En este protocolo, describimos cómo preparar células de mamíferos para el análisis proteómico unicelular mediante espectrometría de masas utilizando reactivos y equipos disponibles comercialmente, con opciones para pipeteo manual y automático.
El análisis proteómico unicelular requiere métodos sensibles, cuantitativamente precisos, ampliamente accesibles y robustos. Para cumplir con estos requisitos, el protocolo Single-Cell ProtEomics (SCoPE2) se desarrolló como un método de segunda generación para cuantificar cientos o miles de proteínas de muestras limitadas, hasta el nivel de una sola célula. Los experimentos que utilizan este método han logrado cuantificar más de 3.000 proteínas en 1.500 células de mamíferos individuales (500-1.000 proteínas por célula) en 10 días de tiempo de instrumento de espectrómetro de masas. SCoPE2 aprovecha un ciclo de congelación y calor para la lisis celular, evitando la necesidad de limpiar celdas individuales y, en consecuencia, reduciendo las pérdidas de muestra, al tiempo que acelera la preparación de muestras y simplifica su automatización. Además, el método utiliza un portador isobárico, que ayuda a la identificación de proteínas y reduce las pérdidas de muestra.
Este protocolo de video proporciona una guía detallada para permitir la adopción del análisis automatizado de proteínas unicelulares utilizando solo equipos y reactivos que son ampliamente accesibles. Demostramos pasos críticos en el procedimiento de preparación de células individuales para el análisis proteómico, desde la recolección hasta la inyección y el análisis de cromatografía líquida y espectrometría de masas en tándem (LC-MS / MS). Además, los espectadores son guiados a través de los principios del diseño experimental con el portador isobárico, el control de calidad para las preparaciones de portador isobárico y de una sola célula, y los resultados representativos con una discusión de las limitaciones del enfoque.
El análisis unicelular es ampliamente utilizado para estudiar el nivel de heterogeneidad dentro de los sistemas biológicos que de otro modo serían indiscernibles por mediciones masivas 1,2,3. Tal diversidad celular puede tener consecuencias funcionales que pueden promover la comprensión de los procesos biológicos integrales, desde la resistencia terapéutica de las células cancerosas 4,5,6 hasta la heterogeneidad de célula a célula en la diabetes 7,8,9,10. Muchas investigaciones se han centrado en la medición de ácidos nucleicos en células individuales, mediante la medición de niveles genéticos o transcriptómicos y han permitido la clasificación de tipos y estados celulares. Sin embargo, tal progreso en el espacio de los ácidos nucleicos no puede llenar el vacío de conocimiento de la regulación post-transcripcional11, impulsando la necesidad de mediciones de proteínas de alto rendimiento similares en células individuales12,13,14,15.
Hemos desarrollado SCoPE216,17 para abordar la demanda de proteómica unicelular rigurosa y robusta de sistemas de mamíferos. Es un método multiplexado, que permite un mayor rendimiento al etiquetar y analizar muchas celdas en paralelo18, en contraste con los mthods sin etiqueta que analizan una celda a la vez19,20. La metodología de preparación de muestras, el enfoque de espectrometría de masas y los pasos posteriores de análisis de datos permiten una cuantificación precisa de cientos a miles de proteínas por célula individual. Este método hace posible el análisis por espectrometría de masas de células individuales a través del portador isobárico21, una pequeña muestra masiva de células (generalmente 25-200) que es biológicamente similar a la población unicelular de interés. Este material portador se multiplexa en un conjunto con un canal de referencia del mismo material y celdas individuales mediante el uso de etiquetas de masa en tándem (etiquetas TMT). El canal portador reduce la pérdida de muestras en las áreas de superficie y proporciona los fragmentos de la columna vertebral de iones para una identificación exitosa del péptido. El canal de referencia, que se prepara a granel y posteriormente se diluye hasta 5-10 equivalentes de celda para cada conjunto de una sola celda, ayuda a controlar la variabilidad técnica en el análisis. Específicamente, la referencia permite la normalización de la variabilidad causada por los efectos relacionados con LC-MS / MS, como el muestreo de iones y las eficiencias de ionización. Por lo general, los canales de referencia y portadores están hechos de la misma población celular.
