JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Türkçe

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biochemistry

Metabolik Etiketleme ve Kütle Spektrometrisi ile Yaşlanan ve Bölünmeyen Kültürlü Hücrelerde Protein Devir Hızlarının Ölçülmesi

Published: April 06, 2022
doi:
10.3791/63835
, ,
1Laboratory of Genetics and Genomics, National Institute on Aging Intramural Research Program,National Institutes of Health, 2Translational Gerontology Branch, National Institute on Aging Intramural Research Program,National Institutes of Health

Summary

Bu protokol, yaşlanan ve bölünmeyen hücrelerin darbeli SILAC, hedefsiz kütle spektrometrisi analizi ve protein yarı ömürlerinin kolaylaştırılmış bir hesaplaması ile metabolik etiketlenmesi için iş akışını açıklar.

Abstract

Artan kanıtlar, merkezi sinir sisteminde yaşlanan hücrelerin birikmesinin, Alzheimer ve Parkinson hastalıkları gibi nörodejeneratif bozukluklara katkıda bulunduğunu göstermiştir. Hücresel yaşlanma, tipik olarak ölümcül altı streslere maruz kalmaya yanıt olarak ortaya çıkan kalıcı bir hücre döngüsü durması durumudur. Bununla birlikte, diğer bölünmeyen hücreler gibi, yaşlanan hücreler metabolik olarak aktif kalır ve benzersiz transkripsiyonel ve translasyonel talepler ve hücre içi ve salgılanan proteomlarda yaygın değişiklikler gerektiren birçok işlevi yerine getirir. Yaşlanma sırasında protein sentezinin ve çürüme oranlarının nasıl değiştiğini anlamak, hücresel yaşlanmanın altında yatan mekanizmaları aydınlatabilir ve yaşlanan hücreler tarafından şiddetlenen hastalıklar için potansiyel terapötik yollar bulabilir. Bu yazıda, kütle spektrometrisi ile birlikte hücre kültüründeki amino asitler (pSILAC) tarafından darbeli kararlı izotop etiketlemesi kullanılarak bölünmeyen hücrelerde protein yarı ömürlerinin proteom ölçeğinde değerlendirilmesi için bir yöntem açıklanmaktadır. pSILAC, amino asitlerin kararlı ağır izotop içeren versiyonları ile hücrelerin metabolik etiketlenmesini içerir. Modern kütle spektrometresi yaklaşımlarıyla birleştiğinde, pSILAC karmaşık karışımlarda yüzlerce veya binlerce proteinin protein döngüsünün ölçülmesini sağlar. Metabolik etiketlemeden sonra, proteinlerin devir dinamikleri, kütle spektrometrisi ile tespit edilen peptitlerdeki ağır izotopların göreceli zenginleşmesine dayanarak belirlenebilir. Bu protokolde, yaşlanan fibroblast kültürlerinin ve benzer şekilde tutuklanan sessiz fibroblastların oluşturulması için bir iş akışı ve beklenen protein devir hızlarının kapsamını en üst düzeye çıkaran basitleştirilmiş, tek zamanlı nokta pSILAC etiketleme zaman kursu tanımlanmıştır. Ayrıca, pSILAC kütle spektrometresi verilerinin analizi ve elektronik tablolar kullanılarak protein bozunma oranlarının kullanıcı dostu hesaplanması için bir boru hattı sunulmaktadır. Bu protokolün uygulanması, yaşlanan hücrelerin ötesinde, nöronlar gibi bölünmeyen kültürlü hücrelere genişletilebilir.

Introduction

Yaşlanma ilk olarak, replikatif tükenmeye ulaştıktan sonra kültürlenmiş birincil hücreler tarafından sergilenen süresiz bir büyüme durması durumu olarak tanımlanmıştır1. O zamandan beri, yaşlanmanın, diğerlerinin yanı sıra genotoksik, mitokondriyal ve onkojenik stresler de dahil olmak üzere çok sayıda hücresel hakarete yanıt olarak ortaya çıkabileceği gösterilmiştir2. Yaşlanma, tümör baskılanması ve yara iyileşmesi gibi fizyolojik olarak önemli birçok role sahipken, yaşlanma sırasında yaşlanan hücrelerin birikmesi, çeşitli nörodejeneratif durumlar da dahil olmak üzere sağlık3 üzerinde bir dizi zararlı etki ile ilişkilidir 4,5,6. Hücresel yaşlanma, nöronlar 7,8,9,10, astrositler 11, mikroglia12 ve oligodendrosit öncülleri 13 dahil olmak üzere çoklu beyin hücresi tiplerinde görülür ve nörodejenerasyon ve bilişsel işlev bozukluğuna katkıda bulunur. Alzheimer hastalığı14’ün ayırt edici özelliklerinden biri olan amiloid beta oligomerlerinin nöronal yaşlanmayı hızlandırdığı gösterilmiştir13,15,16. Yaşlanan hücrelerin prevalansının artması, özellikle çevresel stresörlerden kaynaklanan Parkinson hastalığı17 ile de ilişkilendirilmiştir11,18. Önemli olarak, klinik öncesi modellerde yaşlanan hücrelerin seçici olarak ortadan kaldırılması ömrü uzatır ve yaşa bağlı çok sayıda hastalığı hafifletir 3,5,12 ve bilişsel eksiklikleri iyileştirir 8,11,12,13. Yaşlanan hücreler bu nedenle yaşa bağlı birçok durumun tedavisi için umut verici terapötik hedefler olarak ortaya çıkmıştır.

Yaşlanan hücrelerin zararlı etkilerinin çoğuna, yaşlanma hücreleri tarafından salgılanan biyoaktif moleküllerin karmaşık bir karışımı olan yaşlanma ile ilişkili sekretuar fenotipten (SASP) kaynaklanır ve bu da lokal inflamasyona, anjiyogeneze, hücre dışı matriksin tahrip olmasına ve çevredeki dokuda yaşlanmanın yayılmasına neden olabilir 19,20,21 . SASP ayrıca yaşlanmanın ilginç bir biyolojik fenomenini temsil eder, çünkü hücre döngüsü tutuklaması durumunda önemli bir transkripsiyonel ve translasyonel çaba gerektirir. Aslında, yaşlanan hücrelerin, protein sentezini azaltması gereken ribozom biyogenezi22,23,24’te azalmalar sergilediği gösterilmiştir. Bunun yerine, yaşlanan hücreler bazı proteinleri, özellikle SASP faktörlerini sağlam bir şekilde çevirir ve çevreleyen dokunun metabolizmasını etkiler25. Bu nedenle, kalıcı bir hücre döngüsü durması geçiren yaşlanan hücrelerin protein homeostazını korumaya devam ederken, aynı zamanda SASP faktörlerini ve diğer seçilmiş proteinleri sağlam bir şekilde ifade etmeye devam ettiğini anlamaya büyük ilgi vardır.

Bu yöntem, yaşlanan hücrelerdeki proteinlerin yarı ömürlerini proteom çapında bir ölçekte küresel olarak ölçmek için hücre kültüründeki amino asitler (pSILAC) tarafından kütle spektrometresinin ve darbeli kararlı izotop etiketlemesinin nasıl kullanılacağını açıklar. Geleneksel SILAC’ta, kültürlenmiş hücreler, protein bolluğunun aşağı akış analizi için amino asitlerin ağır ve hafif radyoaktif olmayan izotopları ile tamamen metabolik olarak etiketlenir. Bu yöntem daha önce kültürlü fibroblastların SASP’sinde bolluk değişikliklerini kapsamlı ve nicel olarak değerlendirmek için uygulanmıştır26. pSILAC’ta, hücreler benzer şekilde metabolik olarak, hafif izotop ile ön etiketlemeyi takip eden ağır izotop darbesi ile etiketlenir ve daha sonra bir veya daha fazla zaman aralığında toplanır. Önceden var olan hafif izotopa atıfta bulunarak ağır izotopun dahil edilme oranları daha sonra göreceli protein devir hızlarını hesaplamak için kullanılır. Genel olarak, arginin ve lizin izotopları kullanılır, çünkü tripsin bu kalıntılarda ayrılır; Böylece, standart sindirimden elde edilen tüm peptitler potansiyel olarak ağır etiketi içerecektir. Sadece ağır lizin veya arginin varlığı veya yokluğu ile farklılık gösteren peptit çiftleri kimyasal olarak aynıdır ve bir kütle spektrometresi ile ayırt edilebilir ve ölçülebilir. Kütle spektrometrisi analizini takiben, peptidler, ortaya çıkan peptid tanımlamalarında izotopik etiketin varlığına veya yokluğuna bağlı olarak yeni sentezlenmiş veya önceden var olan olarak tanımlanabilir. Protein devir hızları daha sonra, belirli bir protein için hafif (12C-14 N) peptitler üzerindeki ağır (13 C-15N) oranının, üstel büyüme veya bozunma için kinetik modellere 27,28 olarak uydurma ile belirlenebilir. pSILAC, 29,30,31,32 protein devir hızının çeşitli karşılaştırmalarında kullanılmıştır ve şu anda protein yarı ömürlerinin ölçümü için en kapsamlı ve yüksek verimli yöntemdir.

