Einzelzell-Proteomik-Vorbereitung für die massenspektrometrische Analyse mittels Gefrierwärmelyse und isobarem Träger
Summary
In diesem Protokoll beschreiben wir, wie Säugetierzellen für die Einzelzell-Proteomik-Analyse mittels Massenspektrometrie unter Verwendung kommerziell erhältlicher Reagenzien und Geräte mit Optionen für manuelles und automatisches Pipettieren vorbereitet werden können.
Abstract
Die Einzelzell-Proteomik-Analyse erfordert empfindliche, quantitativ genaue, allgemein zugängliche und robuste Methoden. Um diesen Anforderungen gerecht zu werden, wurde das Single-Cell ProtEomics (SCoPE2)-Protokoll als Methode der zweiten Generation zur Quantifizierung von Hunderten bis Tausenden von Proteinen aus begrenzten Proben bis auf die Ebene einer einzelnen Zelle entwickelt. Experimente mit dieser Methode haben die Quantifizierung von über 3.000 Proteinen in 1.500 einzelnen Säugetierzellen (500-1.000 Proteine pro Zelle) in 10 Tagen Massenspektrometer-Instrumentenzeit erreicht. SCoPE2 nutzt einen Gefrier-Wärme-Zyklus für die Zelllyse, wodurch die Reinigung einzelner Zellen entfällt und somit Probenverluste reduziert werden, während die Probenvorbereitung beschleunigt und die Automatisierung vereinfacht wird. Darüber hinaus verwendet die Methode einen isobaren Träger, der die Proteinidentifizierung unterstützt und Probenverluste reduziert.
Dieses Videoprotokoll bietet detaillierte Anleitungen, um die Einführung einer automatisierten Einzelzellproteinanalyse zu ermöglichen, bei der nur Geräte und Reagenzien verwendet werden, die allgemein zugänglich sind. Wir demonstrieren kritische Schritte bei der Vorbereitung einzelner Zellen für die Proteomanalyse, von der Ernte über die Injektion bis hin zur Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) Analyse. Darüber hinaus werden die Betrachter durch die Prinzipien des experimentellen Designs mit dem isobaren Träger, die Qualitätskontrolle sowohl für isobare Träger- als auch für Einzelzellpräparate und repräsentative Ergebnisse mit einer Diskussion der Grenzen des Ansatzes geführt.
Introduction
Die Einzelzellanalyse wird häufig verwendet, um den Grad der Heterogenität innerhalb biologischer Systeme zu untersuchen, der sonst durch Massenmessungen nicht erkennbar wäre 1,2,3. Eine solche zelluläre Vielfalt kann funktionelle Konsequenzen haben, die das Verständnis integraler biologischer Prozesse fördern können, von der therapeutischen Resistenz von Krebszellen 4,5,6 bis zur Zell-zu-Zell-Heterogenität bei Diabetes 7,8,9,10. Viele Untersuchungen konzentrierten sich auf die Messung von Nukleinsäuren in einzelnen Zellen durch Messung genetischer oder transkriptomischer Ebenen und ermöglichten die Klassifizierung von Zelltypen und -zuständen. Ein solcher Fortschritt im Nukleinsäurebereich kann jedoch die Wissenslücke der posttranskriptionellen Regulation11 nicht schließen, was die Notwendigkeit ähnlicher Hochdurchsatz-Proteinmessungen in Einzelzellen12,13,14,15 erhöht.