Este protocolo de preparación de muestras es un método de segunda generación basado en SCoPE-MS22 mediante múltiples mejoras sinérgicas. Las mejoras incluyen un método de lisis celular que evita la limpieza de la muestra, que es un paso común de las preparaciones de proteómica de la EM. Utiliza mPOP (minimum ProteOmic sample Preparation)23, que es un método de lisis por congelación-calor. Este método permitió la lisis de celdas individuales en volúmenes más pequeños y en placas de múltiples pocillos en lugar de en viales, lo que facilitó una mayor tasa de rendimiento y automatización por parte de los termocicladores. En conjunto, este método ha reducido el costo por celda individual y ha aumentado la precisión cuantitativa en comparación con SCoPE-MS 16,24.
Este protocolo describe cómo preparar células individuales para el análisis proteómico, incluida la forma de preparar el portador y los canales de referencia utilizando etiquetas isobáricas TMTpro 18-plex. Las células de mamíferos que están en suspensión de una sola célula y que pueden aislarse en placas de 384 pocillos probablemente sean susceptibles a este protocolo. También se incluyen resultados representativos de conjuntos exitosos de una sola celda, que muestran varias gráficas de control de calidad generadas por una aplicación R Shiny, DO-MS25. Otras herramientas de software publicadas 26,27 y directrices experimentales 17,21 han mejorado la adopción de este protocolo. Esperamos que esta guía visual ayude aún más a los investigadores a realizar experimentos de proteómica unicelular.
Una de las claves para una preparación y análisis exitosos de células individuales por SCoPE2 es la preparación de los canales portadores y de referencia. El tamaño de portador sugerido es de 100 a 200 celdas; Sin embargo, el número de células necesarias para un experimento particular de una sola célula puede determinarse sobre la base de los principios que se discuten en otra parte21. Para el tamaño sugerido, se necesitan al menos ~ 11,275 celdas por placa de 384 pocillos, lo que permite un portador de 200 celdas y una referencia de 5 celdas en cada conjunto. Puede ser ventajoso aislar más células si las poblaciones celulares deseadas no son un factor limitante, simplemente tener material extra en caso de errores (como se hizo en este protocolo, aislando 22,000 células en lugar de 11,275 células). La cantidad de portador y referencia necesaria para el número de placas deseadas debe prepararse en un solo lote para minimizar cualquier variación de lote a lote que pueda causar que la identificación o cuantificación de péptidos difiera entre lotes.
Antes de aislar celdas individuales en pozos de una placa de 384 pocillos, es importante considerar el diseño de la disposición de la placa. Dentro de cada placa de 384 pocillos, se recomienda implementar controles positivos y negativos. Los controles negativos son pozos en los que no se agregan células, sino que se someten a las mismas adiciones y procedimientos de reactivos que los pocillos unicelulares. Los controles positivos son pocillos en los que se agrega lisado celular diluido a 2-5 células/μL en lugar de células individuales. Esto es particularmente importante de implementar cuando los métodos de aislamiento de una sola célula no están bien validados. Cada placa de 384 pocillos idealmente debe tener una distribución aleatoria de celdas individuales y controles (por ejemplo, no tener controles negativos o positivos en una sola fila). Cada placa debe tener una distribución equitativa de todas las poblaciones celulares de interés, en lugar de aislar un tipo de célula en una placa y un segundo tipo de célula en una segunda placa. Esto evitará vincular los efectos por lotes con los tipos de células de interés. Además, si se necesita más de una placa de 384 pocillos para el análisis, es aconsejable aislar las células en una sola sesión, en lugar de extender el paso de aislamiento durante varios días, si es posible.
La lisis tanto de células individuales como de portador/referencia tiene lugar en agua a través de un ciclo de congelación-calor23. Se anticipa que la mayoría de las proteasas han sido desnaturalizadas durante este paso. La tripsina se agrega inmediatamente después del paso de desnaturalización a una concentración alta, muchos órdenes de magnitud mayor en concentración que incluso las proteasas celulares más abundantes. Por acción masiva, la mayoría de los productos de actividad proteasa se deberán a la tripsina.
La reducción/alquilación de residuos de cisteína no se realiza en este protocolo antes de la digestión de tripsina. Los péptidos que contienen cisteína representan aproximadamente el 10% de los péptidos trípticos del proteoma humano. Observamos menos péptidos que contienen cisteína utilizando un enfoque sin reducción/alquilación. Estos pasos utilizan reactivos que son incompatibles con el etiquetado por TMT (química de ésteres NHS) inmediatamente después de la digestión.