Bu protokol, yaşlanan hücrelerin kültürdeki benzer şekilde büyüme durduran sessiz hücrelere paralel olarak hazırlanmasını ve ardından pSILAC ile metabolik etiketlemeyi detaylandırır. Hücreler daha sonra toplanır, lizatlara homojenize edilir ve kütle spektrometresi edinimi ve analizi için işlenir. Kütle spektrometresinden elde edilen veriler daha sonra, bir elektronik tabloda gerçekleştirilen tek bir zaman noktası ve yarı ömür hesaplamaları kullanan basitleştirilmiş bir nicel yöntem kullanılarak protein yarı ömürlerini belirlemek için kullanılır. Bu yaklaşımı kullanarak, protein yarı ömürlerinin tahminleri, bozulmamış hücresel koşullar için, protein sentezi veya cirosunun blokerlerini kullanan protokollerden daha otantik olan kapsamlı ve nicel bir şekilde ölçülebilir.

Protocol

1. Sessiz hücrelerin ve iyonlaştırıcı radyasyona (IR) maruz kalarak yaşlanan hücrelerin hazırlanması NOT: Hücresel yaşlanma ve sessizlik, başka bir yerde ayrıntılı olarak açıklandığı gibi birden fazla yöntem kullanılarak indüklenebilir33,34,35. Yaşlanma ve sessizliği indüklemek için kullanılan uyaranlar, ilgilenilen hücre tipine ve araştırılan biyolojik soruya bağlı olabilir. Bu çalışmada kullanılan hücreler ticari olarak temin edilebilir. İnsan diploid IMR-90 fibroblastlarını (~ 1 x 106 hücreli) bir kriyovyalden çözün ve 150 mm’lik bir plaka üzerinde% 10 Fetal Sığır Serumu (FBS) (Tablo 1) ile desteklenmiş 20 mL DMEM’de plakalayın. Hücreleri fizyolojik oksijen koşullarında (% 3O2 ,% 5 CO 2, 37 ° C) büyütün ve kültürleri% 10 FBS içeren ortamda, quiscent ve yaşlanan hücreler için yeterli replikasyonlar oluşturulana kadar genişletin (durum başına en az 3-5 replikasyon önerilir).NOT: Fizyolojik (%3) oksijende hücrelerin kültürlenmesi, birincil insan fibroblast hücreleri için idealdir, ancak diğer hücre tipleri için uygun kültür koşulları değişebilir ve duruma göre belirlenmelidir. Çoğalan hücreleri 15 gri (Gy) iyonlaştırıcı radyasyona (IR) maruz bırakarak yaşlanan hücreler oluşturun.NOT: Radyasyona maruz kalmanın yoğunluğu hücre tipine göre değişebilir. Burada 15 Gy kullanılırken, 10 Gy de fibroblastlar için yaygın olarak kullanılan bir radyasyon dozudur; monositler gibi diğer hücreler, 5 Gy kadar düşük bir doz gerektirebilir. Doz genellikle yaşlanma indüksiyonuna karşı canlılığı tartarak ampirik olarak belirlenir. Hücreleri% 40-60 oranında% 10 FBS içeren ortamlarda IR’ye maruz bırakın. IR’ye maruz kaldıktan sonra,% 10 FBS içeren taze medyaya geçin. 8 gün boyunca her 2 günde bir medyayı (20 mL, FBS içeren) değiştirin.NOT: Hücreler daha düşük akıcılıkta IR’ye maruz kalırlar, çünkü IR ile muamele edilen hücreler büyümeyi durdurmadan önce kültürde genişlerler. Bu deneyde, hücreler yaşlanmanın kurulması sırasında bölünmüş hücreler değildi ve daha akıcı hale gelirken, hasatta hala yaşlanan hücre belirteçleri sergilediler. Fibroblastlarda, yaşlanan fenotip 7-10 gün içinde gelişir. Kaplanmış çoğalan hücreler üzerindeki ortamı% 0.2 FBS (serum açlığı) içeren ortama değiştirerek sessiz kontrol hücreleri oluşturun (Tablo 1). FBS içeren ortamlarda sessizlik kontrolü için kullanılacak büyüyen hücreler, yaşlanan hücreler IR’ye maruz kaldıktan sonra 4. güne kadar gerektiğinde bölünerek büyümeye devam edin. IR’den sonraki 4. günde, sessiz hücrelerin ortamını% 0.2 FBS içeren 20 mL ortama değiştirin (Tablo 1) ve her 2 günde bir medyayı değiştirerek 6 gün daha büyümeye devam edin.NOT: % 0.2 FBS içeren ortamlarda bile, fibroblastlar bir miktar büyümeye devam edecek ve hasadın sonunda akıcı görünebilir. Genel bir kural olarak, yaşlanan hücre kültürlerininkine benzer bir akıcılığa ulaştıklarında sessiz hücreleri toplamayı hedefleyin. 2. Darbeli SILAC için hücrelerin etiketlenmesi ve lizatların toplanması Hem yaşlanan hem de sessiz hücrelerdeki (12 plaka) medyayı SILAC Light’a (Tablo 1) değiştirin ve 2 gün boyunca büyütün.NOT: Bu etiketleme, 13C ve 15N’lik düşük bir doğal bolluk olduğundan arka plan gürültüsünü azaltmaya yardımcı olur. Bu adım reaktif sınırlayıcı koşullarda atlanabilir, ancak yeni protein sentezinin hafifçe abartılmasına neden olacaktır. Metabolik etiketleme için ortamı SILAC DMEM (Tablo 1) ile değiştirin.NOT: SILAC DMEM ortamı, metabolik etiketleme için tamamen hafif veya ağır arginin ve lizin izotopları içerecek şekilde özel olarak formüle edilmiştir. Bunlar, alt adım 2.2.1 veya 2.2.2’deki standart DMEM formülasyonları ile değiştirilmemelidir. Üç yaşlanan ve üç sessiz plaka için, medyayı 30 mL SILAC Işık (Tablo 1) ile değiştirin ve medyayı değiştirmeden 3 gün boyunca büyütün. En az üç yaşlanan ve üç sessiz plaka için, ortamı 30 mL SILAC Heavy (Tablo 1) ile değiştirin ve ortamı değiştirmeden 3 gün boyunca büyütün.NOT: Bu noktada, ışık etiketli hücreleri 3 gün daha etiketlemek yerine hemen hasat etme seçeneği vardır. Tek bir zaman noktası için, toplu iş etkilerini en aza indirmek için ağır ve hafif etiketli hücrelerin bu protokolde yapıldığı gibi aynı süre boyunca etiketlenmesi tercih edilir. Her yemeğe 5 mL önceden ısıtılmış tripsin reaktifi ekleyerek ve 37 ° C’de 5 dakika boyunca inkübe ederek hücreleri kültür plakalarından ayırın. Ayrılan hücreleri, kültür için kullanılan aynı ortamın 5 mL’sinde (SILAC Light veya SILAC Heavy) toplam 10 mL’lik bir hacme kadar yeniden askıya alın. Lisatların ekstraksiyonu ve yaşlanma belirteçlerinin doğrulanması için hücreleri toplayın. Her süspansiyon için,6 kuyucuklu bir tabakta (biri SILAC Light kültürlü hücreler ve diğeri SILAC Heavy kültürlü hücreler için olmak üzere iki tabak) % 0.2 FBS içeren 2 mL ortama 0.6 x 10 6 hücre aliquot ve gece boyunca inkübasyon için 37 ° C’ye yerleştirin.NOT: Bu plakalar (alt adım 2.5.1), yaşlanma ile ilişkili β-galaktosidaz (SA-βGal) aktivitesinin tespiti için kullanılacaktır (adım 3.1). Her süspansiyon için, 1 x 106 hücreyi bir mikrosantrifüj tüpüne alın ve 1 dakika boyunca tam hızda bir masa üstü santrifüjde aşağı doğru döndürün. Süpernatantı çıkarın ve peleti 1 mL fenol içinde yeniden askıya alın; Bu adımda, RNA, fenol tedarikçisinin el kitabında açıklandığı gibi tamamen saflaştırılabilir veya -80 ° C’de uzun süreli olarak saklanabilir.DİKKAT: Fenol aşındırıcıdır ve sadece eldivenli ve laboratuvar önlüklü bir başlıkta kullanılmalıdır.NOT: Ekstrakte edilen RNA, ters transkripsiyon (RT) ve ardından gerçek zamanlı, kantitatif (q) PCR (RT-qPCR) analizi (adım 3.2) kullanılarak SASP faktörlerini kodlayan mRNA’ların tespiti için