Eencellige proteomics voorbereiding voor massaspectrometrie-analyse met behulp van freeze-heat lysis en een isobare drager
Summary
In dit protocol beschrijven we hoe zoogdiercellen kunnen worden voorbereid op eencellige proteomics-analyse via massaspectrometrie met behulp van in de handel verkrijgbare reagentia en apparatuur, met opties voor zowel handmatig als automatisch pipetteren.
Abstract
Eencellige proteomics-analyse vereist gevoelige, kwantitatief nauwkeurige, breed toegankelijke en robuuste methoden. Om aan deze vereisten te voldoen, is het Single-Cell ProtEomics (SCoPE2) -protocol ontwikkeld als een methode van de tweede generatie voor het kwantificeren van honderden tot duizenden eiwitten uit beperkte monsters, tot op het niveau van een enkele cel. Experimenten met deze methode hebben meer dan 3.000 eiwitten gekwantificeerd in 1.500 enkele zoogdiercellen (500-1.000 eiwitten per cel) in 10 dagen massaspectrometerinstrumenttijd. SCoPE2 maakt gebruik van een vrieswarmtecyclus voor cellyse, waardoor de noodzaak voor het opruimen van afzonderlijke cellen wordt vermeden en bijgevolg monsterverliezen worden verminderd, terwijl de monstervoorbereiding wordt versneld en de automatisering ervan wordt vereenvoudigd. Bovendien maakt de methode gebruik van een isobare drager, die de identificatie van eiwitten bevordert en monsterverliezen vermindert.
Dit videoprotocol biedt gedetailleerde richtlijnen om de toepassing van geautomatiseerde eencellige eiwitanalyse mogelijk te maken met alleen apparatuur en reagentia die breed toegankelijk zijn. We demonstreren kritieke stappen in de procedure voor het voorbereiden van afzonderlijke cellen voor proteomische analyse, van oogsten tot injectie tot vloeistofchromatografie-tandem massaspectrometrie (LC-MS / MS) analyse. Bovendien worden kijkers geleid door de principes van experimenteel ontwerp met de isobare drager, kwaliteitscontrole voor zowel isobare drager als eencellige preparaten, en representatieve resultaten met een bespreking van de beperkingen van de aanpak.
Introduction
Eencellige analyse wordt veel gebruikt om het niveau van heterogeniteit binnen biologische systemen te bestuderen dat anders niet te onderscheiden zou zijn door bulkmetingen 1,2,3. Een dergelijke cellulaire diversiteit kan functionele gevolgen hebben die het begrip van integrale biologische processen kunnen bevorderen, van therapeutische resistentietegen kankercellen 4,5,6 tot cel-tot-cel heterogeniteit bij diabetes 7,8,9,10. Veel onderzoeken hebben zich gericht op het meten van nucleïnezuren in afzonderlijke cellen, door genetische of transcriptomische niveaus te meten en hebben de classificatie van celtypen en -toestanden mogelijk gemaakt. Een dergelijke vooruitgang in de nucleïnezuurruimte kan echter niet de kenniskloof van post-transcriptionele regulatieopvullen 11, waardoor de behoefte aan eiwitmetingen met vergelijkbare hoge doorvoer in enkele cellen 12,13,14,15 wordt gestimuleerd.
We hebben SCoPE216,17 ontwikkeld om tegemoet te komen aan de vraag naar rigoureuze en robuuste eencellige proteomica van zoogdiersystemen. Het is een multiplexmethode, die een verhoogde doorvoer mogelijk maakt door veel cellen parallel18 te labelen en te analyseren, in tegenstelling tot labelvrije mthods die één cel tegelijk analyseren19,20. De monstervoorbereidingsmethodologie, massaspectrometriebenadering en daaropvolgende gegevensanalysestappen maken een nauwkeurige kwantificering van honderden tot duizenden eiwitten per enkele cel mogelijk. Deze methode maakt massaspectrometrie-analyse van enkele cellen mogelijk via de isobare drager21, een klein bulkmonster van cellen (meestal 25-200) dat biologisch vergelijkbaar is met de eencellige populatie van belang. Dit dragermateriaal wordt gemultiplext in een set met een referentiekanaal van hetzelfde materiaal en enkele cellen door het gebruik van tandemmassatags (TMT-labels). Het dragerkanaal vermindert het verlies van monsters naar oppervlakten en biedt de ionenbackbonefragmenten voor succesvolle peptide-identificatie. Het referentiekanaal, dat in bulk wordt bereid en vervolgens wordt verdund tot 5-10 celequivalenten voor elke eencellige set, helpt de technische variabiliteit in de analyse te beheersen. In het bijzonder maakt de referentie de normalisatie mogelijk van variabiliteit veroorzaakt door LC-MS / MS-gerelateerde effecten, zoals ionenbemonstering en ionisatie-efficiëntie. Meestal worden de referentie en de dragerkanalen gemaakt van dezelfde celpopulatie.