En esta estrategia de etiquetado TMT, el portador y las referencias se etiquetan con 126 y 127N, respectivamente, mientras que los pozos de celda única y control se etiquetan con 128C a 135N. Las dos etiquetas después de la referencia, 127C y 128N, no se utilizan debido a la contaminación cruzada isotópica derivada de los canales portador y de referencia, que son claramente mucho más abundantes en material peptídico que las células individuales. En total, hay 12 canales TMT por conjunto que se pueden usar para etiquetar celdas individuales o pocillos de control con TMTpro-16plex, o 14 canales TMT por conjunto con TMTpro-18plex.
Los pasos críticos en el protocolo para realizar mediciones de proteómica de una sola célula utilizando este protocolo incluyen la preparación del portador, el aislamiento de una sola célula, la lisis, la digestión, el etiquetado de códigos de barras y los parámetros adecuados de espectrometría de masas. Estos pasos se han esbozado en este documento y se han detallado ampliamente en otra parte 17,21,25. Cada paso tiene una gráfica correspondiente o conjunto de parcelas en DO-MS que permiten un fácil control de calidad. Por ejemplo, en el caso de la creación exitosa del portador, las gráficas que representan el número de péptidos identificados, la eficiencia del etiquetado y el porcentaje de tasa de escisión permiten verificar su preparación exitosa. Los informes representativos de DO-MS están incluidos en esta publicación y pueden verse en http://scope2.slavovlab.net/ para los datos originales16. Estos informes DO-MS permiten evaluar la optimización del método en direcciones aún no investigadas por los autores, como gradientes LC más largos, diferentes enzimas de digestión o códigos de barras químicos alternativos.
Actualmente, el análisis en serie de péptidos mediante algoritmos de adquisición dependientes de datos limita el número de péptidos que se pueden analizar en una ejecución de LC de una longitud razonable. Esto se debe en parte a los tiempos de llenado más largos requeridos para la adquisición exitosa de suficientes iones para una cuantificación confiable de una sola célula21. Una limitación inherente al uso del portador es la falta de evaluación directa de la digestión y la eficiencia de etiquetado de las células individuales. Actualmente, una solución a esta limitación es realizar un control de calidad en una muestra más grande procesada junto con las células individuales.
Propusimos una serie de oportunidades para mejorar la proteómica unicelular, como la construcción de espectrómetros de masas con múltiples analizadores. El método actual permite la cuantificación de miles de proteínas de células de mamíferos individuales a una velocidad de aproximadamente 100 células por día con reactivos y equipos disponibles comercialmente. SCoPE2, la segunda generación del enfoque SCoPE-MS, mejoró significativamente su predecesor con respecto al número de células analizables por unidad de tiempo, el número de proteínas analizables por unidad de tiempo, el tiempo necesario para la preparación de muestras, la accesibilidad de reactivos y equipos, y el costo total de preparación y análisis por célula individual. Las proteínas unidas a la membrana son accesibles utilizando la lisis por congelación y calor y la digestión de la proteasa, como se muestra en comparación con la lisis de urea23. El método identifica muchas proteínas del tercio superior del proteoma con respecto a la abundancia16. Si el proteoformo modificado está en el tercio superior del proteoma, y el péptido modificado es susceptible de análisis de espectrometría de masas (ioniza bien, tiene una diferencia de masa con respecto al péptido no modificado), es más probable que sea susceptible a este protocolo. Este método puede aplicarse fructíferamente en sistemas biológicos donde existe una heterogeneidad significativa entre las células, como en la diferenciación, la senescencia o las respuestas inmunológicas (es decir, fagocitosis).
The authors have nothing to disclose.
Nos gustaría reconocer el premio Fall 2021 NSF I-Corps Program (sitio de Northeastern University) que ha financiado esta publicación.