kullanılacaktır. Yaşlanma indüksiyonu için bir başka güvenilir test, çoğalan hücrelerin varlığını gösteren 5-etinil dihidroksi idrar (EdU) birleşmesi için bir testtir. Proliferasyonun yokluğu, sessizliği ve yaşlanmayı doğrulamak için kullanılabilir. Kalan hücreleri buza aktarın ve 300 x g ve 4 ° C’de aşağı doğru döndürün. Süpernatantı çıkarın ve fetal sığır serumundan ortam / tripsin ve eksojen protein kontaminasyonunu kültür ortamından çıkarmak için hücreleri 1 mL soğuk PBS’de iki kez yıkayın. Hücreleri tekrar döndürün, süpernatanı çıkarın ve lizise devam edin. Hücre peletlerini taze hazırlanmış 8 M üre 50 mM amonyum bikarbonat Lizis Tamponundan 150 μL’de (Tablo 1) yeniden askıya alın ve yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın. Lisatları bir su sonikatöründe 2.5 dakika boyunca 30 ° C’de orta güçte 4 s açık / kapalı olarak sonikleştirin. Lisatları önceden ısıtılmış 95 °C ısı bloğuna aktarın ve 4 dakika boyunca denatüre edin. Lisatları aşağı doğru döndürün; lizatlar artık -80 ° C’de saklanabilir veya niceleme için hemen kullanılabilir. Lizis Tamponundaki her lizat için 30 μL’lik 1:10 seyreltme stoğu yapın. ddH2O’da seyreltilmiş 1/10x Lizis Tamponunda hazırlanan standart bir eğri kullanarak BCA Tahlil Kiti ile protein konsantrasyonunu ölçün. 3. Yaşlanma ile ilişkili β-Galaktosidaz (SA-βGal) aktivitesi ve yaşlanma ile ilişkili mRNA’ların RT-qPCR analizi ile yaşlanmanın doğrulanması NOT: Bu adımlar için başlangıç malzemesi adım 2.5 sırasında toplanır Alt adım 2.5.1’de kurulan 6 delikli plakalardan başlayarak, üreticinin protokolünü izleyerek Senescence β-Galaktosidaz Boyama kitini kullanarak SA-βGal aktivitesi için hücreleri analiz edin. Daha önce açıklandığı gibi parlak alan altında boyama işlemini renk etkinken görselleştirin36.NOT: SA-βGal, yaşlanan ve sessiz kontrol koşullarındaki pozitif hücrelerin (görünür mavi renk) yüzdesini karşılaştırarak ölçülür. Yaşlanmanın başarılı bir şekilde doğrulanması için hücrelerin en az% 70’i SA-βGal pozitif olmalıdır. Sessiz kontrol hücreleri SA-βGal için% 10’dan az pozitif olmalıdır. RNA’yı fenol süspansiyonundan (alt adım 2.5.2) çıkarın ve SASP faktörlerini (IL6, CXCL8, IL1B), hücre döngüsü belirteçlerini (CDKN2A / p16, CDKN1A / p21) ve diğer yaşlanma göstergelerini (LMNB1 ve PCNA kaybı) kodlayan mRNA’ların artan seviyeleri için RT-qPCR kullanarak analiz edin.NOT: RNA kararsızdır ve bu nedenle protokolde aksi belirtilmedikçe RNaz içermeyen ekipman, taze eldivenler ve buz üzerinde kullanılmalıdır. Fenol süspansiyonundan başlayarak, 1 mL fenol başına 200 μL kloroform ekleyin ve 4 ° C’de 15 dakika boyunca 12.000 x g’de aşağı doğru döndürün. Sulu fazı dikkatlice çıkarın ve 1: 1 hacim izopropanol, 15 μg glikojen ko-çökeltici ekleyin ve ardından RNA’yı çökeltmek için 10 dakika boyunca 4 ° C’de inkübe edin. Kuluçkadan sonra, RNA’yı 4 ° C’de 20 dakika boyunca 12.000 x g’de santrifüjleme ile pelet ve ardından% 75 EtOH’da 1 hacim fenol kullanılan bir yıkama. RNA’yı 50 μL nükleaz içermeyen damıtılmış suda yeniden askıya alın; RNA süresiz olarak -80 °C’de saklanabilir. RNA örneklerine, 38 μL nükleaz içermeyen damıtılmış su, 10 μL 10x DNAse reaksiyon tamponu ve 2 μL DNaz I ekleyin ve ardından karıştırın.NOT: Alt adım 3.2.3’teki tüm reaktiflerin ortak bir karışımının, numunelere eşit dağılım için işlem için numune sayısı ile çarpılmasının oluşturulması en iyi uygulamadır. DNaz I ile muamele edilmiş RNA örneklerini 37 °C’de 30 dakika boyunca inkübe edin. DNaz’ı, 1 hacimlik bir fenol / kloroform / izoamil alkol (25: 24: 1) karışımı kullanarak, 5 dakika boyunca bir masa üstü santrifüjde maksimum hızda vorteks ve eğirme yoluyla numunelerden çıkarın; RNA sulu fazda bulunacaktır. RNA’yı çökeltmek için 3.2.2 ve 3.2.3 alt adımlarını tekrarlayın. 20 μL nükleaz içermeyen damıtılmış suda yeniden askıya alın; RNA süresiz olarak -80 °C’de saklanabilir. Ters transkriptaz ile birlikte verilen 1x reaksiyon tamponunda 0.5-1.0 μg saflaştırılmış RNA’yı 200 U ters transkriptaz, 100 pMol rastgele primer ve 10 mM dNTP karışımı ile inkübe ederek saflaştırılmış RNA’dan cDNA üretin; 25 °C’de 10 dakika, daha sonra 50 °C’de 30 dakika boyunca kuluçkaya yatırın, 5 dakika boyunca 85 °C’de son bir inaktivasyon adımı ile. Başka bir yerde açıklandığı gibi yaşlılık ile arttığı bilinen mRNA belirteçlerinin (CDKN2A / p16, CDKN1A / p21, IL1B, IL6 ve CXCL8 mRNA’ları) seviyesini değerlendirmek için gerçek zamanlı, kantitatif (q) PCR analizi kullanarak sessiz kontrol ve yaşlanan hücrelerden RT adımından (alt adım 3.2.3) cDNA’yı analiz edin. Temizlik proteini β-Aktin’i kodlayan ACTB mRNA, giriş malzemesindeki farklılıkları normalleştirmek için genellikle iyi bir mRNA’dır. Kullanılan astarlar Tablo 2’dedir.NOT: Göreceli RT-qPCR analizi, hedef astar çiftleri ile bir referans astar çifti arasındaki eşit bağlanma verimliliği varsayımlarına bağlıdır. Bu varsayımlar,37’nin başka bir yerinde ayrıntılı olarak açıklandığı gibi yeni astar setleri için test edilmelidir. Ek olarak, referans belirteçleri karşılaştırılan hücre tipleri arasında sabit olmalıdır ve yaşlanan hücreler için birkaç ek seçenek daha önce tanımlanmıştır38. 4. Solüsyon içi tripsin sindirimi NOT: Bu noktadan itibaren, kütle spektrometrisi analizi sırasında safsızlıklardan kaynaklanan paraziti önlemek için kütle spektrometrisi sınıfı tamponlar, çözücüler ve kimyasallar kullanmak kritik öneme sahiptir. Tüm tamponlar, su ve asetonitril dahil olmak üzere sıvı kromatografisi tandem kütle spektrometrisi analizine uygun bileşenlerden oluşmalıdır. Uygun kimyasalların ve çözücülerin bir listesi için Malzeme Tablosuna bakın. Aliquot 50 μg her protein numunesini yeni tüplere dönüştürür ve Lizis Tamponu ile eşit hacimlere getirir. Her numuneye, disülfür bağlarını azaltmak için DTT’yi 20 mM’lik bir son konsantrasyona ekleyin. Numuneleri 37 °C’de 30 dakika çalkalayarak inkübe edin ve ardından numunelerin oda sıcaklığında soğumasına izin verin (RT, ~ 10 dakika). Önceki adımda indirgenen sülfhidril gruplarını geri dönüşümsüz olarak alkillemek için 40 mM’lik son konsantrasyona iyodoasetamid ekleyin. RT’deki örnekleri karanlıkta 30 dakika boyunca inkübe edin. Her numuneyi 50 mM amonyum bikarbonattan oluşan bir tamponla 1 M Üre’nin altına kadar seyreltin. pH şeritlerine az miktarda numune pipetleyerek pH’ın yaklaşık 8 olup olmadığını kontrol edin. 50 μg başlangıç proteini için her numuneye 1 μg tripsin ekleyin veya 1:50 tripsin: protein oranında, farklı bir protein miktarını sindiriyorsanız, kütle olarak. Örneğin, 150 μg proteinin sindirimi için 3 μg tripsin eklenir. Proteinleri peptitlere sindirmek için numuneleri gece boyunca 37 ° C’de çalkalayarak inkübe edin. Protein sindirimini söndürmek için her numunenin hacimce% 1’ine formik asit ekleyin.NOT: Deney burada duraklatılabilir. Numuneleri -80 °C’de dondurun ve gerekirse daha sonraki bir tarihte bir sonraki adıma geçin. 