Dit monstervoorbereidingsprotocol is een methode van de tweede generatie die voortbouwt op SCoPE-MS22 door meerdere synergetische verbeteringen. De verbeteringen omvatten een cellysismethode die het opruimen van monsters vermijdt, wat een veel voorkomende stap is van MS-proteomics-preparaten. Het maakt gebruik van mPOP (minimale proteomic sample preparation)23, een vrieswarmtelysismethode. Deze methode maakte lysis van enkele cellen in kleinere volumes en in multiwell-platen mogelijk in plaats van in flacons, waardoor een hogere doorvoersnelheid en automatisering door thermische cyclers mogelijk werd. Al met al heeft deze methode de kosten per enkele cel verlaagd en de kwantitatieve nauwkeurigheid verhoogd in vergelijking met SCoPE-MS16,24.
Dit protocol beschrijft hoe afzonderlijke cellen moeten worden voorbereid voor proteomische analyse, inclusief hoe de drager- en referentiekanalen kunnen worden voorbereid met behulp van TMTpro 18-plex isobare labels. Zoogdiercellen die zich in eencellige suspensie bevinden en die kunnen worden geïsoleerd in platen met 384 putten, zijn waarschijnlijk vatbaar voor dit protocol. Ook inbegrepen zijn representatieve resultaten van succesvolle eencellige sets, die verschillende kwaliteitscontroleplots weergeven die zijn gegenereerd door een R Shiny-app, DO-MS25. Andere gepubliceerde softwaretools26,27 en experimentele richtlijnen17,21 hebben de adoptie van dit protocol verbeterd. We hopen dat deze visuele gids onderzoekers verder zal helpen bij het uitvoeren van eencellige proteomics-experimenten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Een van de sleutels tot succesvolle voorbereiding en analyse van afzonderlijke cellen door SCoPE2 is de voorbereiding van de drager en referentiekanalen. De voorgestelde dragergrootte is 100 tot 200 cellen; het aantal cellen dat nodig is voor een bepaald eencellig experiment kan echter worden bepaald op basis van principes zoals elders besproken21. Voor de voorgestelde grootte zijn ten minste ~ 11.275 cellen nodig per 384-well plaat, waardoor een 200-cel drager en 5-cel referentie in elke set mogelijk is. Het kan voordelig zijn om meer cellen te isoleren als de gewenste celpopulaties geen beperkende factor zijn, om gewoon extra materiaal te hebben in geval van fouten (zoals in dit protocol werd gedaan, waarbij 22.000 cellen worden geïsoleerd in plaats van 11.275 cellen). De hoeveelheid drager en referentie die nodig is voor het aantal gewenste platen moet in één batch worden bereid om elke batch-tot-batchvariatie te minimaliseren die ertoe kan leiden dat peptide-identificatie of kwantificering tussen batches verschilt.
