Yetişkin Sivrisineklerde Oral Beslenme ve Mikroenjeksiyon ile Deneysel Viral Enfeksiyon
Summary
Oral beslenme ve intratorasik enjeksiyon enfeksiyonunu içeren bu metodoloji, midgut ve / veya tükürük bezi bariyerlerinin arbovirüs enfeksiyonu üzerindeki etkisini etkili bir şekilde değerlendirebilir.
Abstract
Omurgalılar için bulaşıcı patojenler olan sivrisinek kaynaklı virüsler (MBV’ler), birçok sivrisinek türü tarafından yayılmakta ve halk sağlığı için ciddi bir tehdit oluşturmaktadır. Yutulduktan sonra, virüsler potansiyel olarak tükürük bezlerine yayılabilecekleri hemolenfe ulaşmak için sivrisinek midgut bariyerinin üstesinden gelmelidir. Bir sivrisinek ısırdığında, bu virüsler yeni omurgalı konakçılara yayılır. Benzer şekilde, sivrisinek farklı virüsleri alabilir. Genel olarak, virüslerin sadece küçük bir kısmı tükürük bezlerine bağırsak yoluyla girebilir. Bu virüslerin bezlere bulaşma etkinliği, farklı sivrisinek türlerinde bulunan iki fiziksel bariyerden etkilenir: midgut bariyerleri ve tükürük bezleri bariyerleri. Bu protokol, Aedes aegypti’nin tükürük bezlerinde oral beslenme ve intratorasik enjeksiyon enfeksiyonunu takiben virüs tespiti için bir yöntem sunmaktadır. Ayrıca, bağırsakların ve / veya tükürük bezlerinin viral yayılmayı engelleyip engellemediğini belirlemek, Aedes aegypti tarafından iletilen MBV’lerin risk değerlendirmelerine yardımcı olabilir.
Introduction
Heterojen bir RNA virüsü grubu olan sivrisinek kaynaklı virüsler (MBV’ler), sivrisinek vektörlerinde kalabilir ve daha sonra omurgalı konakçılara yayılabilir1. Klinik olarak önemli MBV’ler büyük ölçüde Flaviviridae, Togaviridae, Reoviridae ve Peribunyavividae 2,3 olmak üzere dört virüs ailesine dağılmıştır. Son yıllarda, bu virüsler tüm dünyada rapor edilmiş ve halk sağlığı sorunlarına neden olmuştur. En iyi bilinen MBV’lerden biri olan Dang virüsü (DENV), son 20 yılda 100’den fazla ülkede en yaygın olarak ortaya çıkan veya yeniden ortaya çıkan arbovirüs haline gelmiştir4. İç kesimlerde Zika virüsünün (ZIKV) keşfinden bu yana, kıtanın hemen hemen tüm tropikal ve subtropikal ülkeleri ve bölgeleri insan ZIKV enfeksiyonlarını bildirmiştir5. Virüs bulaşma riskini değerlendirmek için son yıllarda yapılan çok sayıda çalışma, bu virüsler için sivrisinek vektör yeterliliğine odaklanmıştır 6,7. Sonuç olarak, vektör kaynaklı hastalıkları etkili bir şekilde önlemek ve kontrol etmek kritik öneme sahiptir.
Laboratuvarda en kolay yetiştirilen sivrisineklerden biri olan Aedes aegypti (Ae. aegypti), DENV, ZIKV, Chikungunya virüsü (CHIKV) ve sarı humma virüsünün (YFV)8 önemli bir vektörüdür. Uzun bir süre boyunca, Ae. aegypti sadece Afrika kıtasında ve Güneydoğu Asya’da bulundu, ancak son yıllarda neredeyse tüm kıtaları sömürgeleştirdi9. Dahası, Ae. aegypti’nin küresel bolluğu sürekli olarak büyümekte ve yüzyılın sonuna kadar tahminen% 20’lik bir artış göstermektedir10. Çin’de 2004’ten 2009’a kadar, daha yüksek günlük sıcaklıklar nedeniyle DENV için Ae ae. aegypti vektör yeterliliğinde belirgin bir artış oldu11. Ae. aegypti’nin patojenik vektör olarak statüsü Çin’de önemli ölçüde artmıştır. Sonuç olarak, bu zorlukları ele almak için, Ae. aegypti’nin virüsleri iletme vektör yeterliliğini araştırmak gerekir.