5. Katı faz ekstraksiyonu (SPE) ile numune temizleme NOT: Bu katı faz ekstraksiyon protokolü, katı fazlı ekstraksiyon kartuşları ve bir vakum manifoldu kurulumu gerektirir. Diğer eşdeğer katı faz ekstraksiyonu (SPE) protokolleri, kütle spektrometresi analizinden önce araştırmacının takdirine bağlı olarak gerçekleştirilebilir. Her numune için bir ekstraksiyon kartuşu kullanarak katı fazlı ekstraksiyon kartuşlarını bir vakum manifolduna yerleştirerek SPE’ye hazırlanın.NOT: SPE protokolünde kullanılacak sorbent miktarı için üreticinin yönergelerine bakın. 50 μg peptit numuneleri için 10 mg sorbent kartuş kullanılması önerilir. Her SPE kartuşunu 800 μL SPE Elüsyon Arabelleği ekleyerek koşullandırın (Tablo 1) ve çözücüyü kartuştan çekmek için vakum emiş kullanın. Adım 5.2’yi yineleyin. 800 μL SPE Yıkama Arabelleği ekleyerek her kartuşu dengeleyin (Tablo 1) ve tamponu kartuşların içinden çekmek için vakum emiş kullanın. Adım 5.4’ü iki kez daha yineleyin ve toplamda üç kez tekrarlayın. Peptit numunelerini SPE kartuşlarına yükleyin ve kartuşlardan numune çekmek için vakum emiş kullanın.NOT: Bu noktada, peptitler kartuşların içindeki sorbente bağlanır. Her kartuşu SPE Yıkama Tamponu ile yıkayın ve tamponu kartuşların içinden çekmek için vakum emiş kullanın. Toplam üç yıkama için adım 5.7’yi iki kez daha tekrarlayın. Elüsyon adımından önce, toplama tüplerini her kartuşun altındaki vakum manifoldu içinde düzenleyin ve toplama tüpleri ile kartuşlar arasında hizalamayı dikkatlice sağlayın. Peptitleri etkisiz hale getirmek için, her kartuşa 800 μL SPE Elüsyon Tamponu ekleyin ve peptitleri vakum emişli toplama tüplerine salın. Adım 5.10’u 400 μL SPE Elüsyon Arabelleği ile tekrarlayın. Peptit numunelerini vakum manifoldundan çıkarın ve bir vakum yoğunlaştırıcısında tamamen kurutun (kurutma yaklaşık 3 saat sürer).NOT: Deney burada duraklatılabilir. Numuneleri -80 °C’de dondurun ve gerekirse daha sonraki bir tarihte devam edin. 6. Veriye bağlı kazanım (DDA) kütle spektrometrisi analizi Peptit numunelerini, suda% 0.2 formik asitten oluşan bir tamponda 400 ng / μL’lik bir konsantrasyonda yeniden askıya alın. Peptitlerin yeniden çözünmesine yardımcı olmak için, numuneleri 5 dakika boyunca vorteksleyin. Ardından, örnekleri bir su banyosu sonicator’da 5 dakika boyunca sonikleştirin. Çözünmeyen her türlü malzemeyi, numuneleri 15.000 x g’de 4 °C’de 15 dakika boyunca santrifüj yaparak toplayın. Peptit süpernatantlarını MS şişelerine aktarın. Her numuneye hacimce 1:30 iRT:sample konsantrasyonunda seçilen indekslenmiş tutma süresi (iRT) peptid standartlarını ekleyin. Sıvı-kromatografi tandem kütle spektrometresi (LC-MS/MS) analizini kullanarak numuneleri proteomik analiz için gönderin. Kütle spektrometresi tesisi tarafından hedeflenmemiş analiz için önerilen LC-MS/MS ayarlarını kullanın. Analiz için örnek ayarlar, nano akış modunda bir nano sıvı kromatografi sistemine bağlı bir Orbitrap kütle spektrometresinde analiz için yapılandırılmış Şekil 3’te gösterilmiştir. Aşağıda örnek bir protokol verilmiştir. Her numuneden 1 μg (5 μL) bir tuzak kolonuna (1 cm uzunluğunda x 100 μm çapında) yükleyin ve 5 dakika boyunca 10 μL/dak akış hızında Yükleme Çözücüsü (Tablo 1) ile yıkayın. Numuneleri 400 nL/dak debiye sahip analitik bir kolona (50 cm uzunluğunda x 100 μm çapında) yükleyin. Peptitleri, %5 ila organik çözücü arasında değişen organik çözücü (%0,2 formik asit ve ,8 asetonitril) ve inorganik çözücü (,8 suda %0,2 formik asit) ile 90 dakikalık lineer gradyan üzerinde süzün. HCD parçalanması (normalleştirilmiş çarpışma enerjisi ) ile sürekli MS1 anket taramaları (60.000 çözünürlük, 3e6 AGC hedefi, 100 ms maksimum birikim süresi ve 400-1.600 m/z kütle aralığı) ve ardından 20 veriye bağımlı MS2 taraması (15.000 çözünürlük, 1e5 AGC hedefi, 25 ms maksimum enjeksiyon süresi ve 1,6 m/z genişlikte yalıtım pencereleri) döngüsüyle kütle spektrometrisi verilerini veriye bağımlı modda elde edin. Tüm numunelerin MS alımını takiben, ham kütle spektrometresi dosyalarını, peptid tepe alanlarının tanımlanması ve nicelleştirilmesi için bir kütle spektrometrisi proteomik analiz yazılımı aracına aktarın.NOT: Bu deneyde peptitlerin ve proteinlerin tanımlanması için, Maskot veritabanı arama aracı, gözden geçirilmiş UniProt insan proteom dizisi veritabanı (Proteom ID: UP000005640) ile birlikte kullanılmıştır. Maskot’ta aşağıdaki arama parametreleri belirtilmiştir: Kantitasyon: SILAC K + 8 R + 10 [MD] Enzim: Tripsin / p Sabit modifikasyon: karbamidometil (C) Değişken modifikasyonlar: asetil (Protein N-terimi), Gln->piro-Glu (N-term Q), Oksidasyon (M), Etiket:13C(6)15N(2) (K), Etiket:13C(6)15N(4) (R) Peptit kütle toleransı: 10 ppm Parça kütle toleransı: 0.08 Da Maksimum kaçırılan bölünmeler: 2 Belirtilmemiş tüm parametreler varsayılandı Proteom kantitasyon yazılım aracında ağır ve hafif peptitler için peptid tepe alanlarını sayısallaştırın. Bu deneydeki zirve alanlarının niceliği için, özgür ve açık kaynaklı Skyline yazılım platformu39,40 kullanıldı. Protein yarı ömürlerinin tahmini için ağır ve hafif peptit tepe alanlarını ihraç edin. 7. Protein yarı ömürlerinin hesaplanması SILAC Çözümleme Çalışma Kitabı’nı (Tablo 3) 1) Ham Veri adlı ilk sayfaya açın ve UniProt ID’leri, gen adları, ağır tepe alanları ve hafif tepe alanlarını belirtilen sütunlara yapıştırın (SH = Hassas-Ağır, SL = Duyusal-Işık, CH = Kontrol (sessiz)-Ağır, CL = Kontrol (sessiz)-Hafif). 2-4 numaralı sayfaları açın ve UniProt ID ve Gen sütunlarının analizden tanımlanan protein sayısıyla eşleştiğinden emin olun (bu deneyler 841 protein tanımladı). Sütunların geri kalanı, tanımlanan proteinleri kapsayacak şekilde sürüklendikten sonra otomatik olarak verilerle doldurulur. 4) adlı dördüncü sayfayı açın ve G ve H sütunlarının numunenin aralık dışında olduğunu gösterdiği satırları analiz edin ve kaldırın; okunan satırları aralık içinde tutun. Beşinci sayfadaki volkan grafiği otomatik olarak doldurulacaktır.

