Подготовка одноклеточной протеомики к масс-спектрометрическому анализу с использованием лизиса Freeze-Heat и изобарического носителя
Summary
В этом протоколе мы описываем, как подготовить клетки млекопитающих к одноклеточному протеомическому анализу с помощью масс-спектрометрии с использованием коммерчески доступных реагентов и оборудования с опциями как ручного, так и автоматического пипетирования.
Abstract
Анализ одноклеточной протеомики требует чувствительных, количественно точных, широко доступных и надежных методов. Для удовлетворения этих требований был разработан протокол Single-Cell ProtEomics (SCoPE2) в качестве метода количественной оценки от сотен до тысяч белков из ограниченных образцов до уровня одной клетки. Эксперименты с использованием этого метода достигли количественной оценки более 3000 белков в 1 500 одиночных клетках млекопитающих (500-1000 белков на клетку) за 10 дней измерения масс-спектрометра. SCoPE2 использует цикл замораживания-нагрева для лизиса клеток, устраняя необходимость очистки отдельных ячеек и, следовательно, снижая потери образца, одновременно ускоряя подготовку образца и упрощая его автоматизацию. Кроме того, в методе используется изобарический носитель, который помогает идентификации белка и снижает потери образцов.
Этот видеопротокол предоставляет подробное руководство, позволяющее принять автоматизированный анализ одноклеточных белков с использованием только оборудования и реагентов, которые широко доступны. Мы демонстрируем критические этапы в процедуре подготовки отдельных клеток к протеомному анализу, от сбора до инъекций и анализа жидкостной хроматографии-тандемной масс-спектрометрии (LC-MS/MS). Кроме того, зрители ориентируются на принципы экспериментального проектирования с изобарическим носителем, контроль качества как изобарических носителей, так и одноклеточных препаратов, а также репрезентативные результаты с обсуждением ограничений подхода.
Introduction
Одноклеточный анализ широко используется для изучения уровня гетерогенности в биологических системах, который в противном случае был бы неразличим по объемным измерениям 1,2,3. Такое клеточное разнообразие может иметь функциональные последствия, которые могут способствовать пониманию интегральных биологических процессов, от терапевтической резистентности раковых клеток 4,5,6 до межклеточной гетерогенности при диабете 7,8,9,10. Многие исследования были сосредоточены на измерении нуклеиновых кислот в отдельных клетках путем измерения генетических или транскриптомных уровней и позволили классифицировать типы клеток и состояния. Однако такой прогресс в пространстве нуклеиновых кислот не может заполнить пробел в знаниях посттранскрипционной регуляции11, что обуславливает необходимость аналогичных высокопроизводительных измерений белка в отдельных клетках 12,13,14,15.
Мы разработали SCoPE216,17 для удовлетворения спроса на строгую и надежную одноклеточную протеомику систем млекопитающих. Это мультиплексированный метод, позволяющий увеличить пропускную способность путем маркировки и анализа многих ячеек параллельно18, в отличие от mthods без меток, которые анализируют одну ячейку в моментвремени 19,20. Методология подготовки образцов, подход масс-спектрометрии и последующие этапы анализа данных позволяют точно количественно оценить от сотен до тысяч белков на одну клетку. Этот метод делает возможным масс-спектрометрический анализ отдельных клеток через изобарический носитель21, небольшой объемный образец клеток (обычно 25-200), который биологически похож на интересующую одноклеточную популяцию. Этот материал-носитель мультиплексируется в набор с опорным каналом из того же материала и одиночных ячеек с помощью тандемных масс-меток (меток ТМТ). Канал-носитель уменьшает потери образца на поверхности и обеспечивает фрагменты ионной основы для успешной идентификации пептидов. Эталонный канал, который готовится навалом и впоследствии разбавляется до 5-10 клеточных эквивалентов для каждого одноэлементного набора, помогает контролировать техническую изменчивость в анализе. В частности, эталон позволяет нормализовать изменчивость, вызванную эффектами, связанными с LC-MS/MS, такими как отбор ионов и эффективность ионизации. Обычно эталонный и несущий каналы производятся из одной и той же клеточной популяции.
Этот протокол пробоподготовки представляет собой метод второго поколения, основанный на SCoPE-MS22 путем многочисленных синергетических улучшений. Улучшения включают метод лизиса клеток, который позволяет избежать очистки образца, что является распространенным этапом препаратов протеомики MS. Он использует mPOP (минимальная протеомическая подготовка образца)23, которая представляет собой метод лизиса с замораживанием тепла. Этот метод позволил лизировать отдельные ячейки в меньших объемах и в многоскважинных пластинах, а не во флаконах, что способствовало более высокой пропускной способности и автоматизации тепловыми циклодерами. В целом, этот метод снизил стоимость одной ячейки и повысил количественную точность по сравнению с SCoPE-MS16,24.
