代謝標識および質量分析による老化および非分裂培養細胞におけるタンパク質代謝回転率の測定

1. 静止期細胞および電離放射線(IR)照射により老化した細胞の作製 注:細胞老化および静止は、他の場所33、34、35で詳細に記載されているように、複数の方法を用いて誘導することができる。老化および静止を誘導するために使用される刺激は、関心のある細胞型および調査中の生物学的問題に依存し得る。本試験で用いた細胞は市販されている。 クライオビアルからヒト二倍体IMR-90線維芽細胞(約1 x106 細胞)を融解し、10%ウシ胎児血清(FBS)を添加した20mLのDMEM(表1)を150mmプレート上にプレートする。 生理的酸素条件(3%O2 、5%CO2 、37°C)で細胞を増殖させ、静止期および老化細胞のための十分な複製が確立されるまで、10S含有培地で培養物を拡大する(条件ごとに少なくとも3〜5回の複製が推奨される)。注:生理学的(3%)酸素で細胞を培養することは、初代ヒト線維芽細胞にとって理想的であるが、他の細胞タイプの適切な培養条件は異なる可能性があり、ケースバイケースで決定されるべきである。 増殖細胞を15グレイ(Gy)の電離放射線(IR)に曝露することによって老化細胞を生成する。注:放射線被ばくの強度は、細胞の種類によって異なる場合があります。ここでは15Gyが使用されていますが、10Gyは線維芽細胞に一般的に使用される放射線量でもあります。単球などの他の細胞は、5Gyという低い用量を必要とすることがある。用量は、一般に、老化誘導に対する生存率を秤量することによって経験的に決定される。 10Sを含む培地中のIRへの40%〜60%のコンフルエントで細胞を露出させる。 IR露光後、FBSを10%含む新鮮な培地に変更してください。 培地(20mL、10Sを含む)を2日ごとに8日間交換する。注:IR処理された細胞は増殖を停止する前に培養中に膨張するため、細胞はより低いコンフルエンシーでIRに曝露される。この実験では、細胞は老化の樹立中に細胞を分裂させず、よりコンフルエントになったが、収穫時に老化細胞マーカーを示した。線維芽細胞では、老化表現型は7〜10日以内に発症する。 増殖細胞を播種した培地を0.2S(血清飢餓)を含む培地に変更することによって静止期対照細胞を生成する(表1)。 老化細胞がIRに曝露された後4日目まで、10Sを含む培地中で静止制御に使用される細胞を増殖させ続け、必要に応じて分裂させる。 IR後の4日目に、静止細胞の培地を0.2Sを含む20mLの培地(表1)に変更し、さらに6日間増殖を続け、2日ごとに培地を交換した。注:0.2Sを含む培地であっても、線維芽細胞は幾分成長し続け、収穫の終わりまでにコンフルエントに見えることがあります。経験則として、静止細胞が老化細胞培養物と同様のコンフルエントに達したときに、静止細胞を収集することを目指してください。 2. パルスSILACの細胞標識と溶解液の回収 老化細胞と静止細胞の両方(12枚のプレート)の培地をSILACライト(表1)に変更し、2日間増殖させる。メモ: このラベリングは、 13C と 15N の自然豊富さが低いため、バックグラウンドノイズを減らすのに役立ちます。このステップは、試薬制限条件下ではスキップできますが、新しいタンパク質合成のわずかな過大評価につながります。 代謝標識のために培地をSILAC DMEM(表1)と交換する。注:SILAC DMEM培地は、代謝標識のためにアルギニンおよびリジンの純粋に軽いまたは重い同位体を含むように特別に配合されています。これらは、サブステップ2.2.1または2.2.2の標準DMEM製剤で置換されてはならない。 3 枚の老化プレートと 3 枚の静止プレートの場合、培地を 30 mL の SILAC ライト (表 1) と交換し、培地を交換せずに 3 日間成長させます。 少なくとも3枚の老化プレートと3枚の静止プレートの場合は、培地を30mLのSILAC Heavy(表1)と交換し、培地を交換せずに3日間成長させます。