Representative Results

Bu protokol, pSILAC ve minimum zaman noktaları kullanarak yaşlanan ve bölünmeyen, sessiz kontrol hücreleri arasındaki protein yarı ömürlerini küresel olarak karşılaştırmak için bir yöntem açıklamaktadır. Bu protokol, kültürde yaşlanan ve sessiz hücrelerin üretimini, 3 gün boyunca arginin ve lizinin stabil izotoplarına sahip hücrelerin metabolik etiketlemesini, ağır ve hafif peptit izotoplarının göreceli bolluklarını kütle spektrometrisi ile ölçmeyi ve elektronik tablo formülleri kullanılarak protein yarı ömürlerinin basit ve erişilebilir bir hesaplamasını detaylandırır (Şekil 1). Bu yöntem oldukça esnektir ve çok sayıda hücre tipine ve koşuluna uyarlanabilir. Bu protokol için yaşlanan hücrelerin üretilmesinin bir parçası olarak, iki yaşlanma doğrulama yöntemi kullanılır: mikroskopi ile görselleştirilen SA-βGal-pozitif hücreler ve RT-qPCR analizi kullanılarak ölçülen yaşlanan belirteçlerin artan seviyeleri. Yaşlılık belirteçlerinin ölçümü, iki hücre popülasyonunun karşılaştırmasının geçerli sayılması için sessiz ve yaşlanan hücreler arasında net ayrımlar yapmalıdır. SA-βGal aktivitesi için, yaşlanan hücreler mavi görünürken, sessiz kontrol hücreleri hiç renge sahip olmamalı veya çok az renge sahip olmalıdır (Şekil 2A). Bu tahlil, pozitif, mavi lekeli hücreleri toplam hücre sayısının bir yüzdesi olarak sayarak ve daha sonra sessiz kontrol ve yaşlanan hücreler arasındaki yüzde pozitiflik oranını karşılaştırarak ölçülebilir. Her iki hücre durumunun karşılaştırılması için bu protokolün aynı anda yapılması önemlidir; SA-βGal aktivitesi, boyama çözeltisinin pH’ına dayanır, bu nedenle sonuçlar tahliller arasında önemli ölçüde değişebilir ve kalitatif bir ölçüm olarak düşünülmelidir. Yaşlılık belirteçlerinin RT-qPCR analizi, çoğu yaşlanan modelde SASP faktörlerini (IL6, CXCL8, IL1B) kodlayan mRNA’ların ve hücre döngüsü inhibitörlerinin (CDKN2A / p16, CDKN1A / p21) yüksek seviyelerini gösterecektir. Hücre tipine, kültür durumuna ve yaşlılık indükleyicisi41,42’ye bağlı olarak bazı varyasyonlar beklenmesine rağmen, çoğu yaşlanan hücre, sessiz kontrol hücrelerine kıyasla beş kat daha yüksek IL6, CXCL8 ve CDKN1A / p21 mRNA seviyeleri gösterir; tersine, proliferasyon belirteçlerini kodlayan LMNB1 ve PCNA mRNA’larının seviyeleri, yaşlanan hücrelerde sessiz hücrelere kıyasla düşük veya hiç olmamalıdır (Şekil 2B). Birlikte ele alındığında, SA-βGal pozitifliğinin önemli bir yüzdesi ve yaşlanma ile ilişkili mRNA belirteçlerinin bir panelinin beklenen ekspresyonu, bir deneyde yaşlanmanın indüklenmesini doğrulamak için yeterlidir. Kütle spektrometresi analizi için protein numunelerinin işlenmesi, çözelti içi çürütme (2 gün) ve katı faz ekstraksiyonundan (4-6 saat) oluşur. Hedeflenmemiş proteomik analiz yapmak için, elde edilen peptitler veriye bağımlı edinme (DDA) kullanılarak LC-MS / MS analizi için gönderilir. Orbitrap cihazlarında, kütle spektrometresi cihazı yazılım yöntemi düzenleyicisinde bir DDA yöntemi belirtilebilir. Bu çalışmada kullanılan kütle spektrometresi ayarları Şekil 3A’da gösterilmiştir. Sıvı kromatografisi ayarları yöntem editöründe de belirtilebilir. Bu çalışmada organik fazı (asetonitril) artan 90 dakikalık lineer gradyan kullanılmıştır (Şekil 3B). Başarılı bir kazanımı takiben, toplam iyon akımı (TIC), yöntemin doğrusal gradyan kısmı sırasında yoğun bir sinyal içermelidir (Şekil 3C). Bu protokol, bir Orbitrap cihazındaki örnek bir protokolü tanımlar, ancak protein yarı ömürlerinin hesaplanması, çeşitli cihaz türlerinde (örneğin, Orbitrap’lar ve uçuş zamanı aletleri) ve satıcılarda bulunan DDA modunda toplanan herhangi bir kütle spektrometresinden elde edilen veriler üzerinde gerçekleştirilebilir. Edinme ayarları, kullanılan cihazın türüne ve konfigürasyonuna özgü olacaktır ve kütle spektrometresi tesisi tarafından önerilen ayarların kullanılması önerilir. Bu yöntem, ağır ve hafif pikler için nicel kromatografik tepe alanları ham veri dosyalarından çıkarılabildiği ve elektronik tablo formüllerine girilebildiği sürece, DDA olmayan yöntemlerle (SRM, PRM, DIA) de uyumludur. Ham kütle spektrometresi dosyaları, peptitleri ve proteinleri tanımlamak için mevcut birçok proteomik veritabanı arama aracından biriyle aranır. Örneğin, bu çalışmada Mascot43 arama motoru kullanılmıştır. Ağır ve hafif peptitlerin nicelleştirilmesi için kromatografik tepe alanları elde etmek için, veritabanı arama sonuçları Skyline39,40 gibi kromatografik tepe alanları yapabilen proteomik bir yazılıma aktarılır. Peptitlerin ekstrakte edilen iyon kromatogramlarının incelenmesi (Şekil 4), ağır ve hafif peptit sinyallerinin göreceli oranını ortaya çıkaracaktır. Yaşlanan hücrelerde hafif peptit sinyaline göre daha düşük bir ağır peptit sinyali oranı, daha yavaş bir protein devir hızını gösterir (Şekil 4A) ve ışığa göre daha yüksek bir ağır peptit sinyali, daha hızlı bir protein devir hızını gösterir (Şekil 4B). Etiketlenmemiş numuneler çok az ağır peptit sinyali göstermeli veya hiç göstermemelidir. Etiketlenmemiş numunelerdeki görünür herhangi bir ağır peptit sinyali, arka plan gürültüsü olarak kabul edilir ve son hesaplamalar sırasında çıkarılır. Tüm arıtma ve etiketleme koşulları için hafif ve ağır peptitler için kromatografik pik alanların miktarının belirlenmesi, protein devir hızlarının daha sonra hesaplanması ve istatistiksel analiz için ihraç edilmelidir. Tek zaman noktası analizi kullanılarak, protein yarı ömürlerinin nicelleştirilmesinin gerçekleştirilmesi kolaydır ve elektronik tablolarda rahatça yapılabilir. Tablo 3’te, kütle spektrometrisi analizinden tanımlanan 695 proteinin yarı ömürleri hesaplanmıştır. Numunelerdeki her protein için protein seviyesindeki ağır ve hafif izotop bolluklarından başlayarak ( 1) Ham Veri sayfası için girdi), yüzde bir ağır izotop (Oran, R olarak adlandırılır) daha sonra 2) H Oranı başlıklı sayfada otomatik olarak hesaplanır | H + L. Bu adımda, ağır etiketli numunelerden R, sessiz ve yaşlanan üçlüler için son bir R üretmek üzere etiketsiz numunelerden R’nin çıkarılmasıyla normalleştirilir. Etiketlenmemiş numunelerin eksojen olarak eklenmiş ağır izotopu olmaması gerektiğinden, arka plan sinyalini ortadan kaldırmak için kullanılırlar. R’den, kdeg (devir hızı) aşağıdaki formül kullanılarak hesaplanır: Yarılanma ömrü (H, gün cinsinden), sessiz kontroldeki her protein ve yaşlanan üçlü ( sayfa başlıklı 3) Yarılanma Ömrü (gün)) için aşağıdaki formül kullanılarak belirlenir: Bu yarılanma ömürleri daha sonra, her protein için bir p-değerinin yanı sıra sessiz ve yaşlanan ortalama yarı ömür üretmek için sessiz ve yaşlanan üçlüler arasında ortalamaya alınır. Hesaplanan yarılanma ömürleri daha sonra negatif olan değerler için filtrelenir; bu, ışık etiketli hücrelerden (arka plan) gelen ağır sinyal, ağır etiketli hücrelerden gelen ağır sinyalden daha büyük olduğunda ortaya çıkar. Bu filtreleme, burada sunulan sonuçlar için geçerli yarı ömürlerle tanımlanan 841’den 707 protein ile sonuçlandı. Yarılanma ömrü daha sonra sessiz kontrol hücrelerine (log2FC ) göre yaşlılığın log 2 oranı olarak rapor edilir ve bir volkan grafiğinde çizilir (Şekil 5). Örneğin, 5) Analiz sayfasına bakıldığında, pıhtılaşma II trombin reseptörü (F2R) proteininin, 0.51 günlük (B sütunu) sessiz hücrelerde bir yarı ömre ve 1.07 günlük yaşlanan hücrelerde (C sütunu) bir yarı ömre sahip olduğu görülebilir ve bu da 0.001 p değerine sahip ~1.06 (D sütunu) log2FC verir. Şekil 1: Yaşlanan ve sessiz kontrol hücreleri için pSILAC iş akışının diyagramı. İnsan IMR-90 fibroblastları, protein yarı ömürlerinin karşılaştırılması için sessiz (düşük serum) veya yaşlanan (IR) hücre kültürlerini hazırlamak için kullanıldı. Hücreler daha sonra 3 gün boyunca izotopik arginin ve lizin içeren SILAC Light veya SILAC Heavy media ile etiketlendi. Lisatlar hücrelerden ekstrakte edildi, sindirildi, tuzdan arındırıldı ve kütle spektrometrisi kullanılarak analiz edildi. Ağır ve hafif peptit izotop zirveleri, sırasıyla yeni sentezlenmiş ve önceden var olan peptitlere karşılık gelir. Yarılanma ömürleri, üstel bozunma için bir denklem kullanılarak hesaplandı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 2: SA-βGal ve RT-qPCR analizleri kullanılarak yaşlanan fenotiplerin doğrulanması. (A) Yaşlanan ve sessiz hücreler hasat sırasında 6 delikli bir plakaya yeniden kaplanır ve SA-βGal boyama kiti kullanılarak SA-βGal için boyanır. Hücre gövdesindeki mavi renk yaşlanma için pozitiftir. Görüntüler parlak alanda, 10x büyütmede renkte, kırmızı boyut işaretleyicisiyle çekilir. (B) RT-qPCR analizi, yaşlanan hücreleri (kırmızı) ve döngü hücrelerini (gri) ilgisiz bir deneyden karşılaştırır. CDKN1A / p21, CXCL8 ve IL6 mRNA seviyelerindeki artışlar, LMNB1 mRNA seviyelerindeki azalma gibi yaşlanmanın göstergesidir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 3: Q-Exactive HF orbitrap kütle spektrometresi üzerindeki pSILAC kültürlerinin veriye bağımlı edinim (DDA) taramaları ve sıvı kromatografi gradyanı için temsili yöntemler. (A) Bir pSILAC deneyinden tüm hücre lizatlarının veriye bağlı analizi için cihaz yazılımında önerilen cihaz ayarları. (B) Örnek sıvı kromatografisi akış gradyanı yöntem ayarları. Peptitler,% 5 ila% 35 tampon B (% 0.2 formik asit ve% 99.8 asetonitril) arasında değişen 90 dakikalık bir doğrusal gradyan üzerinde salınır, ardından% 80 tampon B ile 10 dakikalık bir yıkama ve% 5 tampon B ile 25 dakikalık bir denge sağlanır. (C) Belirtilen ayarlarla elde edilen IMR-90 fibroblast peptitlerinin kütle spektrometrisi kazanımının temsili bir toplam iyon kromatogramı (TIC). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 4: Yaşlanma sırasında değişmiş ciroya sahip peptitlerin temsili ekstrakte iyon kromatogramları . (A) Yaşlanan ve yaşlanmayan hücrelerde protein DnaJ homolog alt ailesi B üyesi 11’den (DNAJB11) peptid FQMTQEVVCDECPNVK ++ ‘ın kromatografik tepe alanları. SILAC’ın 3 gününü takiben, yaşlanan hücreler, hafif peptide (kırmızı) göre ağır izotop içeren peptidin (mavi) tepe alanındaki bir azalma ile gösterildiği gibi, bu peptide sessiz (yaşlanmayan) hücrelere kıyasla daha az ağır izotop içerir, bu da bu peptidin yaşlanan hücrelerde ciroyu azalttığını gösterir. (B) Yaşlanan ve yaşlanmayan hücrelerde protein Ekleme Faktörü 3a Alt Birim 1’den (SF3A1) peptid VQAQVIQETIVPK ++ ‘ın kromatografik tepe alanları. SILAC’ın 3 gününü takiben, yaşlanan hücreler, hafif peptide (kırmızı) göre ağır izotop içeren peptidin (mavi) tepe alanındaki bir azalma ile gösterildiği gibi, bu peptide sessiz (yaşlanmayan) hücrelere kıyasla daha yüksek oranda ağır izotop içerir ve bu peptidin yaşlanan hücrelerde ciroyu arttırdığını gösterir. Etiketlenmemiş (Gün 0) koşullar, beklendiği gibi, her iki peptit için de ağır izotop dahil edilmediğini göstermektedir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 5: pSILAC etiketlemesinden belirlenen yaşlanan ve sessiz hücrelerdeki protein yarı ömürlerinin karşılaştırılması. (A) Tanımlanan 695 proteinin her biri için yaşlılık/kontrol (sessiz) oranının log2 oranını gösteren volkan grafiği; Bu deneyde, Hafif ve Ağır etiketleme ortamı glikoz ve fenol kırmızısı içermiyordu. (B) Durgun hücrelerde yaşlanan hücrelere karşı en fazla artmış veya azalmış yarı ömre sahip ilk 10 proteini gösteren tablolar (sırasıyla sol ve sağ). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Tablo 1: Bu protokolde kullanılan ortam ve arabellekler. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız. Tablo 2: Bu protokolde kullanılan RT-qPCR primerleri. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız. Tablo 3: Protein yarı ömürlerinin, kıvrım değişikliklerinin ve t-testlerinin hesaplanması için SILAC analiz çalışma kitabı. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Discussion