Voordat u enkele cellen isoleert in putten van een 384-well plaat, is het belangrijk om het ontwerp van de plaatlay-out te overwegen. Binnen elke 384-well plaat wordt aanbevolen om zowel positieve als negatieve controles te implementeren. Negatieve controles zijn putten waarin geen cellen worden toegevoegd, maar dezelfde reagenstoevoegingen en procedures ondergaan als de eencellige putten. Positieve controles zijn putten waarin cellysaat verdund tot 2-5 cellen / μL wordt toegevoegd in plaats van enkele cellen. Dit is vooral belangrijk om te implementeren wanneer eencellige isolatiemethoden niet goed gevalideerd zijn. Elke 384-well plaat zou idealiter een gerandomiseerde verdeling van enkele cellen en controles moeten hebben (bijvoorbeeld geen negatieve of positieve controles in slechts één rij). Elke plaat moet een gelijke verdeling hebben van alle celpopulaties van belang, in plaats van het isoleren van één celtype in één plaat en een tweede celtype in een tweede plaat. Dit voorkomt dat batcheffecten worden gekoppeld aan celtypen van belang. Bovendien, als er meer dan één 384-well plaat nodig is voor analyse, is het raadzaam om cellen in één sessie te isoleren, in plaats van de isolatiestap over meerdere dagen te spreiden, indien mogelijk.
Lysis van zowel enkele cellen als drager/referentie vindt plaats in water via een vrieswarmtecyclus23. Verwacht wordt dat de meeste proteasen tijdens deze stap zijn gedenatureerd. Trypsine wordt dan onmiddellijk na de denaturatiestap toegevoegd in een hoge concentratie, vele ordes van grootte groter in concentratie dan zelfs de meest voorkomende cellulaire proteasen. Door massale actie zullen de meeste producten van protease-activiteit te wijten zijn aan trypsine.
Reductie/alkylering van cysteïneresiduen wordt in dit protocol niet uitgevoerd vóór trypsinevertering. Cysteïnebevattende peptiden vertegenwoordigen ongeveer 10% van de tryptische peptiden uit het menselijke proteoom. We zien minder cysteïnebevattende peptiden met behulp van een aanpak zonder reductie / alkylering. Deze stappen gebruiken reagentia die niet compatibel zijn met etikettering door TMT (NHS-esterchemie) onmiddellijk na de spijsvertering.
In deze TMT-etiketteringsstrategie worden de drager en referenties gelabeld met respectievelijk 126 en 127N, terwijl eencellige en controleputten worden gelabeld met 128C tot en met 135N. De twee labels na de referentie, 127C en 128N, worden niet gebruikt vanwege isotopische kruisbesmetting als gevolg van de drager en referentiekanalen, die duidelijk veel overvloediger zijn in peptidemateriaal dan de afzonderlijke cellen. In totaal zijn er 12 TMT-kanalen per set die kunnen worden gebruikt voor het labelen van afzonderlijke cellen of controleputten met TMTpro-16plex, of 14 TMT-kanalen per set met TMTpro-18plex.
De kritieke stappen in het protocol om eencellige proteomics-metingen uit te voeren met behulp van dit protocol omvatten voorbereiding van de drager, eencellige isolatie, lysis, spijsvertering, barcode-etikettering en de juiste massaspectrometrieparameters. Deze stappen zijn in dit document beschreven en zijn elders uitgebreid beschreven 17,21,25. Elke stap heeft een overeenkomstig perceel of set percelen in DO-MS die een eenvoudige kwaliteitscontrole mogelijk maken. In het geval van een succesvolle creatie van de drager, maken plots met het aantal geïdentificeerde peptiden, de etiketteringsefficiëntie en het percentage miscleavage-snelheid bijvoorbeeld verificatie van de succesvolle bereiding mogelijk. Representatieve DO-MS-rapporten zijn opgenomen in deze publicatie en zijn te zien op http://scope2.slavovlab.net/ voor de oorspronkelijke gegevens16. Deze DO-MS-rapporten maken het mogelijk om de optimalisatie van de methode te beoordelen in richtingen die nog niet door de auteurs zijn onderzocht, zoals langere LC-gradiënten, verschillende spijsverteringsenzymen of alternatieve chemische barcodes.
Momenteel beperkt de seriële analyse van peptiden door gegevensafhankelijke acquisitie-algoritmen het aantal peptiden dat kan worden geanalyseerd in een LC-run van een redelijke lengte. Dit is deels te wijten aan de langere vultijden die nodig zijn voor de succesvolle verwerving van voldoende ionen voor betrouwbare eencellige kwantificering21. Een inherente beperking van het gebruik van de drager is het gebrek aan directe beoordeling van de spijsvertering en etiketteringsefficiëntie van de afzonderlijke cellen. Momenteel is een oplossing voor deze beperking het uitvoeren van kwaliteitscontrole op een groter monster dat naast de afzonderlijke cellen wordt verwerkt.
