Doğal Öldürücü Hücreler ve Nosiseptör Nöronlar Arasındaki Etkileşimi Ortaya Çıkarmak
Summary
Nosiseptör nöronlar ve NK hücreleri aktif olarak enflamatuar bir bağlamda etkileşime girer. Bir ortak kültür yaklaşımı, bu etkileşimi incelemeyi sağlar.
Abstract
Somatosensoriyel nöronlar, zararlı uyaranları tespit etmek ve savunma reflekslerini aktive etmek için evrimleşmiştir. İletişim araçlarını paylaşarak, nosiseptör nöronlar ayrıca bağışıklık sisteminin aktivitesini kontrol ederek konakçı savunmasını da ayarlar. Bu sistemler arasındaki iletişim çoğunlukla adaptiftir, homeostazı korumaya yardımcı olur, ayrıca kronik hastalıkların başlangıcına yol açabilir veya teşvik edebilir. Her iki sistem de, birincil ve ikincil lenfoid dokularda ve mukozada bulunan bu tür lokal etkileşime izin vermek için birlikte evrimleşmiştir. Son zamanlarda yapılan çalışmalar, nosiseptörlerin yabancı antijenleri, bağışıklık hücresi kaynaklı sitokinleri ve mikropları doğrudan tespit ettiğini ve bunlara yanıt verdiğini göstermiştir.
Nosiseptör aktivasyonu sadece ağrı aşırı duyarlılığı ve kaşıntı ile sonuçlanmaz, aynı zamanda nosiseptör ateşleme eşiğini düşürür ve nöropeptitlerin lokal salınımına yol açar. Nosiseptörlerin periferik terminalleri tarafından üretilen ve salınan peptitler, lenfositlerin kemotaksisini ve polarizasyonunu bloke edebilir, inflamasyonun lokalizasyonunu, süresini ve tipini kontrol edebilir. Son kanıtlar, duyusal nöronların doğuştan gelen bağışıklık hücreleriyle hücre-hücre teması yoluyla etkileşime girdiğini, örneğin doğal öldürücü (NK) hücreler üzerindeki grup 2D (NKG2D) reseptörlerini kullandığını göstermektedir.
NK hücrelerinin çeşitli nosiseptör tarafından üretilen mediatörler için konyak reseptörlerini eksprese ettiği göz önüne alındığında, nosiseptörlerin NK hücrelerinin aktivitesini kontrol etmek için nöropeptitler kullandıkları düşünülebilir. Burada, bir tabaktaki nosiseptör nöron-NK hücre etkileşimlerini incelemek için bir ko-kültür yöntemi geliştirdik. Bu yaklaşımı kullanarak, lomber nosiseptör nöronların NK hücre sitokin ekspresyonunu azalttığını bulduk. Genel olarak, böyle bir indirgemeci yöntem, tümör innerve edici nöronların NK hücrelerinin antikanser fonksiyonunu nasıl kontrol ettiğini ve NK hücrelerinin yaralı nöronların ortadan kaldırılmasını nasıl kontrol ettiğini incelemek için yararlı olabilir.
Introduction
Duyusal nöronların hücre gövdeleri dorsal kök ganglionlarından (DRG) kaynaklanır. DRG, periferik sinir sisteminde (PNS), omuriliğin dorsal boynuzu ile periferik sinir terminalleri arasında bulunur. DRG nöronlarının psödo-unipolar doğası, hedef dokuyu innerve eden periferik daldan, somatosensoriyel bilgiyi omuriliğe taşıyan merkezi dala bilgi aktarımına izin verir1. Özel iyon kanalı reseptörleri kullanarak, birinci dereceden nöronlar patojenlerin, alerjenlerin ve kirleticilerinoluşturduğu tehditleri algılar 2, bu da katyonların akışına (Na +, Ca2 +) ve bir aksiyon potansiyelinin üretilmesine yol açar 3,4,5.
Bu nöronlar ayrıca, ilk tehlike algılamasının gerçekleştiği çevreye doğru antidromik etki potansiyeli gönderir ve bu da nöropeptitlerin lokal salınımına yol açar 1,4. Bu nedenle, nosiseptör nöronlar, konağı çevresel tehlikeye karşı uyaran koruyucu bir mekanizma görevi görür 4,5,6,7.
