Preparação de Proteômica de Célula Única para Análise de Espectrometria de Massa usando Lise de Calor Congelante e um Transportador Isobárico
Summary
Neste protocolo, descrevemos como preparar células de mamíferos para análise proteômica unicelular via espectrometria de massa usando reagentes e equipamentos comercialmente disponíveis, com opções para pipetagem manual e automática.
Abstract
A análise proteômica de célula única requer métodos sensíveis, quantitativamente precisos, amplamente acessíveis e robustos. Para atender a esses requisitos, o protocolo Single-Cell ProtEomics (SCoPE2) foi desenvolvido como um método de segunda geração para quantificar centenas a milhares de proteínas de amostras limitadas, até o nível de uma única célula. Experimentos usando este método conseguiram quantificar mais de 3.000 proteínas em 1.500 células de mamíferos individuais (500-1.000 proteínas por célula) em 10 dias de tempo de instrumento de espectrômetro de massa. O SCoPE2 aproveita um ciclo de congelamento térmico para lise celular, evitando a necessidade de limpeza de células individuais e, consequentemente, reduzindo as perdas de amostras, ao mesmo tempo em que agiliza a preparação da amostra e simplifica sua automação. Além disso, o método usa um transportador isobárico, que auxilia na identificação de proteínas e reduz as perdas de amostras.
Este protocolo de vídeo fornece orientação detalhada para permitir a adoção de análises automatizadas de proteínas de célula única usando apenas equipamentos e reagentes que são amplamente acessíveis. Demonstramos etapas críticas no procedimento de preparação de células individuais para análise proteômica, desde a colheita até a injeção até a cromatografia líquida – espectrometria de massa em tandem (LC-MS/MS). Além disso, os espectadores são guiados pelos princípios de desenho experimental com o transportador isobárico, controle de qualidade para o transportador isobárico e preparações unicelulares e resultados representativos com uma discussão das limitações da abordagem.
Introduction
A análise unicelular é amplamente utilizada para estudar o nível de heterogeneidade dentro de sistemas biológicos que, de outra forma, seriam indiscerníveis por medições a granel 1,2,3. Essa diversidade celular pode ter consequências funcionais que podem favorecer a compreensão dos processos biológicos integrais, desde a resistência terapêutica das células cancerígenas 4,5,6 até a heterogeneidade célula-a-célula no diabetes 7,8,9,10. Muitas investigações se concentraram na medição de ácidos nucleicos em células individuais, medindo níveis genéticos ou transcriptômicos e permitiram a classificação de tipos e estados celulares. Tal progresso no espaço do ácido nucleico, no entanto, não pode preencher a lacuna de conhecimento da regulação pós-transcricional11, impulsionando a necessidade de medições de proteínas de alto rendimento semelhante em células individuais12,13,14,15.
Desenvolvemos o SCoPE216,17 para atender à demanda por proteômica unicelular rigorosa e robusta de sistemas de mamíferos. É um método multiplexado, permitindo o aumento da produtividade por meio da marcação e análise de muitas células em paralelo18, em contraste com os mthods livres de rótulo que analisam uma célula no momento19,20. A metodologia de preparação da amostra, a abordagem de espectrometria de massa e as etapas subsequentes de análise de dados permitem a quantificação precisa de centenas a milhares de proteínas por célula única. Este método torna possível a análise por espectrometria de massa de células individuais através do transportador isobárico21, uma pequena amostra a granel de células (geralmente 25-200) que é biologicamente semelhante à população de célula única de interesse. Este material transportador é multiplexado em um conjunto com um canal de referência do mesmo material e células individuais através do uso de tags de massa em tandem (etiquetas TMT). O canal transportador reduz a perda de amostra para áreas de superfície e fornece os fragmentos da espinha dorsal do íon para a identificação bem-sucedida do peptídeo. O canal de referência, que é preparado a granel e posteriormente diluído em 5-10 equivalentes celulares para cada conjunto de células únicas, ajuda a controlar a variabilidade técnica na análise. Especificamente, a referência permite a normalização da variabilidade causada por efeitos relacionados ao LC-MS/MS, como amostragem de íons e eficiências de ionização. Normalmente, a referência e os canais portadores são feitos a partir da mesma população celular.
