凍結熱分解と同重体担体を用いた質量分析のためのシングルセルプロテオミクス調製(英語)

注意: このプロトコルでは、室温(RT)は18〜22°Cです。 1. キャリアと標準物質の生成 細胞単離目的の細胞を氷冷した1x PBSで細胞懸濁液に集めます。注:可能であれば、キャリアと標準物質は、単一細胞レベルで研究するために選択された細胞集団から調製する必要があります。異なる実験条件からの同数の細胞(刺激免疫細胞および非刺激免疫細胞など)が担体および基準を構成するはずである。十分な数のこれらの細胞を採取できない状況では、生物学的類似性に基づいて適切な細胞集団を選択する必要があります。 血球計算盤または他の細胞計数手段(FACSなど)を使用して、懸濁液中の細胞数をカウントします。 各細胞タイプの22,000細胞を11 μLのHPLCグレードの水にスピンダウンし、PCRチューブ(標準250 μL PCRチューブ)に別々に再懸濁します。注:ここでアドバイスされている細胞の数は、キャリアと、単一細胞でいっぱいの384ウェルプレートから調製できるセット数の参照に十分です。このステップの細胞インプットと後続のステップの試薬量は、セット数が多いほど比例してスケーリングできます。スピンダウンの速度は、ラボの細胞培養方法によって異なります。典型的なスピンダウン:5分間で300 × g 。 サンプルを-80°Cの冷凍庫に少なくとも30分間移します。一時停止ポイント:サンプルは数ヶ月間凍結したままで、単一細胞データに影響はありません。 細胞溶解細胞を入れたPCRチューブを90°Cで10分間加熱し(サーマルサイクラーの蓋を105°Cに設定)、加熱サイクルの直後にチューブを12°Cまで冷却します。 チューブを短時間ボルテックスしてから、RTのベンチトップPCRチューブスピナーでスピンダウンして、チューブの底にあるすべての液体を収集します。 水浴超音波処理器では、5分間チューブを超音波処理し、RTで氷上に置きます。 トリプシン消化氷上で2.2 μLのマスターミックス(成分については 表1 を参照)を各サンプルチューブに加えます。注意: トリプシンは、皮膚、呼吸器、および目の炎症を引き起こす可能性があります。必ず個人用保護具を着用してください。化学ヒュームフードの下でハンドルします。 チューブを短時間ボルテックスして混合し、RTのベンチトップPCRチューブスピナーでスピンダウンし、各チューブの下部にあるすべての液体を収集します。 サンプルを37°Cで3時間加熱します(サーマルサイクラーの蓋を52°Cに設定)。 TMT標識反応消化後、RTのベンチトップPCRチューブスピナーでサンプルをスピンダウンします。 各サンプルをそれぞれ6.6 μLの2つの等容量に分割し、各チューブに11,000個の細胞が含まれるようにします。 担体用のチューブに、85 mMの濃度で再懸濁したTMT標識126を3.3 μL添加します。 参照用のチューブに、85 mMの濃度で再懸濁したTMT標識127Nを3.3 μL加えます。 チューブを短時間ボルテックスし、RTのベンチトップPCRチューブスピナーでスピンダウンして、下部に液体を収集します。 チューブをRTで1時間放置します。 TMT標識反応のクエンチング1.65 μLの0.5%ヒドロキシルアミンを各チューブに加えます。注意: ヒドロキシルアミンは皮膚の炎症を引き起こす可能性があります。必ず個人用保護具を着用してください。 チューブを短時間ボルテックスし、RTのベンチトップPCRチューブスピナーでスピンダウンして、下部に液体を収集します。 チューブをRTで30分間放置します。 キャリアとリファレンスの組み合わせキャリアを構成するサンプルが個別にラベル付けされている場合は、それらを同じ比率で混合します。 参照を構成するサンプルが個別にラベル付けされている場合は、それらを同じ比率で混合します。 担体の最終濃度が100〜200細胞/μL、基準濃度が5〜10細胞/μLになるように担体と基準を混合します。 キャリアと標準物質をシングルセルセットと組み合わせる前に、品質を評価します。注:キャリアと標準物質の品質管理はさまざまな方法で実行できますが、do-ms.slavovlab.net17で入手可能なDO-MSソフトウェアを使用することをお勧めします。品質の重要な測定値には、ミスカット率(99%、標識部位の数、すなわちペプチドN末端とリジンを標識部位の総数で割ったものとして計算される測定基準)が含まれます。一時停止ポイント:キャリアと標準物質は、必要になるまで-80°Cで保存できます。 コンポーネント ミックス濃度 チューブあたりの最終濃度 トリプシンゴールド 50 ng/μL 8.33 ng/μL ティーブ、pH = 8.5 500ミリメートル 83.33 ミリ ベンゾナーゼヌクレアーゼ 1.2単位 0.2単位 表1:マスターミックスの試薬量。 トリプシン消化に必要な試薬の最終濃度がリストされています。 2. SCoPE2サンプル調製 細胞単離HPLCグレードの水に、合成ペプチド溶液1μLあたりペプチドあたり25 fmolを補給します。注:ウォーターズのMassPrepペプチド溶液は、使用できるものの一例です。それはあまりよくイオン化しない7つのペプチドで構成されています。これはこのソリューションの重要な側面です:これらのペプチドは、単一細胞の正確な質量分析定量を妨げません。目的のサンプルに含まれる可能性が低い少数のペプチドの高度に精製された混合物が適切です。 液体分注ロボットまたは手動ピペットを使用して、この混合物を384ウェルプレートの各ウェルに1 μL加えます。 プレートを密封し、RTのベンチトッププレートスピナーで回転させて、底部に液体を集めます。一時停止ポイント:この溶液を含むプレートは、必要になるまで-80°Cで保存できます。 脱凝集した未固定細胞の懸濁液を得る。注:細胞懸濁液がどの程度正確に得られるかは、目的の細胞タイプに基づいています。大まかな例を次に示します。浮遊細胞:細胞をスピンダウンしてペレットにし、細胞培養培地を除去します。 接着細胞:トリプシン処理または掻き取りによってディッシュまたはフラスコから細胞を取り除きます。次に、それらを回転させて細胞培養培地を除去します。 細胞懸濁液を1x氷冷PBSで2回洗浄します。2回目の洗浄後、細胞を1x PBSに懸濁したままにします。 384ウェルプレートが凍結している場合は、RTで解凍し、すべての液体がウェルの底にあることを確認するためにスピンダウンします。 セルソーターまたは手動ハンドピッキングなどの他の利用可能な手段を使用して、単一の細胞をそれぞれのウェルに分配します。