Bir hematofagus eklembacaklı olarak, dişi sivrisinek omurgalı bir konağın derisini deler ve kanla beslenir. Sivrisinekler zaman zaman virüs bulaşmış konakçılardan virüs alır ve daha sonra virüsleri yeni bir konakçıya aktarır. Bu nedenle, vektör yeterliliğini belirlemek için, sivrisinekler laboratuvar ortamında bir besleme sistemi aracılığıyla arbovirüsler içeren yapay bir kan unu ile beslenir12. Bireysel sivrisinekler, enfeksiyondan birkaç gün sonra kafalara, vücutlara ve tükürük salgılarına ayrılır. Virüs enfeksiyonunu, yayılımını ve bulaşma oranlarını ölçmek için, virüs titreleri kantitatif ters transkripsiyon PCR (qRT-PCR) veya plak testi ile tespit edilmiştir. Bununla birlikte, tüm sivrisinekler midgut enfeksiyonları ve kan beslemeyi takiben bir virüsü bir sonraki konakçıya aktarma kapasitesi geliştirmez. Patojenlerin vücuda nüfuz etmesini önleyen ve doğuştan gelen bağışıklıklarında hayati bir rol oynayan sivrisineklerin fizyolojik bariyerleri ile bağlantılıdır13. Midgut bariyerleri, özellikle midgut enfeksiyonu bariyeri (MIB) ve midgut kaçış bariyeri (MEB), virüsün vektörü sistemik olarak enfekte edip edemeyeceğini ve yayıldığı etkinliği etkiler. Tükürük bezi enfeksiyonu ve kaçış bariyerleri de sergileyen tükürük bezleri gibi diğer dokuların enfeksiyonlarının analizini engeller13,14. Vektördeki midgutların ve tükürük bezlerinin enfeksiyonunu daha iyi karakterize etmek için, Ae’de arbovirüsün oral beslenmesi ve intratorasik aşılaması için ayrıntılı bir protokol. aegypti burada sunulmuştur. Bu protokol, Aedes spp.’deki DENV ve ZIKV enfeksiyonu gibi çeşitli sivrisinek vektörlerinde ek arbovirüs enfeksiyonlarına uygulanabilir ve uygulanabilir bir prosedür olduğu kanıtlanabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu yöntemin amacı, oral beslenme ve intratorasik aşılama yoluyla vektör yeterliliğini değerlendirerek sivrisinek kaynaklı bir virüsün kapsamlı bir risk değerlendirmesini sağlamaktır.
Oral beslenme deneyinde, engorged-sivrisineklerin toplanması ve operatörler için ciddi bir risk oluşturan yeni bir kaba aktarılması gerekir. Bunun nedeni, enfekte olmamış sivrisinekler de dahil olmak üzere herhangi bir sivrisineğin bir enfeksiyon kaynağı olabileceğidir1…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Wuhan Bilim ve Teknoloji Planı Projesi (2018201261638501) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Aedes aegypti | Rockefeller strain | ||
| Automated nucleic acid extraction system | NanoMagBio | S-48 | |
| BHK-21 cells | National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology | ||
| Buckets | |||
| C6/36 cells | National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology | ||
| Carbon dioxide spray gun | wuhan Yihong | YHDFPCO2 | |
| Centrifugal machine | Himac | CF16RN | |
| CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | CFX96 Touch | |
| Ebinur Lake virus | Cu20-XJ isolation | ||
| Formaldehyde | Wuhan Baiqiandu | B0003 | |
| Glove box | |||
| Glucose | Hushi | 10010518 | |
| Immersion oil | Cargille | 16908-1 | |
| Insect incubator | Memmert | HPP750T7 | |
| Low Temperature Tissue Homogenizer Grinding Machine | Servicebio | KZ-III-F | |
| Magnetic Virus Genome Extraction Kit | NanoMagBio | NMG0966-16 | |
| mesh cages (30 x 30 x 30 cm) | Huayu | HY-35 | |
| methylcellulose | Calbiochem | 17851 | |
| mice feedstuff powder | BESSN | BS018 | |
| Microelectrode Puller | WPI | PUL-1000 | PUL-1000 is a microprocessor controlled horizontal puller for making glass micropipettes or microelectrodes used in intracellular recording, patch clamp studies, microperfusion or microinjection. |
| Mosquito net meshes | |||
| Nanoject III Programmable Nanoliter Injector | Drummond | 3-000-207 | |
| One Step TB Green PrimeScript PLUS RT-PCR Kit | Takara | RR096A | |
| PBS, pH 7.4 | Gibco | C10010500BT | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 151140-122 | |
| Petri dishes | |||
| Plastic cupes (7 oz) | Hubei Duoanduo | ||
| Plastic cups (24 oz) | Anhui shangji | PET32-Tub-1 | |
| Plastic disposable droppers | Biosharp | BS-XG-O3L-NS | |
| Refrigerator (-80 °C) | sanyo | MDF-U54V | |
| Replacement Glass Capillaries | Drummond | 3-000-203-G/X | |
| RPMI medium 1640 | Gibco | C11875500BT | |
| Screw cap storage tubes (2 mL ) | biofil | FCT010005 | |
| Shallow dishes | |||
| Sponge | |||
| Sterile defibrillated horse blood | Wuhan Purity Biotechnology | CDHXB413 | |
| T75 culture flask | Corning | 430829 | |
| The artificial mosquito feeding system | Hemotek | Hemotek PS6 | |
| The dissecting microscope | ZEISS | stemi508 | |
| The ice plates | |||
| The mosquito absorbing machine | Ningbo Bangning | ||
| The pipette tips | Axygen | TF | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200056 | |
| Tweezers | Dumont | 0203-5-PO |
References
- Yu, X., Zhu, Y., Xiao, X., Wang, P., Cheng, G. Progress towards Understanding the Mosquito-Borne Virus Life Cycle. Trends in Parasitology. 35 (12), 1009-1017 (2019).