Este protocolo de preparação de amostra é um método de segunda geração baseado no SCoPE-MS22 por meio de múltiplas melhorias sinérgicas. As melhorias incluem um método de lise celular que evita a limpeza da amostra, que é uma etapa comum das preparações proteômicas da EM. Utiliza mPOP (minimal ProteOmic sample Preparation)23, que é um método de lise por calor de congelamento. Este método permitiu a lise de células individuais em volumes menores e em placas de vários poços, em vez de em frascos, facilitando uma maior taxa de rendimento e automação por termocicladores. Em conjunto, esse método reduziu o custo por célula única e aumentou a acurácia quantitativa em relação ao SCoPE-MS 16,24.
Este protocolo descreve como preparar células individuais para análise proteômica, incluindo como preparar o transportador e os canais de referência usando rótulos isobáricos TMTpro 18-plex. As células de mamíferos que estão em suspensão unicelular e que podem ser isoladas em placas de 384 poços provavelmente são passíveis desse protocolo. Também estão incluídos resultados representativos de conjuntos de célula única bem-sucedidos, exibindo vários gráficos de controle de qualidade gerados por um aplicativo R Shiny, o DO-MS25. Outras ferramentas de software publicadas 26,27 e diretrizes experimentais 17,21 melhoraram a adoção desse protocolo. Esperamos que este guia visual ajude ainda mais os pesquisadores a realizar experimentos de proteômica de célula única.
Protocol
Representative Results
Discussion
Uma das chaves para o sucesso da preparação e análise de células individuais pelo SCoPE2 é a preparação do transportador e dos canais de referência. O tamanho do portador sugerido é de 100 a 200 células; no entanto, o número de células necessárias para um experimento unicelular específico pode ser determinado com base em princípios discutidos em outro lugar21. Para o tamanho sugerido, pelo menos ~ 11.275 células são necessárias por placa de 384 poços, permitindo um transportador de 200 células e uma referência de 5 células em cada conjunto. Pode ser vantajoso isolar mais células se as populações celulares desejadas não forem um fator limitante, para simplesmente ter material extra em caso de erros (como foi feito neste protocolo, isolando 22.000 células em vez de 11.275 células). A quantidade de transportador e a referência necessárias para o número de placas desejadas devem ser preparadas em um único lote para minimizar qualquer variação de lote para lote que possa fazer com que a identificação ou quantificação de peptídeos seja diferente entre os lotes.
Antes de isolar células individuais em poços de uma placa de 384 poços, é importante considerar o design do layout da placa. Dentro de cada placa de 384 poços, recomenda-se a implementação de controles positivos e negativos. Controles negativos são poços nos quais nenhuma célula é adicionada, mas passam pelas mesmas adições e procedimentos de reagentes que os poços de célula única. Controles positivos são poços nos quais o lisado celular diluído em 2-5 células/μL é adicionado em vez de células únicas. Isso é particularmente importante de implementar quando os métodos de isolamento de célula única não são bem validados. Idealmente, cada placa de 384 poços deve ter uma distribuição aleatória de células e controles únicos (por exemplo, não ter controles negativos ou positivos em apenas uma linha). Cada placa deve ter uma distribuição igual de todas as populações celulares de interesse, em vez de isolar um tipo de célula em uma placa e um segundo tipo de célula em uma segunda placa. Isso evitará vincular os efeitos de lote com tipos de células de interesse. Além disso, se mais de uma placa de 384 poços for necessária para análise, é aconselhável isolar as células em uma única sessão, em vez de espalhar a etapa de isolamento por vários dias, se possível.
A lise de células individuais e de carreador/referência ocorre em água através de um ciclo de congelamento-calor23. Prevê-se que a maioria das proteases tenha sido desnaturada durante esta etapa. A tripsina é então adicionada imediatamente após a etapa de desnaturação em uma alta concentração, muitas ordens de magnitude maiores em concentração do que até mesmo as proteases celulares mais abundantes. Por ação de massa, a maioria dos produtos da atividade da protease será devida à tripsina.
A redução/alquilação dos resíduos de cisteína não é realizada neste protocolo antes da digestão da tripsina. Os peptídeos contendo cisteína representam cerca de 10% dos peptídeos trípticos do proteoma humano. Observamos menos peptídeos contendo cisteína usando uma abordagem sem redução/alquilação. Essas etapas usam reagentes que são incompatíveis com a rotulagem por TMT (química do éster NHS) imediatamente após a digestão.