注:この時点で、さらに3日間ラベル付けするのではなく、光標識された細胞になるものをすぐに採取するオプションがあります。単一の時点について、バッチ効果を最小限に抑えるために、このプロトコルで行われているのと同じ期間、重い標識細胞と軽い標識細胞を標識することが好ましい。 予め加温したトリプシン試薬5 mLを各ディッシュに加え、37°Cで5分間インキュベートすることにより、培養プレートから細胞を剥離する。 剥離した細胞を、培養に使用したのと同じ培地(SILAC LightまたはSILAC Heavyのいずれか)の5 mLに再懸濁し、総容量10 mLにする。 溶解物の抽出および老化マーカーの検証のために細胞を採取する。 各懸濁液について、0.6 x 106 個の細胞を6ウェルディッシュ中の0.2% FBSを含む2mLの培地にアリコートし(2つのディッシュ、1つはSILAC軽培養細胞用、もう1つはSILAC重培養細胞用)、一晩インキュベートするために37°Cで置いた。注:これらのプレート(サブステップ2.5.1)は、老化関連β-ガラクトシダーゼ(SA-βGal)活性の検出に使用されます(ステップ3.1)。 各懸濁液について、1 x106 個の細胞を微量遠心管にアリコートし、卓上遠心分離機内で全速力で1分間スピンダウンする。上清を除去し、ペレットを1mLのフェノールに再懸濁する。このステップでは、RNAはフェノール供給業者のマニュアルに記載されているように完全に精製することも、-80°Cで長期間保存することもできます。警告: フェノールは腐食性があり、手袋と白衣の付いたフード内でのみ取り扱う必要があります。注:抽出されたRNAは、逆転写(RT)に続いてリアルタイム定量(q)PCR(RT-qPCR)分析(ステップ3.2)を使用してSASP因子をコードするmRNAを検出するために使用されます。老化誘導のための別の信頼できるアッセイは、増殖細胞の存在を示す5−エチニルジヒドロキシウリジン(EdU)取り込みのための試験である。増殖の不在は、静止および老化を確認するために使用することができる。 残りの細胞を氷に移し、300 x g および4°Cでスピンダウンする。 上清を除去し、細胞を1mLの冷たいPBSで2回洗浄して、培地からウシ胎児血清からの培地/トリプシンおよび外因性タンパク質汚染を除去する。 細胞を再びスピンダウンし、上清を除去し、溶解に進む。 細胞ペレットを150 μLの新しく調製した8 M尿素50 mM炭酸水素アンモニウム溶解バッファー(表1)に再懸濁し、上下にピペッティングして混合する。 溶解物を水超音波処理器で2.5分間超音波処理し、4°Cで中程度の電力で30秒のオン/オフを行います。 溶解物を予熱した95°Cのヒートブロックに移し、4分間変性させた。 溶解物をスピンダウン;溶解物は-80°Cで保存することも、定量のためにすぐに使用することもできます。 溶解バッファー中の各溶解液に対して1:10希釈液の30μLストックを作る。 ddH 2 Oで希釈した 1/10x 溶解バッファーで作成した標準曲線を使用して、BCA アッセイキットでタンパク質濃度を測定します。 3. 老化関連mRNAの老化関連β-ガラクトシダーゼ(SA-βGal)活性およびRT-qPCR解析による老化の検証 メモ: これらのステップの出発材料は、ステップ 2.5 で収集されます。 サブステップ2.5.1でセットアップした6ウェルプレートから始めて、製造元のプロトコールに従って、老化β-ガラクトシダーゼ染色キットを使用して細胞のSA-βGal活性を分析します。前述のように、色を有効にして明視野下での染色を視覚化する36.注:SA-βGalは、老化対照条件と静止期対照条件における陽性細胞(青色に見える)の割合を比較することによって定量化される。老化の確認を成功させるためには、細胞の最低70%がSA-βGal陽性であるべきである。静止対照細胞は、SA-βGalに対して10%未満の陽性であるべきである。 