Wir haben SCoPE216,17 entwickelt, um der Nachfrage nach rigoroser und robuster Einzelzell-Proteomik von Säugetiersystemen gerecht zu werden. Es handelt sich um eine Multiplexmethode, die einen erhöhten Durchsatz ermöglicht, indem viele Zellen parallel markiert und analysiertwerden 18, im Gegensatz zu markierungsfreien Mthoden, die eine Zelle zum Zeitpunkt19,20 analysieren. Die Probenvorbereitungsmethodik, der massenspektrometrische Ansatz und die nachfolgenden Datenanalyseschritte ermöglichen eine genaue Quantifizierung von Hunderten bis Tausenden von Proteinen pro Zelle. Diese Methode ermöglicht die massenspektrometrische Analyse einzelner Zellen durch den isobaren Träger21, eine kleine Massenprobe von Zellen (normalerweise 25-200), die der interessierenden Einzelzellpopulation biologisch ähnlich ist. Dieses Trägermaterial wird in einem Set mit einem Referenzkanal aus dem gleichen Material und einzelnen Zellen durch die Verwendung von Tandem-Massentags (TMT-Labels) gemultiplext. Der Trägerkanal reduziert den Probenverlust an Oberflächen und liefert die Ionenrückgratfragmente für eine erfolgreiche Peptididentifizierung. Der Referenzkanal, der in großen Mengen hergestellt und anschließend auf 5-10 Zelläquivalente für jeden Einzelzellsatz verdünnt wird, hilft bei der Kontrolle der technischen Variabilität in der Analyse. Insbesondere ermöglicht die Referenz die Normalisierung der Variabilität, die durch LC-MS/MS-bezogene Effekte wie Ionenprobenahme und Ionisationseffizienz verursacht wird. In der Regel werden die Referenz- und die Trägerkanäle aus derselben Zellpopulation hergestellt.
Dieses Probenvorbereitungsprotokoll ist eine Methode der zweiten Generation, die auf SCoPE-MS22 durch mehrere synergistische Verbesserungen aufbaut. Zu den Verbesserungen gehört eine Zelllysemethode, die die Probenreinigung vermeidet, was ein üblicher Schritt von MS-Proteomik-Präparaten ist. Es verwendet mPOP (minimal ProteOmic sample Preparation)23, eine Gefrier-Wärme-Lysemethode. Diese Methode ermöglichte die Lyse einzelner Zellen in kleineren Volumina und in Multiwell-Platten anstelle von Vials, was eine höhere Durchsatzrate und Automatisierung durch Thermocycler ermöglichte. Insgesamt hat diese Methode die Kosten pro einzelne Zelle gesenkt und die quantitative Genauigkeit im Vergleich zu SCoPE-MS16,24 erhöht.
Dieses Protokoll beschreibt, wie einzelne Zellen für die Proteomanalyse vorbereitet werden, einschließlich der Vorbereitung der Träger- und Referenzkanäle unter Verwendung von TMTpro 18-plex isobaren Markierungen. Säugetierzellen, die sich in einzelliger Suspension befinden und in 384-Well-Platten isoliert werden können, sind wahrscheinlich für dieses Protokoll geeignet. Ebenfalls enthalten sind repräsentative Ergebnisse erfolgreicher Einzelzellensätze, die mehrere Qualitätskontrolldiagramme anzeigen, die von einer R Shiny-App, DO-MS25, generiert wurden. Andere veröffentlichte Software-Tools 26,27 und experimentelle Richtlinien 17,21 haben die Annahme dieses Protokolls verbessert. Wir hoffen, dass dieser visuelle Leitfaden Forschern bei der Durchführung von Einzelzell-Proteomik-Experimenten helfen wird.
Protocol
Representative Results
Discussion
Einer der Schlüssel zur erfolgreichen Vorbereitung und Analyse einzelner Zellen durch SCoPE2 ist die Vorbereitung der Träger- und Referenzkanäle. Die vorgeschlagene Trägergröße beträgt 100 bis 200 Zellen; Die Anzahl der Zellen, die für ein bestimmtes Einzelzellexperiment benötigt werden, kann jedoch auf der Grundlage von Prinzipien bestimmt werden, wie an anderer Stelle21 erörtert. Für die vorgeschlagene Größe werden mindestens ~ 11.275 Zellen pro 384-Well-Platte benötigt, was einen 200-Zell-Träger und eine 5-Zell-Referenz in jedem Satz ermöglicht. Es kann vorteilhaft sein, mehr Zellen zu isolieren, wenn die gewünschten Zellpopulationen kein limitierender Faktor sind, einfach zusätzliches Material im Falle von Fehlern zu haben (wie in diesem Protokoll 22.000 Zellen statt 11.275 Zellen isoliert). Die Menge an Träger und Referenz, die für die Anzahl der gewünschten Platten benötigt wird, sollte in einer einzigen Charge vorbereitet werden, um jede Chargenvariation zu minimieren, die dazu führen kann, dass sich die Peptididentifizierung oder -quantifizierung zwischen den Chargen unterscheidet.