Nesta estratégia de rotulagem TMT, o transportador e as referências são rotulados com 126 e 127N, respectivamente, enquanto os poços de célula única e de controle são rotulados com 128C a 135N. Os dois rótulos após a referência, 127C e 128N, não são utilizados devido à contaminação cruzada isotópica decorrente dos canais transportadores e de referência, que são claramente muito mais abundantes em material peptídico do que as células individuais. No total, existem 12 canais TMT por conjunto que podem ser usados para rotular células únicas ou poços de controle com TMTpro-16plex, ou 14 canais TMT por conjunto com TMTpro-18plex.
As etapas críticas no protocolo para realizar medições proteômicas de célula única usando este protocolo incluem a preparação do portador, isolamento de célula única, lise, digestão, marcação de código de barras e parâmetros adequados de espectrometria de massa. Essas etapas foram descritas neste documento e extensamente detalhadas em outros lugares 17,21,25. Cada etapa tem um gráfico correspondente ou conjunto de gráficos em DO-MS que permitem fácil controle de qualidade. Por exemplo, no caso de criação bem-sucedida do transportador, gráficos que descrevem o número de peptídeos identificados, a eficiência de rotulagem e a porcentagem de taxa de decolagem permitem a verificação de sua preparação bem-sucedida. Relatórios representativos de DO-MS estão incluídos nesta publicação e podem ser vistos em http://scope2.slavovlab.net/ para os dados originais16. Esses relatórios de DO-MS permitem avaliar a otimização do método em direções ainda não investigadas pelos autores, como gradientes de LC mais longos, diferentes enzimas de digestão ou códigos de barras químicos alternativos.
Atualmente, a análise seriada de peptídeos por algoritmos de aquisição dependentes de dados limita o número de peptídeos que podem ser analisados em uma execução de LC de um comprimento razoável. Isso se deve, em parte, aos tempos de enchimento mais longos necessários para a aquisição bem-sucedida de íons suficientes para quantificação confiável de célula única21. Uma limitação inerente ao uso do transportador é a falta de avaliação direta da digestão e da eficiência de rotulagem das células individuais. Atualmente, uma solução para essa limitação é realizar o controle de qualidade em uma amostra maior processada ao lado das células individuais.
Propusemos uma série de oportunidades para melhorar a proteômica de célula única, como a construção de espectrômetros de massa com vários analisadores. O método atual permite a quantificação de milhares de proteínas de células de mamíferos individuais a uma velocidade de aproximadamente 100 células por dia com reagentes e equipamentos comercialmente disponíveis. SCoPE2, a segunda geração da abordagem SCoPE-MS, melhorou significativamente em relação ao seu antecessor no que diz respeito ao número de células analisáveis por unidade de tempo, o número de proteínas analisáveis por unidade de tempo, o tempo necessário para a preparação da amostra, a acessibilidade de reagentes e equipamentos e o custo total de preparação e análise por única célula. As proteínas ligadas à membrana são acessíveis por meio da lise por calor de congelamento e digestão de protease, como demonstrado em comparação com a lise da ureia23. O método identifica muitas proteínas do terço superior do proteoma em relação à abundância16. Se o proteoforme modificado estiver no terço superior do proteoma, e o peptídeo modificado for passível de análise de espectrometria de massa (ioniza bem, tem uma diferença de massa do peptídeo não modificado), é mais provável que seja passível desse protocolo. Esse método pode ser aplicado de forma frutífera em sistemas biológicos em que há heterogeneidade significativa entre as células, como na diferenciação, senescência ou respostas imunológicas (ou seja, fagocitose).
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gostaríamos de agradecer o prêmio do Programa I-Corps da NSF do outono de 2021 (site da Northeastern University) que financiou esta publicação.