フェノール懸濁液からRNAを抽出し(サブステップ2.5.2)、RT-qPCRを使用して、SASP因子(IL6、CXCL8、IL1B)、細胞周期マーカー(CDKN2A / p16、CDKN1A / p21)、および老化の他の指標(LMNB1およびPCNAの損失)をコードするmRNAのレベルの増加について分析する。注:RNAは不安定であるため、プロトコルに特に明記されていない限り、RNaseフリーの機器、新鮮な手袋、および氷上で取り扱う必要があります。 フェノール懸濁液から始めて、フェノール1mLあたり200μLのクロロホルムを加え、12,000 x g で4°Cで15分間スピンダウンする。 水相を慎重に除去し、1:1容量のイソプロパノール、15μgのグリコーゲン共沈殿剤を加え、次いで4°Cで10分間インキュベートしてRNAを沈殿させる。 インキュベーション後、12,000 x g で4°Cで20分間遠心分離し、続いて使用した1容量フェノールに等しい75%EtOH中で洗浄することによりRNAをペレット化した。RNAを50μLのヌクレアーゼ非含有蒸留水に再懸濁する。RNAは-80°Cで無期限に保存することができる。 RNAサンプルに、ヌクレアーゼフリー蒸留水38 μL、10 μLの10x DNAse反応バッファー、および2 μLのDNase Iを加え、混合した。注: サブステップ 3.2.3 のすべての試薬にサンプル数を掛けた共通混合液に、サンプルへの均等分布のための処理サンプル数を乗算して生成することがベスト プラクティスです。 DNase I処理RNAサンプルを37°Cで30分間インキュベートする。 1体積のフェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール(25:24:1)混合物を使用して、卓上遠心分離機で最高速度で5分間ボルテックスおよびスピンすることにより、サンプルからDNaseを除去する。RNAは水相に含まれるであろう。 サブステップ 3.2.2 および 3.2.3 を繰り返して RNA を沈殿させます。20μLのヌクレアーゼ非含有蒸留水に再懸濁する。RNAは-80°Cで無期限に保存することができる。 0.5~1.0 μgの精製RNAを、逆転写酵素とともに供給された1x反応緩衝液中で、200 Uの逆転写酵素、100 pMolランダムプライマー、および10 mMのdNTPミックスと共にインキュベートすることにより、精製RNAからcDNAを生成する。25°Cで10分間インキュベートし、次いで50°Cで30分間、最終不活化ステップを85°Cで5分間インキュベートする。 静止期コントロールおよび老化細胞からのRTステップ(サブステップ3.2.3)からのcDNAを、リアルタイムの定量的(q)PCR分析を使用して分析し、他の箇所に記載されているように、老化を伴う増加(CDKN2A/p16、CDKN1A/p21、IL1B、IL6、およびCXCL8 mRNA)または減少(LMNB1およびPCNA mRNA)のレベルを評価します。ハウスキーピングタンパク質β-アクチンをコードするACTB mRNAは、多くの場合、入力材料の違いを正常化するのに良いmRNAである。用いたプライマーを表2に示す。注:相対RT-qPCR分析は、標的プライマー対と参照プライマー対との間の結合効率が等しいという仮定に依存する。これらの仮定は、他の箇所で詳述されているように、新しいプライマーセットについて試験されるべきである37。さらに、参照マーカーは、比較される細胞型間で一定であるべきであり、老化細胞のためのいくつかの追加オプションが以前に同定されている38。 4. 溶液中でのトリプシン消化 注:この時点から、質量分析分析中の不純物からの干渉を防ぐために、質量分析グレードのバッファー、溶媒、および化学物質を使用することが重要です。すべての緩衝液は、水およびアセトニトリルを含む液体クロマトグラフィータンデム質量分析分析に適した成分で構成する必要があります。適切な化学物質および溶媒のリストについては、 材料表 を参照してください。 