We stelden een aantal mogelijkheden voor om eencellige proteomics te verbeteren, zoals het bouwen van massaspectrometers met meerdere analyzers. De huidige methode maakt de kwantificering mogelijk van duizenden eiwitten uit afzonderlijke zoogdiercellen met een snelheid van ongeveer 100 cellen per dag met in de handel verkrijgbare reagentia en apparatuur. SCoPE2, de tweede generatie van de SCoPE-MS-benadering, verbeterde aanzienlijk ten opzichte van zijn voorganger met betrekking tot het aantal cellen dat per tijdseenheid kan worden geanalyseerd, het aantal eiwitten dat per tijdseenheid kan worden geanalyseerd, de tijd die nodig is voor monstervoorbereiding, de toegankelijkheid van reagentia en apparatuur, en de totale kosten van voorbereiding en analyse per enkele cel. Membraangebonden eiwitten zijn toegankelijk met behulp van de vrieswarmtelyse en proteasevertering, zoals blijkt uit vergelijking met ureumlysis23. De methode identificeert veel eiwitten uit het bovenste derde deel van het proteoom met betrekking tot abundantie16. Als de gemodificeerde proteoform zich in het bovenste derde deel van het proteoom bevindt en het gemodificeerde peptide vatbaar is voor massaspectrometrie-analyse (ioniseert goed, heeft een massaverschil met ongewijzigd peptide), zal het waarschijnlijker ontvankelijk zijn voor dit protocol. Deze methode kan vruchtbaar worden toegepast in biologische systemen waar sprake is van betekenisvolle heterogeniteit tussen cellen, zoals in differentiatie, senescentie of immunologische reacties (d.w.z. fagocytose).
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We willen graag de herfst 2021 NSF I-Corps Program (Northeastern University site) award erkennen die deze publicatie heeft gefinancierd.
Materials
| 384-well plate, standard PCR plate | Thermo Fisher Scientific | AB1384 | Polypropylene plates should be used, if need to substitute. If substituted, levels of potential polymer contamination from other plates should be assessed prior to SCoPE2 preparation. |
| Acetonitrile (for preparation of buffers), Optima LC-MS/MS grade | Fisher Scientific | A955-1 | This acetonitrile is used for any buffers, namely the 50% acetonitrile that is used to pass through wells after passing through the carrier and reference when combining SCoPE2 sets. Caution: Acetonitrile is a flammable liquid. It can irritate skin, eyes, respiratory tract, and central nervous system. Be sure to wear personal protective equipment. Handle under a chemical fume hood. |
| Acetonitrile (for preparation of TMT ), anhydrous, 99.8% | Sigma Aldrich | 271004-100ML | This acetonitrile is used to resuspend TMT labels at the manufacturer concentration. Caution: Acetonitrile is a flammable liquid. It can irritate skin, eyes, respiratory tract, and central nervous system. Be sure to wear personal protective equipment. Handle under a chemical fume hood. |
| Adhesive PCR plate foils | Thermo Fisher Scientific | AB0626 | |
| Autosampler vial screw thread caps | Thermo Fisher Scientific | C5000-51B | |
| Autosampler vial spinner (i.e. myFuge 5) | MTC Bio | C2595 | This model does not have any speed control. It is simply used to colelct liquid at the bottom of autosampler vials. |
| Benzonase nuclease | Sigma Aldrich | E1014-25KU | |
| Clear glass screw thread vials, 9 mm | Thermo Fisher Scientific | 60180-509 | |
| Formic Acid, Pierce, LC-MS/MS grade | Thermo Fisher Scientific | 85178 | Caution: Formic acid is a flammable liquid. It can cause serious eye damage or skin burns. Be sure to wear personal protective equipment. Handle in a well-ventilated area. |
| Glass autosampler inserts, 9 mm | Thermo Fisher Scientific | C4010-630 | |