Bevor einzelne Zellen in Vertiefungen einer 384-Well-Platte isoliert werden, ist es wichtig, das Design des Plattenlayouts zu berücksichtigen. Innerhalb jeder 384-Well-Platte wird empfohlen, sowohl Positiv- als auch Negativkontrollen durchzuführen. Negativkontrollen sind Vertiefungen, in denen keine Zellen hinzugefügt werden, sondern die gleichen Reagenzzusätze und -verfahren durchlaufen wie die Einzelzellmulden. Positivkontrollen sind Vertiefungen, in denen Zelllysat anstelle von Einzelzellen auf 2-5 Zellen/μL verdünnt zugegeben wird. Dies ist besonders wichtig, wenn Einzelzellisolierungsmethoden nicht gut validiert sind. Jede 384-Well-Platte sollte idealerweise eine randomisierte Verteilung einzelner Zellen und Kontrollen aufweisen (z. B. keine negativen oder positiven Kontrollen in nur einer Reihe). Jede Platte sollte eine gleichmäßige Verteilung aller interessierenden Zellpopulationen aufweisen, anstatt einen Zelltyp in einer Platte und einen zweiten Zelltyp in einer zweiten Platte zu isolieren. Dadurch wird vermieden, dass Batch-Effekte mit interessierenden Zelltypen verknüpft werden. Wenn mehr als eine 384-Well-Platte für die Analyse benötigt wird, ist es ratsam, Zellen in einer einzigen Sitzung zu isolieren, anstatt den Isolationsschritt nach Möglichkeit über mehrere Tage zu verteilen.
Die Lyse sowohl einzelner Zellen als auch des Trägers/der Referenz erfolgt in Wasser durch einen Gefrier-Wärme-Zyklus23. Es wird erwartet, dass die meisten Proteasen während dieses Schrittes denaturiert wurden. Trypsin wird dann unmittelbar nach dem Denaturierungsschritt in einer hohen Konzentration zugegeben, die um viele Größenordnungen höher ist als selbst die häufigsten zellulären Proteasen. Durch Massenwirkung werden die meisten Produkte der Proteaseaktivität auf Trypsin zurückzuführen sein.
Die Reduktion/Alkylierung von Cysteinresten wird in diesem Protokoll vor dem Trypsinaufschluss nicht durchgeführt. Cystein-haltige Peptide machen etwa 10% der tryptischen Peptide aus dem menschlichen Proteom aus. Wir beobachten weniger Cystein-haltige Peptide mit einem Ansatz ohne Reduktion / Alkylierung. Diese Schritte verwenden Reagenzien, die mit der Markierung durch TMT (NHS-Esterchemie) unmittelbar nach dem Aufschluss nicht kompatibel sind.
Bei dieser TMT-Markierungsstrategie werden der Träger und die Referenzen mit 126 bzw. 127N markiert, während Einzelzell- und Kontrollmulden mit 128C bis 135N gekennzeichnet sind. Die beiden Markierungen nach der Referenz, 127C und 128N, werden aufgrund der isotopischen Kreuzkontamination durch die Träger- und Referenzkanäle, die im Peptidmaterial deutlich häufiger vorkommen als die einzelnen Zellen, nicht verwendet. Insgesamt gibt es 12 TMT-Kanäle pro Set, die zur Markierung einzelner Zellen oder Regelmulden mit TMTpro-16plex verwendet werden können, oder 14 TMT-Kanäle pro Set mit TMTpro-18plex.
Die kritischen Schritte im Protokoll zur Durchführung von Einzelzell-Proteomik-Messungen mit diesem Protokoll umfassen die Vorbereitung des Trägers, die Einzelzellisolierung, die Lyse, den Aufschluss, die Barcode-Kennzeichnung und die richtigen Massenspektrometrieparameter. Diese Schritte wurden in diesem Dokument skizziert und an anderer Stelleausführlich beschrieben 17,21,25. Jeder Schritt hat ein entsprechendes Diagramm oder eine Reihe von Diagrammen in DO-MS, die eine einfache Qualitätskontrolle ermöglichen. Im Falle einer erfolgreichen Erstellung des Trägers ermöglichen beispielsweise Diagramme, die die Anzahl der identifizierten Peptide, die Markierungseffizienz und den Prozentsatz der Misclevage-Rate darstellen, die Überprüfung seiner erfolgreichen Herstellung. Repräsentative DO-MS-Berichte sind in dieser Veröffentlichung enthalten und können unter http://scope2.slavovlab.net/ für die Originaldaten eingesehenwerden 16. Diese DO-MS-Berichte ermöglichen es, die Optimierung der Methode in Richtungen zu bewerten, die von den Autoren noch nicht untersucht wurden, wie z.B. längere LC-Gradienten, andere Verdauungsenzyme oder alternative chemische Barcodes.
