van de plasmonische AgNP-assemblage in oplossing, tegen Brownse beweging, door optische overvulling de efficiëntie en stabiliteit van SERS-metingen aanzienlijk verbeterd. High-throughput detectie kan worden uitgevoerd wanneer aangesloten op het microfluïdische systeem. Vergeleken met de traditionele zout-geïnduceerde aggregatie van nanodeeltjes om SERS-actieve substraten te genereren, maakt ons platform de dynamische vorming van plasmonische AgNP-assemblages mogelijk, op de ontworpen locatie en het moment, met een hoge flexibiliteit26,28. Bovendien werkt het efficiënt bij nanomolaire AgNP-concentraties en maakt het de ruimtelijk-temporele manipulatie van SERS-actieve hotspots mogelijk voor in situ spectroscopische metingen in oplossingen. Deze dynamische AgNP-assemblage werd geleidelijk in enkele minuten gedemonteerd toen de vanglaser werd uitgeschakeld. Zonder de vanglaser verdween de AgNP-assemblage bijna in 20 minuten, zoals te zien is in aanvullende figuur 1. Dit kan de invloed op het detectiesysteem minimaliseren en vertoont een groot potentieel voor verschillende biotoepassingen, met name de detectie van biomoleculen (DNA, RNA en eiwit) onder fysiologische en in vivo omstandigheden. Deze dynamische AgNP-assemblage biedt echter een kleinere verbeteringsfactor dan zoutgeïnduceerde AgNP-aggregaten2, en daarom zijn verdere modificatie en ontwikkeling vereist.
Kortom, de integratie van optische vallen en SERS-detectie biedt een handige methode om plasmonische nanodeeltjes te controleren en reproduceerbare SERS-signaalverbetering te bereiken om analytmoleculen te detecteren in oplossingen met een hoge efficiëntie, stabiliteit en biocompatibiliteit.
The authors have nothing to disclose.
We erkennen de financiële steun van de Science, Technology and Innovation Commission van de gemeente Shenzhen (nr. JCYJ20180306174930894), Zhongshan Municipal Bureau of Science and Technology (2020AG003) en Research Grant Council of Hong Kong (Project 26303018). We erkennen ook Prof. Chi-Ming Che en zijn financiële steun van “Laboratorium voor Synthetische Chemie en Chemische Biologie” in het kader van het Health@InnoHK-programma dat is gelanceerd door de Innovation and Technology Commission, de speciale administratieve regio van de regering van Hong Kong van de Volksrepubliek China.
1064 nm trapping laser | IPG Photonics, United States | 1064 nm CW Yb fiber laser, 10W | ||
3,3'-Dithiobis[6-nitrobenzoic acid] bis(succinimide) ester | Biosynth Carbosynth | FD15467 | ||
532 nm Raman excitation source | CNI, China | MLL-III-532 | ||
Bluelake software | LUMICKS, Netherlands | version 1.6.12 | optical tweezer control software | |
Frame tape | Thermo Fisher Scientific, Inc | AB-0576 | ||
Immersion oil | Cargille Laboratories, Inc | 16482 | ||
Liquid nitrogen-cooled charge-coupled device (CCD) camera | Teledyn Princeton Instrument, United States | 400B eXcelon | ||
Long-pass dichroic mirror | AHF, Germany | F48-801 | ||
Magnetic laser safety screen | ThorLabs | TPSM2 | ||
Optical tweezer microscope | LUMICKS, Netherlands | m-trap | ||
Silver nitrate | Sigma-Aldrich China, Inc. | S8157 | ||
Spectrometer | Teledyn Princeton Instrument, United States | IsoPlane SCT-320 | ||
Trisodium citrate | Sigma-Aldrich China, Inc. | S4641 | ||
WinSpec software | Teledyn Princeton Instrument, United States | version 2.6.24.0 | spectrum software |