Этот протокол описывает, как подготовить отдельные клетки для протеомного анализа, в том числе как подготовить носитель и эталонные каналы с использованием 18-плексных изобарических меток TMTpro. Клетки млекопитающих, которые находятся в одноклеточной суспензии и которые могут быть выделены в 384-луночные пластины, вероятно, поддаются этому протоколу. Также включены репрезентативные результаты успешных одноклеточных наборов, отображающих несколько графиков контроля качества, сгенерированных приложением R Shiny, DO-MS25. Другие опубликованные программные средства 26,27 и экспериментальные руководящие принципы17,21 улучшили принятие этого протокола. Мы надеемся, что это визуальное руководство в дальнейшем поможет исследователям проводить эксперименты по одноклеточной протеомике.
Protocol
Representative Results
Discussion
Одним из залогов успешной подготовки и анализа одиночных клеток SCoPE2 является подготовка несущего и референсного каналов. Рекомендуемый размер носителя составляет от 100 до 200 клеток; однако количество клеток, необходимое для конкретного одноклеточного эксперимента, может быть определено на основе принципов, обсуждаемых в другом месте21. Для предполагаемого размера необходимо, по крайней мере, ~ 11 275 ячеек на пластину с 384 лунками, что позволяет использовать 200-элементный носитель и 5-элементный эталон в каждом наборе. Может быть выгодно изолировать больше клеток, если желаемые клеточные популяции не являются ограничивающим фактором, просто иметь дополнительный материал в случае ошибок (как это было сделано в этом протоколе, изолируя 22 000 клеток вместо 11 275 клеток). Количество носителя и эталона, необходимое для количества желаемых пластин, должно быть подготовлено в одной партии, чтобы свести к минимуму любые вариации между партиями, которые могут привести к различию идентификации или количественной оценки пептидов между партиями.
Перед выделением одиночных ячеек в скважины из 384-луночной плиты важно рассмотреть конструкцию компоновки плиты. В пределах каждой плиты на 384 скважины рекомендуется осуществлять как положительный, так и отрицательный контроль. Отрицательные контрольные элементы – это скважины, в которые не добавляются клетки, но подвергаются тем же добавлениям и процедурам реагентов, что и одноклеточные скважины. Положительными контрольными элементами являются колодцы, в которые добавляют клеточный лизат, разбавленный до 2-5 клеток/мкл, вместо одиночных клеток. Это особенно важно реализовать, когда методы изоляции одной ячейки недостаточно проверены. Каждая 384-луночная пластина в идеале должна иметь рандомизированное распределение одиночных ячеек и элементов управления (например, не иметь отрицательных или положительных элементов управления в одном ряду). Каждая пластина должна иметь равное распределение всех интересующих популяций клеток, а не выделять один тип клеток в одной пластине и второй тип клеток во второй пластине. Это позволит избежать связывания пакетных эффектов с типами клеток, представляющих интерес. Кроме того, если для анализа необходимо более одной 384-луночной пластины, целесообразно изолировать клетки за один сеанс, а не распределять ступень изоляции на несколько дней, если это возможно.
Лизис как одиночных ячеек, так и носителя/эталона происходит в воде через цикл замораживания-нагрева23. Ожидается, что большинство протеаз были денатурированы на этом этапе. Затем трипсин добавляют сразу после стадии денатурации в высокой концентрации, на много порядков большей по концентрации, чем даже самые распространенные клеточные протеазы. По массовому действию большинство продуктов протеазной активности будет обусловлено трипсином.
Восстановление/алкилирование остатков цистеина не проводится в этом протоколе до переваривания трипсина. Цистеинсодержащие пептиды составляют примерно 10% триптических пептидов из протеома человека. Мы наблюдаем меньше цистеинсодержащих пептидов, используя подход без восстановления/алкилирования. На этих этапах используются реагенты, которые несовместимы с маркировкой TMT (NHS-эфирная химия) сразу после пищеварения.