| Hydroxylamine (HA), 50% wt/vol | Sigma Aldrich | 467804-50ML | Caution: Hydroxylamine can cause skin irritation. Be sure to wear personal protective equipment. |
| Mantis microfluidic chips, low-volume 3PFE chips | Formulatrix | MCLVPR2 | These chips are meant to be used with the Mantis microfluidics liquid handler to dispense organic solutions. These can be used to dispense TMT labels. |
| Mantis microfluidic chips, low-volume silicone chips | Formulatrix | MCLVS12 | These chips are meant to be used with the Mantis microfluidics liquid handler to dispense aqueous solutions. These cannot be used to dispense TMT labels. |
| Mantis microfluidic liquid handler | Formulatrix | Liquid handler can be substituted. However, it is important to check if the system is compatible with 100% acetonitrile (as in the case of TMT labels), and that the system does not introduce polymer contamination or other type of contamination into the samples. | |
| Mantis PCR plate adapter with wide conical pins for automated plate handling | Formulatrix | 232400 | |
| MassPREP peptide mixture | Waters | 186002337 | Mixture of nine nontryptic peptides |
| PCR tube spinner (i.e., 16-place microcentrifuge for 0.2 mL tubes) | USA Scientific | 2621-0016 | This model does not have any speed control. It is simply used to collect liquid at the bottom of tubes. |
| PCR tubes: TempAssure 0.2 mL PCR 8-tube strips | USA Scientific | 1402-3900 | If substituted, levels of potential polymer contamination from other plates should be assessed prior to SCoPE2 preparation. |
| Phosphate-buffered saline (PBS), 10x, pH 7.4, RNase-free | Thermo Fisher Scientific | AM9625 | |
| Plate spinner (i.e., PlateFuge microcentrifuge) | Benchmark Scientific | Model C2000 | This model does not have any speed control. It is simply used to collect liquid at the bottom of wells. |
| Thermal Cycler (i.e., C1000 Touch with 384-well module) | Biorad | 1851138 | |
| TMTpro 16plex Label Reagent Set, 1 x 5 mg | Thermo Fisher Scientific | A44520 | |
| Triethylammonium bicarbonate (TEAB), 1 M, pH 8.5 | Sigma Aldrich | T7408100ML | |
| Trypsin Gold Mass Spectrometry Grade | Promega | V5280 | This is trypsin is of very high purity. Other trypsin reagents can vary in their levels of purity. Level of purity is important for achieving positive SCoPE2 results. Caution: Trypsin can cause skin, respiratory, and eye irritation. Be sure to wear personal protective equipment. Handle under a chemical fume hood. |
| Vortex (Analog vortex mixer) | VWR | Model 58816-121 | |
| Water bath sonicator (i.e., 2.8 L ultrasonic cleaner with digital timer) | VWR | 97043964 | |
| Water, Optima LC-MS/MS grade | Fisher Scientific | W6-1 | All solutions that need to be diluted or made are recommended to be made with mass-spectrometry grade water. Any dilutions and/or master mixes should be made fresh. Contamination resulting from lower-grade water can negatively affect peptide detection and single-cell data quality . |
References
- Symmons, O., Raj, A. What’s luck got to do with it: single cells, multiple fates, and biological nondeterminism. Molecular Cell. 62 (5), 788-802 (2016).
- Paul, I., White, C., Turcinovic, I., Emili, A. Imaging the future: the emerging era of single-cell spatial proteomics. The FEBS Journal. 288 (24), 6990-7001 (2020).
- Levy, E., Slavov, N. Single cell protein analysis for systems biology. Essays in Biochemistry. 62 (4), 595-605 (2018).
- Nagasawa, S., Kashima, Y., Suzuki, A., Suzuki, Y. Single-cell and spatial analyses of cancer cells: toward elucidating the molecular mechanisms of clonal evolution and drug resistance acquisition. Inflammation and Regeneration. 41 (1), 22 (2021).
- Shaffer, S. M., et al. Rare cell variability and drug-induced reprogramming as a mode of cancer drug resistance. Nature. 555 (7695), 274 (2018).