注:ネガティブコントロールとポジティブコントロールのためにいくつかのウェルを空のままにして、ウェルに単一セルを追加します(説明を参照)。フローサイトメトリーを使用する場合は、フローサイトメーターの流量をできるだけ低くしてください。流量が少ないほど、細胞の取り扱いに優しいと考えられています。さらに、ノズルサイズは、目的のセルでの使用に適している必要があります。フローサイトメトリー施設との連携をお勧めします。 2〜5個の細胞当量ライセートのポジティブコントロールを、手動またはリキッドハンドリングロボットでピペットで選択したウェルに追加します。 RTのベンチトッププレートスピナーで選別されたセルでプレートを密封してスピンダウンし、底部に液体を収集します。できるだけ早くプレートを-80°Cで凍結します。一時停止ポイント:選別された単一セルを含むプレートは、必要になるまで-80°Cで保存できます。 細胞溶解選別された単一セルを含む384ウェルプレートを取り、できるだけ早くサーマルサイクラーに入れます。 プレートを90°Cに10分間加熱し(蓋の温度を105°Cに設定して)、プレートを12°Cに冷却します。 RTのベンチトッププレートスピナーでプレートを簡単に回転させます。 水浴超音波処理器では、RTで5分間プレートを超音波処理し、氷の上に置きます。 トリプシン消化384ウェルプレートあたり100 μLのマスターミックス(成分については 表1 を参照)を調製します。 384ウェルプレートの各ウェルに、リキッドハンドラーを使用してステップ2.3.1で調製したマスターミックス0.2 μLを加えます。注:手動ピペッティングを使用する場合は、より大きな容量を使用し、試薬の最終濃度がウェルごとに同じであることを確認してください。 プレートをシールし、5秒間ボルテックスし、RTのベンチトッププレートスピナーでスピンダウンします。 384ウェルプレートを37°C(蓋の温度を52°Cに設定)で3時間加熱します。 TMT標識反応85 mMのTMTラベル(128Nから135N)のストックを-80°Cの冷凍庫から取り出します。チューブを開く前に、チューブを室温に温めてください。 無水アセトニトリルでラベルを22 mMに希釈します。注意: アセトニトリルは可燃性の液体です。皮膚、目、気道、中枢神経系を刺激する可能性があります。必ず個人用保護具を着用してください。化学ヒュームフードの下でハンドルします。 この標識戦略を使用して、0.5 μLの希釈TMT標識を384ウェルプレートの各ウェルに追加します。液体分注ロボット(リキッドハンドラーを使用する場合は、必ず有機溶剤に適した関連機器を使用してください)または手動ピペットを使用してください。注: ラベル付けの方法については 、表 2 を参照してください。プレートレイアウトの例については 、表3 を参照してください。 プレートをシールし、5秒間ボルテックスし、RTのベンチトッププレートスピナーでスピンダウンします。 標識反応をRTで1時間進行させます。 TMT標識反応のクエンチング384ウェルプレートの各ウェルに、リキッドハンドラーを使用して0.2 μLの0.5%ヒドロキシルアミン(HPLCグレードの水で希釈)を加えます。注:手動ピペッティングを使用する場合は、より大きな容量を使用し、試薬の最終濃度がウェルごとに同じであることを確認してください。 プレートをシールし、5秒間ボルテックスし、RTのベンチトッププレートスピナーでスピンダウンします。 プレートをRTに30分間保ちます。 LC-MS/MS分析の準備:単一細胞およびコントロールウェルと担体/標準物質の組み合わせ組み合わせたキャリア/標準物質を-80°Cの冷凍庫から取り出します。 各セットについて、1 μLの担体と標準物質を、1つのセットの一部となる最初のウェルにピペットで入れます。最初のウェルの全容量を後続のウェルにピペットで入れます。1つのセットに含まれるすべてのウェルが最終的なウェルに結合されるまで、1つのセルから次のセルに全容量をピペッティングし続けます。注:担体と標準物質はそれぞれ200細胞と5細胞相当の濃度である必要がありますが、前述のように21、これらの量は異なる場合があります。各セットには、標識戦略( 表2を参照)で概説されているように、TMTpro-16plexまたはTMTpro-18plexを使用する場合は、それぞれキャリア、リファレンス、および最大12または14のシングルセルまたはコントロールサンプルが含まれている必要があります(ステップ2.4.3を参照)。 各セットについて、5 μLの50%アセトニトリル(HPLCグレードの水で希釈)を、各セットに含める最初のシングルセルウェルに追加します。最初の井戸から次の井戸までの全量をピペットします。1つのセットに含まれるすべてのウェルが最終的なウェルに結合されるまで、1つのセルから次のセルに全容量をピペッティングし続けます。注:この洗浄ステップは、ウェルからのサンプル回収に役立ちます。 各セットを個々のオートサンプラーガラスインサートに移します。注:これらのセットは、384ウェルプレートの単一ウェルに組み合わせて、注入28用のオートサンプラーに直接配置することもできます。 すべてのセットを組み合わせてガラスインサートに入れたら、サンプルを乾燥させます。一時停止ポイント:乾燥したセットは、質量分析計で実行する前に、少なくとも80°Cで1週間保存できます。 LC-MS/MS分析の前に、1.2 μLの0.1%ギ酸(HPLCグレードの水で希釈)を各セットに追加して、標識ペプチドを再懸濁します。注意: ギ酸は可燃性の液体です。深刻な目の損傷や皮膚の火傷を引き起こす可能性があります。必ず個人用保護具を着用してください。換気の良い場所で取り扱ってください。 オートサンプラーインサートをガラスオートサンプラーバイアルに入れ、各サンプルをキャップで閉じます。 各バイアルを5秒間ボルテックスして再懸濁が完了したことを確認してから、RTでバイアルスピナーでスピンダウンします。 各サンプルが側面に飛び散るのではなく、インサートの下部にあることを確認してください。 バイアルをオートサンプラートレイに入れます。 各セットについて、LC-MS/MS分析用に1 μLを注入します。 ラベル 126 127N 127°C 128N 128°C 129N 129°C 130N 130°C …. 