В этой стратегии маркировки TMT носитель и ссылки маркируются 126 и 127N соответственно, в то время как одноэлементные и контрольные скважины маркируются от 128C до 135N. Две метки после ссылки, 127C и 128N, не используются из-за изотопного перекрестного загрязнения, возникающего из каналов носителя и эталонного канала, которые явно гораздо более распространены в пептидном материале, чем одиночные клетки. В общей сложности существует 12 каналов TMT на комплект, которые могут быть использованы для маркировки отдельных ячеек или контрольных скважин с помощью TMTpro-16plex, или 14 каналов TMT на комплект с TMTpro-18plex.
Критические этапы в протоколе для выполнения одноклеточных протеомических измерений с использованием этого протокола включают подготовку носителя, изоляцию одной клетки, лизис, пищеварение, маркировку штрих-кода и надлежащие параметры масс-спектрометрии. Эти шаги были изложены в настоящем документе и подробно описаны в других разделах 17,21,25. Каждый шаг имеет соответствующий участок или набор графиков в DO-MS, которые позволяют легко контролировать качество. Например, в случае успешного создания носителя графики, изображающие количество идентифицированных пептидов, эффективность маркировки и процент скорости неправильного расщепления, позволяют проверить его успешную подготовку. Репрезентативные доклады ДО-МС включены в эту публикацию и могут быть просмотрены на http://scope2.slavovlab.net/ для исходных данных16. Эти отчеты DO-MS позволяют оценить оптимизацию метода в направлениях, еще не исследованных авторами, таких как более длинные градиенты LC, различные ферменты пищеварения или альтернативные химические штрих-коды.
В настоящее время последовательный анализ пептидов с помощью алгоритмов сбора данных ограничивает количество пептидов, которые могут быть проанализированы в LC-прогоне разумной длины. Отчасти это связано с более длительным временем заполнения, необходимым для успешного получения достаточного количества ионов для надежной одноэлементной количественной оценки21. Неотъемлемым ограничением использования носителя является отсутствие прямой оценки эффективности пищеварения и маркировки отдельных клеток. В настоящее время одним из решений этого ограничения является выполнение контроля качества на более крупном образце, обработанном вместе с одиночными ячейками.
Мы предложили ряд возможностей для улучшения одноклеточной протеомики, таких как построение масс-спектрометров с несколькими анализаторами. Текущий метод позволяет количественно оценить тысячи белков из одиночных клеток млекопитающих со скоростью около 100 клеток в день с помощью коммерчески доступных реагентов и оборудования. SCoPE2, второе поколение подхода SCoPE-MS, значительно улучшило своего предшественника в отношении количества клеток, анализируемых в единицу времени, количества белков, анализируемых в единицу времени, времени, необходимого для подготовки образцов, доступности реагентов и оборудования, а также общей стоимости подготовки и анализа на одну клетку. Мембранно-связанные белки доступны при использовании лизиса замораживания тепла и сбраживания протеазы, как показано в сравнении с лизисом мочевины23. Метод идентифицирует многие белки из верхней трети протеома относительно обилия16. Если модифицированный протеоформ находится в верхней трети протеома, а модифицированный пептид поддается масс-спектрометрическому анализу (хорошо ионизируется, имеет разницу в массе от немодифицированного пептида), он, скорее всего, будет поддаваться этому протоколу. Этот метод может быть плодотворно применен в биологических системах, где существует значимая гетерогенность между клетками, например, при дифференцировке, старении или иммунологических реакциях (т. Е. Фагоцитоз).
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы отметить награду NSF I-Corps Program осенью 2021 года (сайт Северо-Восточного университета), которая финансировала эту публикацию.