各タンパク質サンプル50μgを新しいチューブにアリコートし、溶解バッファーで等量にします。 各サンプルに、ジスルフィド結合を減少させるために、終濃度20mMにDTTを添加する。 試料を37°Cで振とうしながら30分間インキュベートし、次いで試料を室温(RT、〜10分)で冷却する。 ヨードアセトアミドを終濃度40mMとなるように加え、前工程で還元したスルフヒドリル基を不可逆的にアルキル化する。サンプルを暗所のRTで30分間インキュベートします。 各サンプルを50 mM重炭酸アンモニウムからなる緩衝液で1 M尿素以下に希釈する。pHストリップに少量のサンプルをピペッティングして、pHが約8であるかどうかを確認します。 各サンプルに 1 μg のトリプシンを 50 μg の開始タンパク質に対して加えるか、異なるタンパク質量を消化する場合は質量比で 1:50 のトリプシン:タンパク質比で加えます。例えば、150μgのタンパク質の消化のために3μgのトリプシンが添加されるであろう。 サンプルを振とうしながら37°Cで一晩インキュベートし、タンパク質をペプチドに消化した。 各サンプルの1体積%にギ酸を加え、タンパク質消化をクエンチする。注: 実験はここで一時停止できます。サンプルを-80°Cで凍結し、必要に応じて後日次のステップに進みます。 5. 固相抽出(SPE)によるサンプルクリーンアップ メモ: この固相抽出プロトコルには、固相抽出カートリッジと真空マニホールドのセットアップが必要です。他の同等の固相抽出(SPE)プロトコルは、質量分析分析の前に研究者の裁量で実施することができる。 各サンプルに 1 つの抽出カートリッジを使用して、真空マニホールド上に固相抽出カートリッジを配置して、SPE の準備をします。メモ: SPE プロトコルで使用する吸着剤の量については、製造元のガイドラインを参照してください。50μgのペプチドサンプルの場合、10mgの吸着剤カートリッジを使用することをお勧めします。 800 μLのSPE溶出バッファー(表1)を加えて各SPEカートリッジを条件付け、真空吸引を使用してカートリッジを通して溶媒を引き抜きます。 手順 5.2 を繰り返します。 800 μL の SPE ウォッシュバッファー (表 1) を加えて各カートリッジを平衡化し、真空吸引を使用してバッファーをカートリッジに引き込みます。 手順 5.4 をさらに 2 回繰り返し、合計 3 回繰り返します。 ペプチドサンプルをSPEカートリッジにロードし、真空吸引を使用してカートリッジを通してサンプルを引き出します。注:この時点で、ペプチドはカートリッジ内の吸着剤に結合します。 各カートリッジをSPEウォッシュバッファで洗浄し、真空吸引を使用してカートリッジを通してバッファを引き出します。 ステップ5.7をさらに2回繰り返し、合計3回の洗浄を行います。 溶出工程の前に、各カートリッジの下の真空マニホールド内に収集チューブを配置し、収集チューブとカートリッジ間の位置合わせを慎重に確認します。 ペプチドを溶出するには、各カートリッジに800 μLのSPE溶出バッファーを添加し、真空吸引でペプチドを回収チューブに溶出します。 400 μL の SPE 溶出バッファーでステップ 5.10 を繰り返します。 真空マニホールドからペプチドサンプルを取り出し、真空濃縮器で完全に乾燥させます(乾燥には約3時間かかります)。注: 実験はここで一時停止できます。サンプルを-80°Cで凍結し、必要に応じて後日続行します。 6. データ依存取得(DDA)質量分析 水中の0.2%ギ酸で構成された緩衝液に400ng/μLの濃度でペプチドサンプルを再懸濁する。 ペプチドの再可溶化を助けるために、サンプルを5分間渦巻きます。次いで、水浴超音波処理機で5分間サンプルを超音波処理する。 任意の不溶性物質を、15,000 x g で4°Cで15分間遠心分離することによってペレット化する。 ペプチド上清をMSバイアルに移す。 