pSILAC, çoklu hücresel koşullarda protein devir hızlarının küresel olarak ölçülmesini sağlayan güçlü bir tekniktir. Bu makale, yaşlanan ve sessiz hücrelerin hazırlanması, SILAC etiketlemesi ve toplanması ve nihayetinde DDA kütle spektrometrisi kullanılarak analiz edilmesi için talimatlar da dahil olmak üzere, yaşlanan ve sessiz hücreler arasındaki küresel protein yarı ömürlerini karşılaştırmak için pSILAC’ın kullanımını detaylandırmaktadır. Ek olarak, yaşlanma ile ilişkili proteinleri kodlayan bir mRNA panelinin SA-βGal ve RT-qPCR analizi kullanılarak yaşlanma fenotipinin doğrulanması için iki aşamalı bir test tanımlanmıştır. Tanımlanan iki yaklaşımla yaşlanmanın doğrulanmasına ek olarak, proteomik düzeyde yaşlanan ve sessiz hücreler arasındaki bilinen yaşlanma belirteçlerindeki değişiklikler aranarak kütle spektrometrisi analizini takiben yaşlılığın üçüncü bir doğrulaması gerçekleştirilebilir. Yükselmesi beklenen yaşlanma ile ilişkili proteinler, diğerlerinin yanı sıra44,45 başka bir yerde tanımlanan p16, p21 ve BCL2’yi içerir. Yukarıda açıklanan protokolde, iyonlaştırıcı radyasyon, durgun hücreler için yaşlanma ve serum açlığının indüklenmesi için kullanılmıştır. Yaşlanmanın indüksiyonu için birden fazla seçenek mevcuttur ve bunlar arasında41,42,46 önemli heterojenlik vardır. Şu anda, “en fizyolojik” olarak kabul edilen bir yaşlanma yöntemi yoktur, bu nedenle yaşlanan indükleyicinin seçimi büyük ölçüde deneyin bağlamına dayanmaktadır. Bununla birlikte, yaşlanma hakkında genel bir fenomeni belirtmek amacıyla yapılan deneylerin en az iki farklı yaşlılık indükleyicisi kullanması önerilir. Yaşlanma paradigmalarının aralığını tartışmak bu makalenin kapsamı dışındadır, ancak yaşlanmayı indüklemek için bazı yaygın yöntemler arasında DNA hasarını tetiklemek (IR, doksorubisin, replikatif tükenme), onkojenik proteinleri eksprese etmek (HRAS, BRAF) ve mitokondri fonksiyonunu bozmak2.

Yaşlanan indükleyici seçimine ek olarak, kontrol hücrelerinin seçimi de eşit derecede önemli bir husustur. Yaşlanan hücreler, tanım gereği, süresiz büyüme durması altındadır, bu nedenle diğer büyüme durdurucu hücrelerle karşılaştırılması sıklıkla seçilir. pSILAC için, hücre döngüsü tutuklanmış hücreler genellikle tercih edilir, çünkü çoğalmazlar ve bu nedenle protein yarı ömür hesaplamaları için kullanımı daha kolaydır47. Bununla birlikte, kültürlenmiş hücreler genellikle bazı bölünen hücreleri tutacağından, hücre döngüsü durmasını indüklemek için kullanılan yöntemlerin, hala çoğalmakta olan hücrelerden gelen hataları en aza indirmek için mümkün olduğunca homojen bir yanıt üretmesi önemlidir. pSILAC kullanarak döngü hücreleri için protein bozunma oranlarını hesaplamak için, proteinin yavru hücrelere seyreltilme hızını telafi etmek için ek hesaplamalar gerekir27. Bununla birlikte, sessiz büyüme durmasının kendisi komplikasyonsuz değildir. Hücre döngüsü durması için iki genel yöntem vardır: serum yoksunluğu ve temas inhibisyonu48. Tüm hücreler temas inhibisyonu yoluyla sessiz hale getirilemez, ancak bazı fibroblastların49 kültürlenmesinden birkaç gün sonra sessizlik gösterdiği gösterilmiştir. Bu yöntem serum yoksunluğunu kullandı, çünkü yaşlanan hücrelerin karşılaştırılması için daha yaygın olarak kullanılıyor, ancak yaşlanan hücrenin doğru karşılaştırmalar için benzer şekilde serumdan mahrum bırakılmasını gerektiriyor. Serum, mTOR kompleksini aktive eder ve bu nedenle serum yoksunluğu, hücre döngüsü tutuklaması50’ye ek olarak hücre üzerinde çeşitli aşağı akış etkilerine sahiptir. Özellikle, yaşlanan hücrelerin serum yoksunluğu veya mTOR inhibisyonu51,52 üzerine azalmış bir SASP gösterdiği gösterilmiştir.

pSILAC’ta göz önünde bulundurulması gereken bir diğer önemli nokta, kaç zaman noktasının test edileceğidir. Bu protokol, hücreleri tek bir zaman noktasında (3 günlük hafif veya ağır etiketleme) topladı ve bu da ortaya çıkan analizi önemli ölçüde basitleştirdi. Zaman noktası seçimi, deneyin amacına dayanmalıdır. Küresel analiz için, 3 günün proteinlerin çoğunluğunu yakalaması beklenir, ancak 3 gün içinde tamamen devreden kısa ömürlü proteinlerin yarı ömürleri (tüm ışık sinyali kaybolur) bu zaman noktasında ölçülemez. Tersine, 3 gün içinde çok az ciroya sahip uzun ömürlü proteinlerin ölçülmesi de zordur ve genellikle çok az ağır sinyal birikiminin bir sonucu olan son derece büyük yarı ömürlere (haftalar sırasıyla) sahip olarak görünürler. Ağır ve hafif peptit sinyallerinin oranındaki doğrusal olmayan ilişki nedeniyle, daha kısa ve daha uzun zaman noktalarında yeni sentezlenen proteinin yüzdesi nedeniyle, yarı ömürlerin niceliği, ek etiketleme zaman noktaları eklenerek geliştirilebilir. İki hücre durumu arasındaki göreceli karşılaştırmalar için, bu protokolde olduğu gibi, yaklaşık bir yarı ömür yeterli olabilir, ancak nicel doğruluğu artırmak için ek zaman noktaları kullanılabilir.