Materials
| 384-well plate, standard PCR plate | Thermo Fisher Scientific | AB1384 | Polypropylene plates should be used, if need to substitute. If substituted, levels of potential polymer contamination from other plates should be assessed prior to SCoPE2 preparation. |
| Acetonitrile (for preparation of buffers), Optima LC-MS/MS grade | Fisher Scientific | A955-1 | This acetonitrile is used for any buffers, namely the 50% acetonitrile that is used to pass through wells after passing through the carrier and reference when combining SCoPE2 sets. Caution: Acetonitrile is a flammable liquid. It can irritate skin, eyes, respiratory tract, and central nervous system. Be sure to wear personal protective equipment. Handle under a chemical fume hood. |
| Acetonitrile (for preparation of TMT ), anhydrous, 99.8% | Sigma Aldrich | 271004-100ML | This acetonitrile is used to resuspend TMT labels at the manufacturer concentration. Caution: Acetonitrile is a flammable liquid. It can irritate skin, eyes, respiratory tract, and central nervous system. Be sure to wear personal protective equipment. Handle under a chemical fume hood. |
| Adhesive PCR plate foils | Thermo Fisher Scientific | AB0626 | |
| Autosampler vial screw thread caps | Thermo Fisher Scientific | C5000-51B | |
| Autosampler vial spinner (i.e. myFuge 5) | MTC Bio | C2595 | This model does not have any speed control. It is simply used to colelct liquid at the bottom of autosampler vials. |
| Benzonase nuclease | Sigma Aldrich | E1014-25KU | |
| Clear glass screw thread vials, 9 mm | Thermo Fisher Scientific | 60180-509 | |
| Formic Acid, Pierce, LC-MS/MS grade | Thermo Fisher Scientific | 85178 | Caution: Formic acid is a flammable liquid. It can cause serious eye damage or skin burns. Be sure to wear personal protective equipment. Handle in a well-ventilated area. |
| Glass autosampler inserts, 9 mm | Thermo Fisher Scientific | C4010-630 | |
| Hydroxylamine (HA), 50% wt/vol | Sigma Aldrich | 467804-50ML | Caution: Hydroxylamine can cause skin irritation. Be sure to wear personal protective equipment. |
| Mantis microfluidic chips, low-volume 3PFE chips | Formulatrix | MCLVPR2 | These chips are meant to be used with the Mantis microfluidics liquid handler to dispense organic solutions. These can be used to dispense TMT labels. |
| Mantis microfluidic chips, low-volume silicone chips | Formulatrix | MCLVS12 | These chips are meant to be used with the Mantis microfluidics liquid handler to dispense aqueous solutions. These cannot be used to dispense TMT labels. |
| Mantis microfluidic liquid handler | Formulatrix | Liquid handler can be substituted. However, it is important to check if the system is compatible with 100% acetonitrile (as in the case of TMT labels), and that the system does not introduce polymer contamination or other type of contamination into the samples. | |
| Mantis PCR plate adapter with wide conical pins for automated plate handling | Formulatrix | 232400 | |
| MassPREP peptide mixture | Waters | 186002337 | Mixture of nine nontryptic peptides |
| PCR tube spinner (i.e., 16-place microcentrifuge for 0.2 mL tubes) | USA Scientific | 2621-0016 | This model does not have any speed control. It is simply used to collect liquid at the bottom of tubes. |
| PCR tubes: TempAssure 0.2 mL PCR 8-tube strips | USA Scientific | 1402-3900 | If substituted, levels of potential polymer contamination from other plates should be assessed prior to SCoPE2 preparation. |
| Phosphate-buffered saline (PBS), 10x, pH 7.4, RNase-free | Thermo Fisher Scientific | AM9625 | |
| Plate spinner (i.e., PlateFuge microcentrifuge) | Benchmark Scientific | Model C2000 | This model does not have any speed control. It is simply used to collect liquid at the bottom of wells. |
| Thermal Cycler (i.e., C1000 Touch with 384-well module) | Biorad | 1851138 | |
| TMTpro 16plex Label Reagent Set, 1 x 5 mg | Thermo Fisher Scientific | A44520 | |
| Triethylammonium bicarbonate (TEAB), 1 M, pH 8.5 | Sigma Aldrich | T7408100ML | |
| Trypsin Gold Mass Spectrometry Grade | Promega | V5280 | This is trypsin is of very high purity. Other trypsin reagents can vary in their levels of purity. Level of purity is important for achieving positive SCoPE2 results. Caution: Trypsin can cause skin, respiratory, and eye irritation. Be sure to wear personal protective equipment. Handle under a chemical fume hood. |
| Vortex (Analog vortex mixer) | VWR | Model 58816-121 | |
| Water bath sonicator (i.e., 2.8 L ultrasonic cleaner with digital timer) | VWR | 97043964 | |
| Water, Optima LC-MS/MS grade | Fisher Scientific | W6-1 | All solutions that need to be diluted or made are recommended to be made with mass-spectrometry grade water. Any dilutions and/or master mixes should be made fresh. Contamination resulting from lower-grade water can negatively affect peptide detection and single-cell data quality . |
References
- Symmons, O., Raj, A. What’s luck got to do with it: single cells, multiple fates, and biological nondeterminism. Molecular Cell. 62 (5), 788-802 (2016).
- Paul, I., White, C., Turcinovic, I., Emili, A. Imaging the future: the emerging era of single-cell spatial proteomics. The FEBS Journal. 288 (24), 6990-7001 (2020).
- Levy, E., Slavov, N. Single cell protein analysis for systems biology. Essays in Biochemistry. 62 (4), 595-605 (2018).