İkinci dereceden nöronlarla iletişim kurmak için, nosiseptörler çeşitli nörotransmiterleri (örneğin, glutamat) ve nöropeptitleri (örneğin, kalsitonin geni ile ilişkili peptid (CGRP), madde P (SP) ve vazoaktif bağırsak peptidi (VIP))6,7 serbest bırakır. Bu peptitler kılcal damarlara etki eder ve plazma ekstravazasyonunu, ödemi ve bağışıklık hücrelerinin lokal akışını ve modülasyonunu teşvik eder 2,4,7.
Somatosensoriyel ve bağışıklık sistemleri, sitokinler ve nöropeptitlerden ve bunların ilgili konyak reseptörlerinden oluşan ortak bir iletişim sistemi kullanır4. Bu çift yönlü iletişim, tehlikeden korunmaya ve homeostazı korumaya yardımcı olurken, aynı zamanda hastalık patofizyolojisine de katkıda bulunabilir4.
NK hücreleri doğuştan gelen lenfoid hücreler olarak sınıflandırılır ve viral olarak enfekte olmuş hücreleri ortadan kaldırmak için uzmanlaşmıştır. NK hücre fonksiyonu, aktive edici reseptör NKG2D8 de dahil olmak üzere uyarıcı ve inhibitör reseptörlerin bir dengesi tarafından yönetilir. NKG2D’nin endojen ligandı olan retinoik asit erken indüklenebilir1 (RAE1), tümörigenez ve enfeksiyon 8,9 gibi stres altındaki hücreler tarafından eksprese edilir.
Son zamanlarda yapılan araştırmalar, periferik sinir hasarının duyusal nöronları stathmin 2 (STMN2) ve RAE1 gibi uyumsuz molekülleri eksprese etmeye yönlendirdiğini göstermiştir. Böylece, hücre-hücre teması yoluyla, NKG2D eksprese eden NK hücreleri, RAE1 eksprese eden nöronlarla etkileşim yoluyla aktive edildi. Buna karşılık, NK hücreleri yaralı nosiseptör nöronları ve normalde sinir hasarı ile ilişkili künt ağrı aşırı duyarlılığını ortadan kaldırabildi10. NKG2D-RAE1 eksenine ek olarak, NK hücreleri çeşitli nosiseptör tarafından üretilen mediatörler için konyak reseptörlerini eksprese eder. Bu nedenle, bu mediatörlerin NK hücre aktivitesini modüle etmeleri mümkündür. Bu yazıda nosiseptör nöron-NK hücre etkileşiminin biyolojisini araştırmak için bir ko-kültür yöntemi sunulmaktadır. Bu yaklaşım, nosiseptör nöronların doğuştan gelen bağışıklık hücresi yanıtlarını yaralanmaya, enfeksiyona veya maligniteye nasıl modüle ettiğinin anlaşılmasına yardımcı olacaktır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Davies ve ark.11 , yaralı nöronların RAE1’i yukarı regüle ettiğini bulmuşlardır. Hücre-hücre teması yoluyla , NKG2D eksprese eden NK hücreleri daha sonra RAE1 + nöronlarını tanımlayabilir ve ortadan kaldırabilir ve bu da kronik ağrıyı sınırlayabilir11. NK hücrelerinin ayrıca çeşitli nöropeptit reseptörlerini de eksprese ettiği ve bu nöropeptitlerin immünomodülatör yetenekleri ile bilindiği göz önüne alındığında, N…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Araştırma Fonu’nda Yeni Sınırlar (NFRFE201901326), Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitüleri (162211, 461274, 461275), Kanada İnovasyon Vakfı (37439), Kanada Araştırma Başkanı programı (950-231859), Kanada Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi (RGPIN-2019-06824) ve Fonds de Recherche du Québec Nature et technologies (253380) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Anti-mouse CD16/32 | Jackson Laboratory | Cat no: 017769 | |
| B-27 | Jackson Laboratory | Cat no: 009669 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) culture grade | World Precision Instruments | Cat no: 504167 | |
| BV421 anti-mouse NK-1.1 | Fisher Scientific | Cat no: 12430112 | |
| Cell strainer (50 μm) | Fisher Scientific | Cat no: A3160702 | |
| Collagenase IV | Fisher Scientific | Cat no: 15140148 | |
| Diphteria toxinfl/fl | Fisher Scientific | Cat no: SH3057402 | |
| Dispase II | Fisher Scientific | Cat no: 13-678-20B | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Fisher Scientific | Cat no: 07-200-95 | |