Bu protokol, protein döngüsünün hedeflenmemiş DDA tabanlı bir analizinin nasıl gerçekleştirileceğini açıklar. Bununla birlikte, protein devir hızı hesaplamaları genellikle ağır ve hafif peptit çiftlerinin göreceli bolluğunu elde edebilen herhangi bir edinme şemasına uygulanabilir. Örneğin, veriden bağımsız edinme (DIA/SWATH) gibi MS2 tabanlı yöntemler de53 ciro oranlarının başarılı bir şekilde hesaplanması için uygulanabilir. Ek olarak, bu protokolde açıklananlar dışındaki enstrümantasyon ve yazılım boru hatları, DDA analizi, protein tanımlama ve protein niceliği gerçekleştirmek için kullanılabilir. Peptit tepe alanlarını çıkarmak için Skyline gibi protein niceleme yazılımı platformlarını kullanırken, belge çalışma alanında çıkarılan iyon kromatogramlarının manuel olarak incelenmesi, hatalı şekilde entegre edilmiş ve nicel olmayan zirvelerin belirlenmesi ve belgenin buna göre düzenlenmesi önerilir. Skyline (skyline.ms) için kapsamlı bir öğretici koleksiyonu çevrimiçi olarak mevcuttur.

pSILAC, üstün çoklama (proteom kapsamı) ve verim nedeniyle kültürlü hücrelerde protein yarı ömürlerinin küresel olarak ölçülmesi için en ideal yöntemlerden birini temsil eder. pSILAC doğrudan sentez veya bozulma oranları sağlamazken, hafif ve ağır sinyaldeki değişim faktörlerin bir araya gelmesinden kaynaklandığından, pSILAC koşullar ve farklı hücre tipleri arasındaki karşılaştırmalar için oldukça yararlıdır. Düşük verimli yöntemler genellikle iki tipe ayrılır: 1) protein sentezini bloke etmek için hücrelerin siklopeksimidle muamelesi ve çürümeyi izlemek için ilavelerden sonra zaman aralıklarında hasat edilmesi veya 2) hücrelerin protein çürümesi inhibitörü ile muamele edilmesi ve protein birikimini izlemek için ilavelerden sonra zaman aralıklarında hasat edilmesi, böylece protein çürüme oranlarının çıkarılması. Her iki yöntemin de sınırlılığı, bu tür tedavilerin kaçınılmaz olarak hücresel fizyolojide önemli değişikliklere neden olacağıdır. Buna karşılık, pSILAC önemli bir müdahale gerektirmez ve teorik olarak hücresel fizyoloji üzerinde tespit edilebilir bir etkiye sahip değildir, çünkü izotopik amino asitler izotopik olmayan muadillerinden sadece tek bir nötron ile farklılık gösterir. Bu nedenle, burada pSILAC için açıklanan yöntem, bölünmeyen hücrelerdeki en fizyolojik protein yarı ömürlerinin küresel ölçümü için basit bir protokolü temsil eder.

Protein döngüsündeki değişikliklerin yaşlanma, yaşa bağlı hastalıklar, nörodejenerasyon ve uzun ömürlülük ile yakın ilişkisi vardır54,55. Bu protokol, yaşlanma hücrelerinde protein devir hızlarını ölçmek için hücre kültüründeki amino asitlerin kararlı izotop etiketlemesini kullanarak bu ilişkileri sorgulamak için bir yöntem açıklar. Bununla birlikte, fareler gibi tüm organizmalarda in vivo yaşlanma ve nörodejenerasyon bağlamında çalışmalar yapmak için çok sayıda benzer yöntem mevcuttur. Nitekim, bu çalışmalar yaşa bağlı hastalıklar bağlamında protein devir hızlarının ölçülmesinin önemini vurgulamıştır56,57,58,59.

Bu çalışmada, ribozomal proteinler ve endoplazmik retikulumda bulunan proteinler, yaşlanan hücrelerde sırasıyla azalmış ve artmış yarı ömürlü iki protein kategorisi olarak öne çıkmıştır. Kesin sonuçlar için kararlı durum seviyelerinin daha fazla analizi gerekli olsa da, bu sonuçlar ayrıca yaşlanan hücrelerin ribozomal proteinlerin yarı ömürlerinin azalması yoluyla translasyonu benzersiz bir şekilde düzenleyebileceğini düşündürmektedir. İleriye dönük olarak, hücresel yaşlanma ve nörodejenerasyon in vivo in mouse modelleri arasındaki ilişkiyi incelemek için kararlı izotop etiketleme yaklaşımlarının uygulanması, bu protokol tarafından açıklanan izotop etiketleme yaklaşımının umut verici bir uzantısı olacaktır.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) ve Intramural Araştırma Programı (IRP), Ulusal Yaşlanma Enstitüsü (NIA) tarafından desteklenmiştir. N.B., Uzun Ömürlü Impetus Hibeleri ve Diyet Takviyeleri Ofisi (ODS) Bilim İnsanları Programı tarafından desteklenmiştir. Şekil 1 , BioRender.com ile oluşturulmuştur.