選択したインデックス付き保持時間 (iRT) ペプチド標準を、1:30 iRT:sample の濃度で各サンプルに体積単位で追加します。 液体クロマトグラフィータンデム質量分析(LC-MS/MS)分析を用いたプロテオミクス分析用のサンプルを提出してください。 質量分析施設による非標的分析に推奨されるLC-MS/MS設定を使用します。分析の設定例を 図3に示し、ナノフローモードでナノ液体クロマトグラフィーシステムに結合されたOrbitrap質量分析計での分析用に構成されています。プロトコルの例を次に示します。 各サンプル1 μg(5 μL)をトラップカラム(長さ1 cm x 直径100 μm)にロードし、流速10 μL/minでローディング溶媒(表1)で5分間洗浄します。 サンプルを分析カラム (長さ 50 cm x 直径 100 μm) に 400 nL/分の流速でロードします。 有機溶媒(0.2%ギ酸および99.8%アセトニトリル)および無機溶媒(99.8%水中の0.2%ギ酸)、5%〜35%有機溶媒で90分間の直線勾配にわたってペプチドを溶出する。 MS1サーベイスキャン(分解能60,000、3e6 AGCターゲット、最大蓄積時間100 ms、質量範囲400~1,600 m/z)の連続サイクルで質量分析データをデータ依存モードで取得し、その後にHCDフラグメンテーション(正規化された衝突エネルギー27%)で20のデータ依存MS2スキャン(分解能15,000、1e5 AGCターゲット、最大射出時間25ms、および1.6m/z幅アイソレーションウィンドウ)を取得します。 すべてのサンプルのMS取得に続いて、生の質量分析ファイルを質量分析プロテオミクス分析ソフトウェアツールにインポートして、ペプチドピーク面積の同定と定量を行います。注:本実験におけるペプチドおよびタンパク質の同定のために、マスコットデータベース検索ツールを、レビューされたUniProtヒトプロテオーム配列データベース(プロテオームID:UP000005640)と共に使用した。マスコットでは、以下の検索パラメータが指定されました。 定量: SILAC K+8 R+10 [MD] 酵素: トリプシン/p 固定修飾: カルバミドメチル (C) 可変修飾: アセチル (タンパク質 N ターム), Gln->ピロ – Glu (N ターム Q), 酸化 (M), 標識: 13C(6)15N(2) (K), 標識: 13C(6)15N(4) (R) ペプチド質量耐性:10 ppm フラグメント質量公差: 0.08 Da 最大ミス切断:2 指定されていないすべてのパラメータはデフォルトでした プロテオーム定量ソフトウェアツールで重ペプチドと軽質ペプチドのペプチドピーク面積を定量します。この実験のピーク面積の定量化のために、フリーでオープンソースのSkylineソフトウェアプラットフォームを39,40個使用しました。タンパク質の半減期の推定のために、重および軽いペプチドピーク面積をエクスポートします。 7. タンパク質半減期の計算 SILAC 分析ワークブック (表 3) を 1) 生データ という名前の最初のシートに開き、UniProt ID、遺伝子名、重いピーク領域、および軽いピーク領域を、示された列に貼り付けます (SH = セネッセント – ヘビー、SL = セネセントライト、CH = コントロール (静止)-ヘビー、CL = コントロール (静止)-ライト)。 シート 2 ~ 4 を開き、UniProt ID 列と Gene カラムが解析から同定されたタンパク質の数と一致することを確認します (これらの実験では 841 個のタンパク質が同定されました)。残りのカラムは、同定されたタンパク質をカバーするためにドラッグされた後、自動的にデータで埋められます。 4)分析という名前の4番目のシートを開き、列GとHがサンプルが範囲外であることを示す行を削除します。読み取りを行う行を範囲内に保ちます。5 番目のシートの火山プロットが自動的に入力されます。