Derzeit begrenzt die serielle Analyse von Peptiden durch datenabhängige Erfassungsalgorithmen die Anzahl der Peptide, die in einem LC-Lauf von angemessener Länge analysiert werden können. Dies ist zum Teil auf die längeren Füllzeiten zurückzuführen, die für die erfolgreiche Gewinnung von genügend Ionen für eine zuverlässige Einzelzellquantifizierung erforderlich sind21. Eine inhärente Einschränkung bei der Verwendung des Trägers ist das Fehlen einer direkten Bewertung der Verdauungs- und Markierungseffizienz der einzelnen Zellen. Derzeit besteht eine Lösung für diese Einschränkung darin, eine Qualitätskontrolle an einer größeren Probe durchzuführen, die neben den einzelnen Zellen verarbeitet wird.
Wir schlugen eine Reihe von Möglichkeiten zur Verbesserung der Einzelzell-Proteomik vor, wie z.B. den Bau von Massenspektrometern mit mehreren Analysatoren. Die derzeitige Methode ermöglicht die Quantifizierung von Tausenden von Proteinen aus einzelnen Säugetierzellen mit einer Geschwindigkeit von etwa 100 Zellen pro Tag mit kommerziell erhältlichen Reagenzien und Geräten. SCoPE2, die zweite Generation des SCoPE-MS-Ansatzes, verbesserte sich gegenüber seinem Vorgänger deutlich in Bezug auf die Anzahl der pro Zeiteinheit analysierbaren Zellen, die Anzahl der pro Zeiteinheit analysierbaren Proteine, die für die Probenvorbereitung benötigte Zeit, die Zugänglichkeit von Reagenzien und Geräten sowie die Gesamtkosten für die Vorbereitung und Analyse pro einzelne Zelle. Membrangebundene Proteine sind durch die Gefrierhitzelyse und Proteaseverdauung zugänglich, wie im Vergleich zur Harnstofflysegezeigt 23. Die Methode identifiziert viele Proteine aus dem oberen Drittel des Proteoms in Bezug auf die Häufigkeit16. Wenn sich die modifizierte Proteoform im oberen Drittel des Proteoms befindet und das modifizierte Peptid für die massenspektrometrische Analyse zugänglich ist (ionisiert gut, hat einen Massenunterschied zu unmodifiziertem Peptid), wird es eher für dieses Protokoll zugänglich sein. Diese Methode kann fruchtbar in biologischen Systemen angewendet werden, in denen eine signifikante Heterogenität zwischen den Zellen besteht, z. B. in Bezug auf Differenzierung, Seneszenz oder immunologische Reaktionen (dh Phagozytose).
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir möchten uns für den Preis des NSF I-Corps Program (Northeastern University) im Herbst 2021 bedanken, der diese Publikation finanziert hat.