Materials

Acetonitrile (LC-MS grade) Grainger AH015
Ammonium Bicarbonate Millipore-Sigma 9830
Antibiotic-Antimycotic (100x) ThermoFisher 15240062
BCA Assay Kit ThermoFisher 23227
Dithiothreotol (DTT) Sigma D9779
DMEM, high glucose, HEPES ThermoFisher 12430112
dNTP Mix ThermoFisher R0191
Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated ThermoFisher 10082147
Formic Acid Sigma 27001
Gammacel 40 Exactor Best Theratronics Cesium Irradiator for cells
GlycoBlue ThermoFisher AM2238
Iodoacetamide (IAA) Sigma I1149 Light sensitive
IMR-90 primary lung fibroblasts ATCC CCL-186
iRT Kit (indexed retention time) Biognosys Ki-3002-2 Indexed Retention Time Peptide Standards
Isopropanol ThermoFisher 423835000
Mascot Matrix Science Mascot Daemon 2.8 Proteomic database searching software
Maxima Reverse Transcritase (200 U/µL) ThermoFisher EP0742
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) ThermoFisher 11140050
Nano LC System ThermoFisher ULTIM3000RSLCNANO
Oasis HLB Solid Phase Extraction Cartirdges Waters 186000383
Orbitrap Mass Spectrometer ThermoFisher Q Exactive HF Orbitrap
Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol (25:24:1), 100 mM EDTA, pH 8.0 ThermoFisher 327110025
Phosphate Buffered Saline (PBS) ThermoFisher 10010023
Pierce SILAC Protein Quantitation Kit (Trypsin) -DMEM ThermoFisher A33972
QuantStudio 6 Real-Time PCR System ThermoFisher
Random Hexamer Primer ThermoFisher SO142
Senescence β-Galactosidase Staining Kit Cell Signaling 9860
Skyline University of Washington Skyline-Daily v21.2.1.424 Free and open source qantiative proteomic software. Available on www.skyline.ms
Sonicator waterbath Branson CPX-952-516R
TRIzol Reagent ThermoFisher 15596018 Referred to as phenol in text; hazardous
TRYPle Express ThermoFisher 12605010
Trypsin (sequencing grade) Promega V5113
TURBO Dnase (2U/ uL) ThermoFisher AM2238
Urea ThermoFisher 29700
Water (LC-MS grade) Grainger AH365
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hayflick, L. The cell biology of aging. Journal of Investigative Dermatology. 73 (1), 8-14 (1979).
  2. Gorgoulis, V., et al. Cellular senescence: Defining a path forward. Cell. 179 (4), 813-827 (2019).
  3. Borghesan, M., Hoogaars, W. M. H., Varela-Eirin, M., Talma, N., Demaria, M. A senescence-centric view of aging: Implications for longevity and disease. Trends in Cell Biology. 30 (10), 777-791 (2020).
  4. Martinez-Cue, C., Rueda, N. Cellular senescence in neurodegenerative diseases. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, 16 (2020).
  5. Wissler Gerdes, E. O., et al. Cellular senescence in aging and age-related diseases: Implications for neurodegenerative diseases. International Review of Neurobiology. 155, 203-234 (2020).
  6. Baker, D. J., Petersen, R. C. Cellular senescence in brain aging and neurodegenerative diseases: evidence and perspectives. Journal of Clinical Investigation. 128 (4), 1208-1216 (2018).
  7. Musi, N., et al. Tau protein aggregation is associated with cellular senescence in the brain. Aging Cell. 17 (6), 12840 (2018).
  8. Ogrodnik, M., et al. Obesity-induced cellular senescence drives anxiety and impairs neurogenesis. Cell Metabolism. 29 (5), 1061-1077 (2019).
  9. Chow, H. M., et al. Age-related hyperinsulinemia leads to insulin resistance in neurons and cell-cycle-induced senescence. Nature Neuroscience. 22 (11), 1806-1819 (2019).
  10. Dehkordi, S. K., et al. Profiling senescent cells in human brains reveals neurons with CDKN2D/p19 and tau neuropathology. Nature Aging. 1, 1107-1116 (2021).
  11. Chinta, S. J., et al. Cellular senescence is induced by the environmental neurotoxin paraquat and contributes to neuropathology linked to Parkinson’s disease. Cell Reports. 22 (4), 930-940 (2018).
  12. Bussian, T. J., et al. Clearance of senescent glial cells prevents tau-dependent pathology and cognitive decline. Nature. 562 (7728), 578-582 (2018).
  13. Zhang, P., et al. Senolytic therapy alleviates Abeta-associated oligodendrocyte progenitor cell senescence and cognitive deficits in an Alzheimer’s disease model. Nature Neuroscience. 22 (5), 719-728 (2019).
  14. Selkoe, D. J., Hardy, J. The amyloid hypothesis of Alzheimer’s disease at 25 years. EMBO Molecular Medicine. 8 (6), 595-608 (2016).
  15. Wei, Z., et al. Amyloid beta protein aggravates neuronal senescence and cognitive deficits in 5xfad mouse model of Alzheimer’s disease. Chinese Medical Journal (England). 129 (15), 1835-1844 (2016).
  16. He, N., et al. Amyloid-beta(1-42) oligomer accelerates senescence in adult hippocampal neural stem/progenitor cells via formylpeptide receptor 2. Cell Death & Disease. 4 (11), 924 (2013).
  17. van Dijk, K. D., et al. Changes in endolysosomal enzyme activities in cerebrospinal fluid of patients with Parkinson’s disease. Movement Disorders: Offical Journal of Movement Disorder Society. 28 (6), 747-754 (2013).
  18. Chinta, S. J., et al. Environmental stress, ageing and glial cell senescence: a novel mechanistic link to Parkinson’s disease. Journal of Internal Medicine. 273 (5), 429-436 (2013).
  19. Coppe, J. P., et al. Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor. PLoS Biology. 6 (12), 2853-2868 (2008).
  20. Coppe, J. P., Desprez, P. Y., Krtolica, A., Campisi, J. The senescence-associated secretory phenotype: the dark side of tumor suppression. Annual Review of Patholology. 5, 99-118 (2010).
  21. Acosta, J. C., et al. A complex secretory program orchestrated by the inflammasome controls paracrine senescence. Nature Cell Biology. 15 (8), 978-990 (2013).
  22. Payea, M. J., Anerillas, C., Tharakan, R., Gorospe, M. Translational control during cellular senescence. Molecular and Cellular Biology. 41 (2), 00512 (2021).
  23. Nishimura, K., et al. Perturbation of ribosome biogenesis drives cells into senescence through 5S RNP-mediated p53 activation. Cell Reports. 10 (8), 1310-1323 (2015).
  24. Lessard, F., et al. Senescence-associated ribosome biogenesis defects contributes to cell cycle arrest through the Rb pathway. Nature Cell Biology. 20 (7), 789-799 (2018).
  25. Xu, M., et al. Senolytics improve physical function and increase lifespan in old age. Nature Medicine. 24 (8), 1246-1256 (2018).
  26. Wiley, C. D., et al. SILAC Analysis reveals increased secretion of hemostasis-related factors by senescent cells. Cell Reports. 28 (13), 3329-3337 (2019).
  27. Schwanhausser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).
  28. Doherty, M. K., Hammond, D. E., Clague, M. J., Gaskell, S. J., Beynon, R. J. Turnover of the human proteome: determination of protein intracellular stability by dynamic SILAC. Journal of Proteome Research. 8 (1), 104-112 (2009).
  29. Riba, A., et al. Protein synthesis rates and ribosome occupancies reveal determinants of translation elongation rates. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (30), 15023-15032 (2019).
  30. Mathieson, T., et al. Systematic analysis of protein turnover in primary cells. Nature Communications. 9 (1), 689 (2018).
  31. Liu, T. Y., et al. Time-resolved proteomics extends ribosome profiling-based measurements of protein synthesis dynamics. Cell Systems. 4 (6), 636-644 (2017).
  32. Welle, K. A., et al. Time-resolved analysis of proteome dynamics by tandem mass tags and stable isotope labeling in cell culture (TMT-SILAC) hyperplexing. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 15 (12), 3551-3563 (2016).
  33. Neri, F., Basisty, N., Desprez, P. Y., Campisi, J., Schilling, B. Quantitative proteomic analysis of the senescence-associated secretory phenotype by data-independent acquisition. Current Protocols. 1 (2), 32 (2021).
  34. Hernandez-Segura, A., Brandenburg, S., Demaria, M. Induction and validation of cellular senescence in primary human cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (136), e57782 (2018).
  35. Noren Hooten, N., Evans, M. K. Techniques to Induce and quantify cellular senescence. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (123), e55533 (2017).
  36. Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-βgal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo. Nature Protocols. 4 (12), 1798-1806 (2009).
  37. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  38. Hernandez-Segura, A., Rubingh, R., Demaria, M. Identification of stable senescence-associated reference genes. Aging Cell. 18 (2), 12911 (2019).
  39. MacLean, B., et al. Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments. Bioinformatics. 26 (7), 966-968 (2010).
  40. Pino, L. K., et al. The Skyline ecosystem: Informatics for quantitative mass spectrometry proteomics. Mass Spectrometry Reviews. 39 (3), 229-244 (2020).
  41. Casella, G., et al. Transcriptome signature of cellular senescence. Nucleic Acids Research. 47 (14), 7294-7305 (2019).
  42. Basisty, N., et al. A proteomic atlas of senescence-associated secretomes for aging biomarker development. PLoS Biology. 18 (1), 3000599 (2020).
  43. Perkins, D. N., Pappin, D. J., Creasy, D. M., Cottrell, J. S. Probability-based protein identification by searching sequence databases using mass spectrometry data. Electrophoresis. 20 (18), 3551-3567 (1999).
  44. Hernandez-Segura, A., Nehme, J., Demaria, M. Hallmarks of cellular senescence. Trends in Cell Biology. 28 (6), 436-453 (2018).
  45. Kohli, J., et al. Algorithmic assessment of cellular senescence in experimental and clinical specimens. Nature Protocols. 16 (5), 2471-2498 (2021).
  46. Hernandez-Segura, A., et al. Unmasking transcriptional heterogeneity in senescent cells. Current Biology: CB. 27 (17), 2652-2660 (2017).
  47. Swovick, K., et al. Interspecies differences in proteome turnover kinetics are correlated with life spans and energetic demands. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 20, 100041 (2021).
  48. Marescal, O., Cheeseman, I. M. Cellular mechanisms and regulation of quiescence. Developmental Cell. 55 (3), 259-271 (2020).
  49. Lacorazza, H. D. . Cellular Quiescence. , (2018).
  50. Saxton, R. A., Sabatini, D. M. mTOR signaling in growth, metabolism, and disease. Cell. 168 (6), 960-976 (2017).
  51. Herranz, N., et al. mTOR regulates MAPKAPK2 translation to control the senescence-associated secretory phenotype. Nature Cell Biology. 17 (9), 1205-1217 (2015).
  52. Laberge, R. M., et al. MTOR regulates the pro-tumorigenic senescence-associated secretory phenotype by promoting IL1A translation. Nature Cell Biology. 17 (8), 1049-1061 (2015).
  53. Pino, L. K., Baeza, J., Lauman, R., Schilling, B., Garcia, B. A. Improved SILAC quantification with data-independent acquisition to investigate Bortezomib-induced protein degradation. Journal of Proteome Research. 20 (4), 1918-1927 (2021).
  54. Basisty, N., Meyer, J. G., Schilling, B. Protein turnover in aging and longevity. Proteomics. 18 (5-6), 1700108 (2018).
  55. Basisty, N., Holtz, A., Schilling, B. Accumulation of "Old Proteins" and the critical need for MS-based protein turnover measurements in aging and longevity. Proteomics. 20 (5-6), 1800403 (2020).
  56. Basisty, N., et al. Mitochondrial-targeted catalase is good for the old mouse proteome, but not for the young: ‘reverse’ antagonistic pleiotropy. Aging Cell. 15 (4), 634-645 (2016).
  57. Dai, D. F., et al. Altered proteome turnover and remodeling by short-term caloric restriction or rapamycin rejuvenate the aging heart. Aging Cell. 13 (3), 529-539 (2014).
  58. Karunadharma, P. P., et al. Subacute calorie restriction and rapamycin discordantly alter mouse liver proteome homeostasis and reverse aging effects. Aging Cell. 14 (4), 547-557 (2015).
  59. Basisty, N. B., et al. Stable isotope labeling reveals novel insights into ubiquitin-mediated protein aggregation with age, calorie restriction, and rapamycin treatment. The Journals of Gerontology. Series A, Biological Sciences and Medical Sciences. 73 (5), 561-570 (2018).

Tags

Protein TurnoverSenescent CellsNon-dividing CellsMetabolic LabelingMass SpectrometrySILACProtein HomeostasisCellular StressAgingNeurodegenerative DiseaseLC-MSTrypsinUreaAmmonium BicarbonateDithiothreitolIodoacetamide

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Payea, M., Gorospe, M., Basisty, N. Measurement of Protein Turnover Rates in Senescent and Non-Dividing Cultured Cells with Metabolic Labeling and Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (182), e63835, doi:10.3791/63835 (2022).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image