Preparazione di proteomica a cella singola per analisi di spettrometria di massa mediante lisi a calore freddo e un vettore isobarico

Una delle chiavi per una preparazione e un’analisi di successo delle singole cellule da parte di SCoPE2 è la preparazione del vettore e dei canali di riferimento. La dimensione del supporto suggerita è compresa tra 100 e 200 celle; Tuttavia, il numero di cellule necessarie per un particolare esperimento a singola cellula può essere determinato sulla base di principi come discusso altrove²¹. Per la dimensione suggerita, sono necessarie almeno ~ 11.275 celle per piastra a 384 pozzetti, consentendo un supporto di 200 celle e un riferimento a 5 celle in ciascun set. Può essere vantaggioso isolare più cellule se le popolazioni cellulari desiderate non sono un fattore limitante, avere semplicemente materiale extra in caso di errori (come è stato fatto in questo protocollo, isolando 22.000 cellule invece di 11.275 cellule). La quantità di supporto e di riferimento necessaria per il numero di piastre desiderate deve essere preparata in un singolo lotto per ridurre al minimo qualsiasi variazione da lotto a lotto che possa causare l’identificazione o la quantificazione dei peptidi a differire tra i lotti.

Prima di isolare le singole celle in pozzetti di una piastra a 384 pozzetti, è importante considerare il design del layout della piastra. All’interno di ogni piastra a 384 pozzetti, si consiglia di implementare controlli sia positivi che negativi. I controlli negativi sono pozzetti in cui non vengono aggiunte cellule ma subiscono le stesse aggiunte e procedure di reagenti dei pozzetti a singola cellula. I controlli positivi sono pozzetti in cui viene aggiunto lisato cellulare diluito a 2-5 cellule / μL invece di singole cellule. Ciò è particolarmente importante da implementare quando i metodi di isolamento a cella singola non sono ben convalidati. Ogni piastra a 384 pozzetti dovrebbe idealmente avere una distribuzione randomizzata di singole celle e controlli (ad esempio, non avere controlli negativi o positivi in una sola riga). Ogni piastra dovrebbe avere una distribuzione uguale di tutte le popolazioni cellulari di interesse, piuttosto che isolare un tipo di cellula in una piastra e un secondo tipo di cellula in una seconda piastra. Ciò eviterà di legare gli effetti batch con i tipi di celle di interesse. Inoltre, se è necessaria più di una piastra da 384 pozzetti per l’analisi, è consigliabile isolare le cellule in una singola sessione, piuttosto che distribuire la fase di isolamento su diversi giorni, se possibile.

La lisi sia delle singole cellule che del vettore/riferimento avviene in acqua attraverso un ciclo di congelamento-calore²³. Si prevede che la maggior parte delle proteasi siano state denaturate durante questa fase. La tripsina viene quindi aggiunta immediatamente dopo la fase di denaturazione ad alta concentrazione, molti ordini di grandezza in concentrazione maggiore anche delle proteasi cellulari più abbondanti. Con l’azione di massa, la maggior parte dei prodotti dell’attività della proteasi sarà dovuta alla tripsina.

La riduzione/alchilazione dei residui di cisteina non viene eseguita in questo protocollo prima della digestione della tripsina. I peptidi contenenti cisteina rappresentano circa il 10% dei peptidi triptici dal proteoma umano. Osserviamo meno peptidi contenenti cisteina utilizzando un approccio senza riduzione / alchilazione. Questi passaggi utilizzano reagenti incompatibili con l’etichettatura mediante TMT (NHS-ester chemistry) immediatamente dopo la digestione.

In questa strategia di etichettatura TMT, il vettore e i riferimenti sono etichettati rispettivamente con 126 e 127N, mentre i pozzetti a cella singola e di controllo sono etichettati con 128C fino a 135N. Le due etichette dopo il riferimento, 127C e 128N, non sono utilizzate a causa della contaminazione incrociata isotopica derivante dal vettore e dai canali di riferimento, che sono chiaramente molto più abbondanti nel materiale peptidico rispetto alle singole cellule. In totale, ci sono 12 canali TMT per set che possono essere utilizzati per etichettare singole celle o pozzetti di controllo con TMTpro-16plex o 14 canali TMT per set con TMTpro-18plex.

I passaggi critici del protocollo per eseguire misurazioni proteomiche a singola cellula utilizzando questo protocollo includono la preparazione del vettore, l’isolamento a singola cellula, la lisi, la digestione, l’etichettatura con codice a barre e i parametri di spettrometria di massa appropriati. Questi passaggi sono stati delineati in questo documento e sono stati ampiamente dettagliati altrove 17,21,25. Ogni fase ha un corrispondente grafico o insieme di grafici in DO-MS che consentono un facile controllo della qualità. Ad esempio, in caso di creazione riuscita del vettore, i grafici che descrivono il numero di peptidi identificati, l’efficienza dell’etichettatura e la percentuale di miscleavage rate consentono di verificare la sua preparazione di successo. Le relazioni rappresentative DO-MS sono incluse in questa pubblicazione e possono essere visualizzate a http://scope2.slavovlab.net/ per i dati originali¹⁶. Questi rapporti DO-MS consentono di valutare l’ottimizzazione del metodo in direzioni non ancora studiate dagli autori, come gradienti LC più lunghi, diversi enzimi di digestione o codici a barre chimici alternativi.

Attualmente, l’analisi seriale dei peptidi mediante algoritmi di acquisizione dipendenti dai dati limita il numero di peptidi che possono essere analizzati in una corsa LC di una lunghezza ragionevole. Ciò è in parte dovuto ai tempi di riempimento più lunghi necessari per l’acquisizione di una quantità sufficiente di ioni per una quantificazione affidabile a singola cellula²¹. Una limitazione intrinseca all’utilizzo del vettore è la mancanza di valutazione diretta della digestione e dell’efficienza di etichettatura delle singole cellule. Attualmente, una soluzione a questa limitazione è l’esecuzione del controllo di qualità su un campione più grande elaborato insieme alle singole celle.

Abbiamo proposto una serie di opportunità per migliorare la proteomica a singola cellula, come la costruzione di spettrometri di massa con analizzatori multipli. Il metodo attuale consente la quantificazione di migliaia di proteine da singole cellule di mammifero ad una velocità di circa 100 cellule al giorno con reagenti e attrezzature disponibili in commercio. SCoPE2, la seconda generazione dell’approccio SCoPE-MS, ha migliorato significativamente il suo predecessore per quanto riguarda il numero di cellule analizzabili per unità di tempo, il numero di proteine analizzabili per unità di tempo, il tempo necessario per la preparazione del campione, l’accessibilità dei reagenti e delle apparecchiature e il costo complessivo di preparazione e analisi per singola cellula. Le proteine legate alla membrana sono accessibili utilizzando la lisi a calore gelido e la digestione della proteasi, come mostrato rispetto alla lisi dell’urea²³. Il metodo identifica molte proteine dal terzo superiore del proteoma rispetto all’abbondanza¹⁶. Se la proteoforma modificata si trova nel terzo superiore del proteoma e il peptide modificato è suscettibile di analisi di spettrometria di massa (ionizza bene, ha una differenza di massa dal peptide non modificato), sarà più probabile che sia suscettibile di questo protocollo. Questo metodo può essere applicato fruttuosamente nei sistemi biologici in cui vi è una significativa eterogeneità tra le cellule, come nella differenziazione, nella senescenza o nelle risposte immunologiche (cioè la fagocitosi).