- Sukhralia, S., et al. From dengue to Zika: the wide spread of mosquito-borne arboviruses. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 38 (1), 3-14 (2019).
- Kuhn, J. H., et al. Taxonomic update of phylum Negarnaviricota (Riboviria: Orthornavirae), including the large orders Bunyavirales and Mononegavirales. Archives of Virology. 166 (12), 3513-3566 (2021).
- Bhatt, S., et al. The global distribution and burden of dengue. Nature. 496 (7446), 504-507 (2013).
- Kindhauser, M. K., Allen, T., Frank, V., Santhana, R. S., Dye, C. Zika: the origin and spread of a mosquito-borne virus. Bull World Health Organ. 94 (9), 675-686 (2016).
- Wei, Y., et al. Vector Competence for DENV-2 Among Aedes albopictus (Diptera: Culicidae) Populations in China. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, (2021).
- Morales-Vargas, R. E., Misse, D., Chavez, I. F., Kittayapong, P. Vector Competence for Dengue-2 Viruses Isolated from Patients with Different Disease Severity. Pathogens. 9 (10), (2020).
- Naslund, J., et al. Emerging Mosquito-Borne Viruses Linked to Aedes aegypti and Aedes albopictus: Global Status and Preventive Strategies. Vector-Borne and Zoonotic Diseases. 21 (10), 731-746 (2021).
- Lwande, O. W., et al. Globe-Trotting Aedes aegypti and Aedes albopictus: Risk Factors for Arbovirus Pandemics. Vector-Borne and Zoonotic Diseases. 20 (2), 71-81 (2020).
- Liu-Helmersson, J., Brannstrom, A., Sewe, M. O., Semenza, J. C., Rocklov, J. Estimating Past, Present, and Future Trends in the Global Distribution and Abundance of the Arbovirus Vector Aedes aegypti Under Climate Change Scenarios. Fronters in Public Health. 7, 148 (2019).
- Cai, W., et al. The 2021 China report of the Lancet Countdown on health and climate change: seizing the window of opportunity. Lancet Public Health. 6 (12), 932-947 (2021).
- Chan, K. K., Auguste, A. J., Brewster, C. C., Paulson, S. L. Vector competence of Virginia mosquitoes for Zika and Cache Valley viruses. Parasites & Vectors. 13 (1), 188 (2020).
- Kumar, A., et al. Mosquito Innate Immunity. Insects. 9 (3), (2018).
- Franz, A. W., Kantor, A. M., Passarelli, A. L., Clem, R. J. Tissue Barriers to Arbovirus Infection in Mosquitoes. Viruses. 7 (7), 3741-3767 (2015).
- Xia, H., et al. Characterization of Ebinur Lake Virus and Its Human Seroprevalence at the China-Kazakhstan Border. Frontiers in Microbiology. 10, (2020).
- Baer, A., Kehn-Hall, K. Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems. Jove-Journal of Visualized Experiments. (93), e52065 (2014).
- Xu, M. Y., Liu, S. Q., Deng, C. L., Zhang, Q. Y., Zhang, B. Detection of Zika virus by SYBR green one-step real-time RT-PCR. Journal of Virological Methods. 236, 93-97 (2016).
- Yang, C., et al. Vector competence and transcriptional response of Aedes aegypti for Ebinur Lake virus, a newly mosquito-borne orthobunyavirus. bioRxiv. , (2022).
- Britton, S., et al. Laboratory-acquired dengue virus infection–a case report. PLOS Neglected Tropical Diseases. 5 (11), 1324 (2011).
- Weger-Lucarelli, J., et al. Vector Competence of American Mosquitoes for Three Strains of Zika Virus. PLOS Neglected Tropical Diseases. 10 (10), 0005101 (2016).
- Elizondo-Quiroga, D., et al. Vector competence of Aedes aegypti and Culex quinquefasciatus from the metropolitan area of Guadalajara, Jalisco, Mexico for Zika virus. Scientific reports. 9 (1), 16955 (2019).