- Pan, D., Jia, D. Application of single-cell multi-omics in dissecting cancer cell plasticity and tumor heterogeneity. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 757024 (2021).
- Segerstolpe, &. #. 1. 9. 7. ;., et al. Single-cell transcriptome profiling of human pancreatic islets in health and type 2 diabetes. Cell Metabolism. 24 (4), 593-607 (2016).
- Tritschler, S., Theis, F. J., Lickert, H., Böttcher, A. Systematic single-cell analysis provides new insights into heterogeneity and plasticity of the pancreas. Molecular Metabolism. 6 (9), 974-990 (2017).
- Hanna, S. J., Tatovic, D., Thayer, T. C., Dayan, C. M. Insights from single cell rna sequencing into the immunology of type 1 diabetes- cell phenotypes and antigen specificity. Frontiers in Immunology. 12, 751701 (2021).
- Baron, M., et al. A single-cell transcriptomic map of the human and mouse pancreas reveals inter- and intra-cell population structure. Cell Systems. 3 (4), 346-360 (2016).
- Franks, A., Airoldi, E., Slavov, N. Post-transcriptional regulation across human tissues. PLoS Computational Biology. 13 (5), 1005535 (2017).
- Slavov, N. Unpicking the proteome in single cells. Science. 367 (6477), 512-513 (2020).
- Specht, H., Slavov, N. Transformative opportunities for single-cell proteomics. Journal of Proteome Research. 17 (8), 2565-2571 (2018).
- Slavov, N. Learning from natural variation across the proteomes of single cells. PLoS Biology. , (2021).
- Slavov, N. Driving single cell proteomics forward with innovation. Journal of Proteome Research. 20 (11), 4915-4918 (2021).
- Specht, H., et al. Single-cell proteomic and transcriptomic analysis of macrophage heterogeneity using SCoPE2. Genome Biology. 22 (1), 50 (2021).
- Petelski, A. A., et al. Multiplexed single-cell proteomics using SCoPE2. Nature Protocols. 16 (12), 5398-5425 (2021).
- Slavov, N. Scaling up single-cell proteomics. Molecular and Cellular Proteomics: MCP. 21 (1), 100179 (2022).
- Cong, Y., et al. Ultrasensitive single-cell proteomics workflow identifies> 1000 protein groups per mammalian cell. Chemical Science. 12 (3), 1001-1006 (2021).
- Lombard-Banek, C., et al. In vivo subcellular mass spectrometry enables proteo-metabolomic single-cell systems biology in a chordate embryo developing to a normally behaving tadpole (X. laevis). Angewandte Chemie. 60 (23), 12852-12858 (2021).
- Specht, H., Slavov, N. Optimizing accuracy and depth of protein quantification in experiments using isobaric carriers. Journal of Proteome Research. 20 (1), 880-887 (2020).
- Budnik, B., Levy, E., Harmange, G., Slavov, N. SCoPE-MS: mass spectrometry of single mammalian cells quantifies proteome heterogeneity during cell differentiation. Genome Biology. 19 (1), 161 (2018).
- Specht, H., Harmange, G., Perlman, D. H., Emmott, E. Automated sample preparation for high-throughput single-cell proteomics. BioRxiv. , (2018).
- Singh, A. Towards resolving proteomes in single cells. Nature Methods. 18 (8), 856 (2021).
- Huffman, R. G., Chen, A., Specht, H., Slavov, N. DO-MS: Data-driven optimization of mass spectrometry methods. Journal of Proteome Research. 18 (6), 2493-2500 (2019).
- Chen, A. T., Franks, A., Slavov, N. DART-ID increases single-cell proteome coverage. PLoS Computational Biology. 15 (7), 1007082 (2019).
- Cheung, T. K., et al. Defining the carrier proteome limit for single-cell proteomics. Nature Methods. 18 (1), 76-83 (2021).
- Leduc, A., Huffman, R. G., Slavov, N. Droplet sample preparation for single-cell proteomics applied to the cell cycle. bioRxiv. , (2021).
- Vanderaa, C., Gatto, L. Utilizing Scp for the analysis and replication of single-cell proteomics data. bioRxiv. , (2021).