| EasySep Mouse NK Cell Isolation Kit | Sigma | Cat no: CLS2595 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma | Cat no: C0130 | |
| FACSAria III | Sigma | Cat no: 04942078001 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma | Cat no: 806552 | |
| FITC anti-mouse NKp46 | Sigma | Cat no: L2020 | |
| Flat bottom 96-well plate | Sigma | Cat no: 03690 | |
| Glass Pasteur pipette | Sigma | Cat no: 470236-274 | |
| Glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) | VWR | Cat no: 02-0131 | |
| Laminin | Cedarlane | Cat no: 03-50/31 | |
| L-Glutamine | Gibco | Cat no: A14867-01 | |
| Mouse recombinant IL-15 | Gibco | Cat no: 22400-089 | |
| Mouse recombinant IL-2 | Gibco | Cat no: 21103-049 | |
| Nerve Growth Factor (NGF) | Life Technologies | Cat no: 13257-019 | |
| Neurobasal media | PeproTech | Cat no: 450-51-10 | |
| PE anti-mouse GM-CSF | PeproTech | Cat no: 212-12 | |
| Penicillin and Streptomycin | PeproTech | Cat no: 210-15 | |
| Pestles | Stem Cell Technology | Cat no: 19855 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Biolegend | Cat no: 108732 | Clone PK136 |
| RPMI 1640 media | Biolegend | Cat no: 137606 | Clone 29A1.4 |
| TRPV1Cre | Biolegend | Cat no: 505406 | Clone MP1-22E9 |
| Tweezers and dissection tools. | Biolegend | Cat no: 65-0865-14 | |
| U-Shaped-bottom 96-well plate | Biolegend | Cat no: 101319 | |
| Viability Dye eFlour-780 | Becton Dickinson |
References
- Berta, T., Qadri, Y., Tan, P. H., Ji, R. R. Targeting dorsal root ganglia and primary sensory neurons for the treatment of chronic pain. Expert Opinion on Therapeutic Targets. 21 (7), 695-703 (2017).
- Baral, P., et al. Nociceptor sensory neurons suppress neutrophil and gammadelta T cell responses in bacterial lung infections and lethal pneumonia. Nature Medicine. 24, 417-426 (2018).
- Binshtok, A. M., et al. Nociceptors are interleukin-1beta sensors. Journal of Neuroscience. 28 (52), 14062-14073 (2008).
- Chesne, J., Cardoso, V., Veiga-Fernandes, H. Neuro-immune regulation of mucosal physiology. Mucosal Immunology. 12 (1), 10-20 (2019).
- Samad, T. A., et al. Interleukin-1beta-mediated induction of Cox-2 in the CNS contributes to inflammatory pain hypersensitivity. Nature. 410 (6827), 471-475 (2001).
- Godinho-Silva, C., et al. Light-entrained and brain-tuned circadian circuits regulate ILC3s and gut homeostasis. Nature. 574, 254-258 (2019).
- Talbot, J., et al. Feeding-dependent VIP neuron-ILC3 circuit regulates the intestinal barrier. Nature. 579, 575-580 (2020).
- Raulet, D. H., Gasser, S., Gowen, B. G., Deng, W., Jung, H. Regulation of ligands for the NKG2D activating receptor. Annual Review of Immunology. 31, 413-441 (2013).
- Vivier, E., et al. Innate or adaptive immunity? The example of natural killer cells. Science. 331, 44-49 (2011).
- Davies, A. J., et al. Natural Killer Cells Degenerate Intact Sensory Afferents following Nerve Injury. Cell. 176, 716-728 (2019).
- Perner, C., Sokol, C. L. Protocol for dissection and culture of murine dorsal root ganglia neurons to study neuropeptide release. STAR Protocols. 2, 100333 (2021).
- Goswami, S. C., et al. Molecular signatures of mouse TRPV1-lineage neurons revealed by RNA-Seq transcriptome analysis. Journal of Pain. 15, 1338-1359 (2014).
- Mishra, S. K., Tisel, S. M., Orestes, P., Bhangoo, S. K., Hoon, M. A. TRPV1-lineage neurons are required for thermal sensation. EMBO J. 30, 582-593 (2011).
- Kim, H. S., et al. Attenuation of natural killer cell functions by capsaicin through a direct and TRPV1-independent mechanism. Carcinogenesis. 35, 1652-1660 (2014).