Materials
| 384-well plate, standard PCR plate | Thermo Fisher Scientific | AB1384 | Polypropylene plates should be used, if need to substitute. If substituted, levels of potential polymer contamination from other plates should be assessed prior to SCoPE2 preparation. |
| Acetonitrile (for preparation of buffers), Optima LC-MS/MS grade | Fisher Scientific | A955-1 | This acetonitrile is used for any buffers, namely the 50% acetonitrile that is used to pass through wells after passing through the carrier and reference when combining SCoPE2 sets. Caution: Acetonitrile is a flammable liquid. It can irritate skin, eyes, respiratory tract, and central nervous system. Be sure to wear personal protective equipment. Handle under a chemical fume hood. |
| Acetonitrile (for preparation of TMT ), anhydrous, 99.8% | Sigma Aldrich | 271004-100ML | This acetonitrile is used to resuspend TMT labels at the manufacturer concentration. Caution: Acetonitrile is a flammable liquid. It can irritate skin, eyes, respiratory tract, and central nervous system. Be sure to wear personal protective equipment. Handle under a chemical fume hood. |
| Adhesive PCR plate foils | Thermo Fisher Scientific | AB0626 | |
| Autosampler vial screw thread caps | Thermo Fisher Scientific | C5000-51B | |
| Autosampler vial spinner (i.e. myFuge 5) | MTC Bio | C2595 | This model does not have any speed control. It is simply used to colelct liquid at the bottom of autosampler vials. |
| Benzonase nuclease | Sigma Aldrich | E1014-25KU | |
| Clear glass screw thread vials, 9 mm | Thermo Fisher Scientific | 60180-509 | |
| Formic Acid, Pierce, LC-MS/MS grade | Thermo Fisher Scientific | 85178 | Caution: Formic acid is a flammable liquid. It can cause serious eye damage or skin burns. Be sure to wear personal protective equipment. Handle in a well-ventilated area. |
| Glass autosampler inserts, 9 mm | Thermo Fisher Scientific | C4010-630 | |
| Hydroxylamine (HA), 50% wt/vol | Sigma Aldrich | 467804-50ML | Caution: Hydroxylamine can cause skin irritation. Be sure to wear personal protective equipment. |
| Mantis microfluidic chips, low-volume 3PFE chips | Formulatrix | MCLVPR2 | These chips are meant to be used with the Mantis microfluidics liquid handler to dispense organic solutions. These can be used to dispense TMT labels. |
| Mantis microfluidic chips, low-volume silicone chips | Formulatrix | MCLVS12 | These chips are meant to be used with the Mantis microfluidics liquid handler to dispense aqueous solutions. These cannot be used to dispense TMT labels. |
| Mantis microfluidic liquid handler | Formulatrix | Liquid handler can be substituted. However, it is important to check if the system is compatible with 100% acetonitrile (as in the case of TMT labels), and that the system does not introduce polymer contamination or other type of contamination into the samples. | |
| Mantis PCR plate adapter with wide conical pins for automated plate handling | Formulatrix | 232400 | |
| MassPREP peptide mixture | Waters | 186002337 | Mixture of nine nontryptic peptides |
| PCR tube spinner (i.e., 16-place microcentrifuge for 0.2 mL tubes) | USA Scientific | 2621-0016 | This model does not have any speed control. It is simply used to collect liquid at the bottom of tubes. |
| PCR tubes: TempAssure 0.2 mL PCR 8-tube strips | USA Scientific | 1402-3900 | If substituted, levels of potential polymer contamination from other plates should be assessed prior to SCoPE2 preparation. |
| Phosphate-buffered saline (PBS), 10x, pH 7.4, RNase-free | Thermo Fisher Scientific | AM9625 | |
| Plate spinner (i.e., PlateFuge microcentrifuge) | Benchmark Scientific | Model C2000 | This model does not have any speed control. It is simply used to collect liquid at the bottom of wells. |
| Thermal Cycler (i.e., C1000 Touch with 384-well module) | Biorad | 1851138 | |
| TMTpro 16plex Label Reagent Set, 1 x 5 mg | Thermo Fisher Scientific | A44520 | |
| Triethylammonium bicarbonate (TEAB), 1 M, pH 8.5 | Sigma Aldrich | T7408100ML | |
| Trypsin Gold Mass Spectrometry Grade | Promega | V5280 | This is trypsin is of very high purity. Other trypsin reagents can vary in their levels of purity. Level of purity is important for achieving positive SCoPE2 results. Caution: Trypsin can cause skin, respiratory, and eye irritation. Be sure to wear personal protective equipment. Handle under a chemical fume hood. |
| Vortex (Analog vortex mixer) | VWR | Model 58816-121 | |
| Water bath sonicator (i.e., 2.8 L ultrasonic cleaner with digital timer) | VWR | 97043964 | |
| Water, Optima LC-MS/MS grade | Fisher Scientific | W6-1 | All solutions that need to be diluted or made are recommended to be made with mass-spectrometry grade water. Any dilutions and/or master mixes should be made fresh. Contamination resulting from lower-grade water can negatively affect peptide detection and single-cell data quality . |
References
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