135N サンプルタイプ キャリア 参考 空 空 SC/コントロール SC/コントロール SC/コントロール SC/コントロール SC/コントロール …. SC/コントロール 表 2: SCoPE2 TMTpro-18プレックス ラベリング方式の例。 キャリアとリファレンスは通常、最初の2つのTMTラベルでラベル付けされています。次に、次の2つのラベルは、定量の精度を低下させる可能性のある同位体汚染のためにスキップされます。残りのラベルは、単一のセルまたはコントロール用です。 128°C 129N 129°C 130N 130°C 131N 131°C 132N 132°C 133N 133°C 134N 128°C 129N 129°C 130N 130°C 131N 131°C 132N 132°C 133N 133°C 134N 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 ある ティッカー ティッカー – ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー + ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー – ティッカー + ティッカー ティッカー ティッカー B ティッカー + ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー + ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー – ティッカー ティッカー + C ティッカー – ティッカー – ティッカー ティッカー ティッカー + ティッカー – ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー + ティッカー – ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー – D ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー – ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー + ティッカー – ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー E ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー + ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー – ティッカー ティッカー F ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー – ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー + ティッカー ティッカー ティッカー + ティッカー ティッカー ティッカー + ティッカー ティッカー G ティッカー ティッカー ティッカー + ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー – ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー H ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー + ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー + ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー 私 ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー + ティッカー ティッカー – ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー J – ティッカー + ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー – ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー K ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー – ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー – ティッカー ティッカー + ティッカー – – ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー L ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー – ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー – ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー + ティッカー M ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー + ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー N + ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー O ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー + ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー – ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー P ティッカー ティッカー – ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー ティッカー + ティッカー ティッカー ティッカー – ティッカー 表3:TMTpro-16plexを使用したラベリングのプレートレイアウトの例。 384ウェルプレートフォーマット(または他のプレートフォーマット)を使用して、細胞がソートされるウェルをランダム化することが重要です。TMTpro-18plexには別のプレートレイアウトが使用されます。