Materials
| 384-well plate, standard PCR plate | Thermo Fisher Scientific | AB1384 | Polypropylene plates should be used, if need to substitute. If substituted, levels of potential polymer contamination from other plates should be assessed prior to SCoPE2 preparation. |
| Acetonitrile (for preparation of buffers), Optima LC-MS/MS grade | Fisher Scientific | A955-1 | This acetonitrile is used for any buffers, namely the 50% acetonitrile that is used to pass through wells after passing through the carrier and reference when combining SCoPE2 sets. Caution: Acetonitrile is a flammable liquid. It can irritate skin, eyes, respiratory tract, and central nervous system. Be sure to wear personal protective equipment. Handle under a chemical fume hood. |
| Acetonitrile (for preparation of TMT ), anhydrous, 99.8% | Sigma Aldrich | 271004-100ML | This acetonitrile is used to resuspend TMT labels at the manufacturer concentration. Caution: Acetonitrile is a flammable liquid. It can irritate skin, eyes, respiratory tract, and central nervous system. Be sure to wear personal protective equipment. Handle under a chemical fume hood. |
| Adhesive PCR plate foils | Thermo Fisher Scientific | AB0626 | |
| Autosampler vial screw thread caps | Thermo Fisher Scientific | C5000-51B | |
| Autosampler vial spinner (i.e. myFuge 5) | MTC Bio | C2595 | This model does not have any speed control. It is simply used to colelct liquid at the bottom of autosampler vials. |
| Benzonase nuclease | Sigma Aldrich | E1014-25KU | |
| Clear glass screw thread vials, 9 mm | Thermo Fisher Scientific | 60180-509 | |
| Formic Acid, Pierce, LC-MS/MS grade | Thermo Fisher Scientific | 85178 | Caution: Formic acid is a flammable liquid. It can cause serious eye damage or skin burns. Be sure to wear personal protective equipment. Handle in a well-ventilated area. |
| Glass autosampler inserts, 9 mm | Thermo Fisher Scientific | C4010-630 | |
| Hydroxylamine (HA), 50% wt/vol | Sigma Aldrich | 467804-50ML | Caution: Hydroxylamine can cause skin irritation. Be sure to wear personal protective equipment. |
| Mantis microfluidic chips, low-volume 3PFE chips | Formulatrix | MCLVPR2 | These chips are meant to be used with the Mantis microfluidics liquid handler to dispense organic solutions. These can be used to dispense TMT labels. |
| Mantis microfluidic chips, low-volume silicone chips | Formulatrix | MCLVS12 | These chips are meant to be used with the Mantis microfluidics liquid handler to dispense aqueous solutions. These cannot be used to dispense TMT labels. |
| Mantis microfluidic liquid handler | Formulatrix | Liquid handler can be substituted. However, it is important to check if the system is compatible with 100% acetonitrile (as in the case of TMT labels), and that the system does not introduce polymer contamination or other type of contamination into the samples. | |
| Mantis PCR plate adapter with wide conical pins for automated plate handling | Formulatrix | 232400 | |
| MassPREP peptide mixture | Waters | 186002337 | Mixture of nine nontryptic peptides |
| PCR tube spinner (i.e., 16-place microcentrifuge for 0.2 mL tubes) | USA Scientific | 2621-0016 | This model does not have any speed control. It is simply used to collect liquid at the bottom of tubes. |
| PCR tubes: TempAssure 0.2 mL PCR 8-tube strips | USA Scientific | 1402-3900 | If substituted, levels of potential polymer contamination from other plates should be assessed prior to SCoPE2 preparation. |
| Phosphate-buffered saline (PBS), 10x, pH 7.4, RNase-free | Thermo Fisher Scientific | AM9625 | |
| Plate spinner (i.e., PlateFuge microcentrifuge) | Benchmark Scientific | Model C2000 | This model does not have any speed control. It is simply used to collect liquid at the bottom of wells. |
| Thermal Cycler (i.e., C1000 Touch with 384-well module) | Biorad | 1851138 | |
| TMTpro 16plex Label Reagent Set, 1 x 5 mg | Thermo Fisher Scientific | A44520 | |
| Triethylammonium bicarbonate (TEAB), 1 M, pH 8.5 | Sigma Aldrich | T7408100ML | |
| Trypsin Gold Mass Spectrometry Grade | Promega | V5280 | This is trypsin is of very high purity. Other trypsin reagents can vary in their levels of purity. Level of purity is important for achieving positive SCoPE2 results. Caution: Trypsin can cause skin, respiratory, and eye irritation. Be sure to wear personal protective equipment. Handle under a chemical fume hood. |
| Vortex (Analog vortex mixer) | VWR | Model 58816-121 | |
| Water bath sonicator (i.e., 2.8 L ultrasonic cleaner with digital timer) | VWR | 97043964 | |
| Water, Optima LC-MS/MS grade | Fisher Scientific | W6-1 | All solutions that need to be diluted or made are recommended to be made with mass-spectrometry grade water. Any dilutions and/or master mixes should be made fresh. Contamination resulting from lower-grade water can negatively affect peptide detection and single-cell data quality . |
References
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