- Nagasawa, S., Kashima, Y., Suzuki, A., Suzuki, Y. Single-cell and spatial analyses of cancer cells: toward elucidating the molecular mechanisms of clonal evolution and drug resistance acquisition. Inflammation and Regeneration. 41 (1), 22 (2021).
- Shaffer, S. M., et al. Rare cell variability and drug-induced reprogramming as a mode of cancer drug resistance. Nature. 555 (7695), 274 (2018).
- Pan, D., Jia, D. Application of single-cell multi-omics in dissecting cancer cell plasticity and tumor heterogeneity. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 757024 (2021).
- Segerstolpe, &. #. 1. 9. 7. ;., et al. Single-cell transcriptome profiling of human pancreatic islets in health and type 2 diabetes. Cell Metabolism. 24 (4), 593-607 (2016).
- Tritschler, S., Theis, F. J., Lickert, H., Böttcher, A. Systematic single-cell analysis provides new insights into heterogeneity and plasticity of the pancreas. Molecular Metabolism. 6 (9), 974-990 (2017).
- Hanna, S. J., Tatovic, D., Thayer, T. C., Dayan, C. M. Insights from single cell rna sequencing into the immunology of type 1 diabetes- cell phenotypes and antigen specificity. Frontiers in Immunology. 12, 751701 (2021).
- Baron, M., et al. A single-cell transcriptomic map of the human and mouse pancreas reveals inter- and intra-cell population structure. Cell Systems. 3 (4), 346-360 (2016).
- Franks, A., Airoldi, E., Slavov, N. Post-transcriptional regulation across human tissues. PLoS Computational Biology. 13 (5), 1005535 (2017).
- Slavov, N. Unpicking the proteome in single cells. Science. 367 (6477), 512-513 (2020).
- Specht, H., Slavov, N. Transformative opportunities for single-cell proteomics. Journal of Proteome Research. 17 (8), 2565-2571 (2018).
- Slavov, N. Learning from natural variation across the proteomes of single cells. PLoS Biology. , (2021).
- Slavov, N. Driving single cell proteomics forward with innovation. Journal of Proteome Research. 20 (11), 4915-4918 (2021).
- Specht, H., et al. Single-cell proteomic and transcriptomic analysis of macrophage heterogeneity using SCoPE2. Genome Biology. 22 (1), 50 (2021).
- Petelski, A. A., et al. Multiplexed single-cell proteomics using SCoPE2. Nature Protocols. 16 (12), 5398-5425 (2021).
- Slavov, N. Scaling up single-cell proteomics. Molecular and Cellular Proteomics: MCP. 21 (1), 100179 (2022).
- Cong, Y., et al. Ultrasensitive single-cell proteomics workflow identifies> 1000 protein groups per mammalian cell. Chemical Science. 12 (3), 1001-1006 (2021).
- Lombard-Banek, C., et al. In vivo subcellular mass spectrometry enables proteo-metabolomic single-cell systems biology in a chordate embryo developing to a normally behaving tadpole (X. laevis). Angewandte Chemie. 60 (23), 12852-12858 (2021).
- Specht, H., Slavov, N. Optimizing accuracy and depth of protein quantification in experiments using isobaric carriers. Journal of Proteome Research. 20 (1), 880-887 (2020).
- Budnik, B., Levy, E., Harmange, G., Slavov, N. SCoPE-MS: mass spectrometry of single mammalian cells quantifies proteome heterogeneity during cell differentiation. Genome Biology. 19 (1), 161 (2018).
- Specht, H., Harmange, G., Perlman, D. H., Emmott, E. Automated sample preparation for high-throughput single-cell proteomics. BioRxiv. , (2018).
- Singh, A. Towards resolving proteomes in single cells. Nature Methods. 18 (8), 856 (2021).
- Huffman, R. G., Chen, A., Specht, H., Slavov, N. DO-MS: Data-driven optimization of mass spectrometry methods. Journal of Proteome Research. 18 (6), 2493-2500 (2019).
- Chen, A. T., Franks, A., Slavov, N. DART-ID increases single-cell proteome coverage. PLoS Computational Biology. 15 (7), 1007082 (2019).
- Cheung, T. K., et al. Defining the carrier proteome limit for single-cell proteomics. Nature Methods. 18 (1), 76-83 (2021).
- Leduc, A., Huffman, R. G., Slavov, N. Droplet sample preparation for single-cell proteomics applied to the cell cycle. bioRxiv. , (2021).
- Vanderaa, C., Gatto, L. Utilizing Scp for the analysis and replication of single-cell proteomics data. bioRxiv. , (2021).