384-well plate, standard PCR plate | Thermo Fisher Scientific | AB1384 | Polypropylene plates should be used, if need to substitute. If substituted, levels of potential polymer contamination from other plates should be assessed prior to SCoPE2 preparation. |
Acetonitrile (for preparation of buffers), Optima LC-MS/MS grade | Fisher Scientific | A955-1 | This acetonitrile is used for any buffers, namely the 50% acetonitrile that is used to pass through wells after passing through the carrier and reference when combining SCoPE2 sets. Caution: Acetonitrile is a flammable liquid. It can irritate skin, eyes, respiratory tract, and central nervous system. Be sure to wear personal protective equipment. Handle under a chemical fume hood. |
Acetonitrile (for preparation of TMT ), anhydrous, 99.8% | Sigma Aldrich | 271004-100ML | This acetonitrile is used to resuspend TMT labels at the manufacturer concentration. Caution: Acetonitrile is a flammable liquid. It can irritate skin, eyes, respiratory tract, and central nervous system. Be sure to wear personal protective equipment. Handle under a chemical fume hood. |
Adhesive PCR plate foils | Thermo Fisher Scientific | AB0626 | |
Autosampler vial screw thread caps | Thermo Fisher Scientific | C5000-51B | |
Autosampler vial spinner (i.e. myFuge 5) | MTC Bio | C2595 | This model does not have any speed control. It is simply used to colelct liquid at the bottom of autosampler vials. |
Benzonase nuclease | Sigma Aldrich | E1014-25KU | |
Clear glass screw thread vials, 9 mm | Thermo Fisher Scientific | 60180-509 | |
Formic Acid, Pierce, LC-MS/MS grade | Thermo Fisher Scientific | 85178 | Caution: Formic acid is a flammable liquid. It can cause serious eye damage or skin burns. Be sure to wear personal protective equipment. Handle in a well-ventilated area. |
Glass autosampler inserts, 9 mm | Thermo Fisher Scientific | C4010-630 | |
Hydroxylamine (HA), 50% wt/vol | Sigma Aldrich | 467804-50ML | Caution: Hydroxylamine can cause skin irritation. Be sure to wear personal protective equipment. |
Mantis microfluidic chips, low-volume 3PFE chips | Formulatrix | MCLVPR2 | These chips are meant to be used with the Mantis microfluidics liquid handler to dispense organic solutions. These can be used to dispense TMT labels. |
Mantis microfluidic chips, low-volume silicone chips | Formulatrix | MCLVS12 | These chips are meant to be used with the Mantis microfluidics liquid handler to dispense aqueous solutions. These cannot be used to dispense TMT labels. |
Mantis microfluidic liquid handler | Formulatrix | Liquid handler can be substituted. However, it is important to check if the system is compatible with 100% acetonitrile (as in the case of TMT labels), and that the system does not introduce polymer contamination or other type of contamination into the samples. | |
Mantis PCR plate adapter with wide conical pins for automated plate handling | Formulatrix | 232400 | |
MassPREP peptide mixture | Waters | 186002337 | Mixture of nine nontryptic peptides |
PCR tube spinner (i.e., 16-place microcentrifuge for 0.2 mL tubes) | USA Scientific | 2621-0016 | This model does not have any speed control. It is simply used to collect liquid at the bottom of tubes. |
PCR tubes: TempAssure 0.2 mL PCR 8-tube strips | USA Scientific | 1402-3900 | If substituted, levels of potential polymer contamination from other plates should be assessed prior to SCoPE2 preparation. |
Phosphate-buffered saline (PBS), 10x, pH 7.4, RNase-free | Thermo Fisher Scientific | AM9625 | |
Plate spinner (i.e., PlateFuge microcentrifuge) | Benchmark Scientific | Model C2000 | This model does not have any speed control. It is simply used to collect liquid at the bottom of wells. |
Thermal Cycler (i.e., C1000 Touch with 384-well module) | Biorad | 1851138 | |
TMTpro 16plex Label Reagent Set, 1 x 5 mg | Thermo Fisher Scientific | A44520 | |
Triethylammonium bicarbonate (TEAB), 1 M, pH 8.5 | Sigma Aldrich | T7408100ML | |
Trypsin Gold Mass Spectrometry Grade | Promega | V5280 | This is trypsin is of very high purity. Other trypsin reagents can vary in their levels of purity. Level of purity is important for achieving positive SCoPE2 results. Caution: Trypsin can cause skin, respiratory, and eye irritation. Be sure to wear personal protective equipment. Handle under a chemical fume hood. |
Vortex (Analog vortex mixer) | VWR | Model 58816-121 | |
Water bath sonicator (i.e., 2.8 L ultrasonic cleaner with digital timer) | VWR | 97043964 | |
Water, Optima LC-MS/MS grade | Fisher Scientific | W6-1 | All solutions that need to be diluted or made are recommended to be made with mass-spectrometry grade water. Any dilutions and/or master mixes should be made fresh. Contamination resulting from lower-grade water can negatively affect peptide detection and single-cell data quality . |