Поддразнивание взаимодействия между естественными клетками-киллерами и нейронами ноцицепторов
Summary
Ноцицепторные нейроны и NK-клетки активно взаимодействуют в воспалительном контексте. Кокультурный подход позволяет изучать это взаимодействие.
Abstract
Соматосенсорные нейроны эволюционировали для обнаружения вредных раздражителей и активации защитных рефлексов. Разделяя средства связи, ноцицепторные нейроны также настраивают защиту хозяина, контролируя активность иммунной системы. Связь между этими системами в основном адаптивная, помогая защитить гомеостаз, она также может привести или способствовать возникновению хронических заболеваний. Обе системы совместно эволюционировали, чтобы обеспечить такое локальное взаимодействие, как в первичных и вторичных лимфоидных тканях и слизистой оболочке. Недавние исследования показали, что ноцицепторы непосредственно обнаруживают и реагируют на чужеродные антигены, цитокины, полученные из иммунных клеток, и микробы.
Активация ноцицепторов не только приводит к гиперчувствительности к боли и зуду, но и снижает порог срабатывания ноцицепторов, что приводит к локальному высвобождению нейропептидов. Пептиды, которые вырабатываются периферическими терминалами ноцицепторов и высвобождаются из них, могут блокировать хемотаксис и поляризацию лимфоцитов, контролируя локализацию, продолжительность и тип воспаления. Последние данные показывают, что сенсорные нейроны взаимодействуют с врожденными иммунными клетками через клеточный контакт, например, привлекая рецепторы группы 2D (NKG2D) на клетках-естественных киллерах (NK).
Учитывая, что NK-клетки экспрессируют родственные рецепторы для различных медиаторов, продуцируемых ноцицепторами, вполне возможно, что ноцицепторы используют нейропептиды для контроля активности NK-клеток. Здесь мы разрабатываем метод кокультуры для изучения взаимодействия ноцицепторных нейронов и NK-клеток в чашке. Используя этот подход, мы обнаружили, что поясничные ноцицепторные нейроны уменьшают экспрессию цитокинов NK-клеток. В целом, такой редукционистский метод может быть полезен для изучения того, как иннервирующие опухоль нейроны контролируют противоопухолевую функцию NK-клеток и как NK-клетки контролируют устранение поврежденных нейронов.
Introduction
Клеточные тела сенсорных нейронов берут свое начало в дорсальных корневых ганглиях (ДРГ). ДРГ расположены в периферической нервной системе (ПНС), между дорсальным рогом спинного мозга и периферическими нервными окончаниями. Псевдоуниполярная природа нейронов ДРГ позволяет передавать информацию от периферической ветви, которая иннервирует ткань-мишень, к центральной ветви, которая несет соматосенсорную информацию к спинному мозгу1. Используя специализированные рецепторы ионных каналов, нейроны первого порядка ощущают угрозы, создаваемые патогенами, аллергенами и загрязняющими веществами2, что приводит к притоку катионов (Na+, Ca2+) и генерации потенциала действия 3,4,5.
Эти нейроны также посылают антидромный потенциал действия к периферии, где произошло первоначальное ощущение опасности, что приводит к локальному высвобождению нейропептидов 1,4. Поэтому нейроны ноцицептора служат защитным механизмом, предупреждая хозяина об экологической опасности 4,5,6,7.
Для связи с нейронами второго порядка ноцицепторы высвобождают различные нейротрансмиттеры (например, глутамат) и нейропептиды (например, пептид, связанный с геном кальцитонина (CGRP), вещество P (SP) и вазоактивный кишечный пептид (VIP))6,7. Эти пептиды действуют на капилляры и способствуют экстравазации плазмы, отекам, а также местному притоку и модуляции иммунных клеток 2,4,7.
Соматосенсорная и иммунная системы используют общую систему связи, состоящую из цитокинов и нейропептидов, и их соответствующих родственных рецепторов4. Хотя эта двунаправленная связь помогает защитить от опасности и сохранить гомеостаз, она также может способствовать патофизиологии заболевания4.
NK-клетки классифицируются как врожденные лимфоидные клетки и специализируются на устранении вирусно инфицированных клеток. Функция NK-клеток регулируется балансом стимулирующих и тормозных рецепторов, включая активирующий рецептор NKG2D8. Эндогенный лиганд NKG2D, ранняя индуцируемая ретиноевая кислота1 (RAE1), экспрессируется клетками, подвергающимися стрессу, такому как опухолевый генез и инфекция 8,9.
Недавние исследования показали, что повреждение периферических нервов заставляет сенсорные нейроны экспрессировать дезадаптивные молекулы, такие как статмин 2 (STMN2) и RAE1. Таким образом, через клеточно-клеточный контакт NKG2D-экспрессирующие NK-клетки активировались взаимодействием с RAE1-экспрессирующими нейронами. В свою очередь, NK-клетки смогли устранить поврежденные нейроны ноцицептора и тупую болевую гиперчувствительность, обычно связанную с повреждением нерва10. В дополнение к оси NKG2D-RAE1, NK-клетки экспрессируют родственные рецепторы для различных медиаторов, продуцируемых ноцицепторами. Поэтому возможно, что эти медиаторы модулируют активность NK-клеток. В данной работе представлен метод кокультуры для исследования биологии взаимодействия нейрон-NK-клетка ноцицептора. Этот подход поможет продвинуть понимание того, как нейроны ноцицепторов модулируют врожденные иммунные клеточные реакции на травму, инфекцию или злокачественность.
Protocol
Representative Results
Discussion
Davies et al.11 обнаружили, что поврежденные нейроны повышают регуляцию RAE1. Благодаря клеточно-клеточному контакту NKG2D-экспрессирующие NK-клетки смогли идентифицировать и устранить нейроны RAE1+ , которые, в свою очередь, ограничивают хроническую боль11. Учит?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Фондом новых рубежей в исследованиях (NFRFE201901326), Канадскими институтами исследований в области здравоохранения (162211, 461274, 461275), Канадским фондом инноваций (37439), Канадской программой исследовательской кафедры (950-231859), Советом по естественным наукам и инженерным исследованиям Канады (RGPIN-2019-06824) и Фондом исследований природы Квебека и технологий (253380).
Materials
| Anti-mouse CD16/32 | Jackson Laboratory | Cat no: 017769 | |
| B-27 | Jackson Laboratory | Cat no: 009669 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) culture grade | World Precision Instruments | Cat no: 504167 | |
| BV421 anti-mouse NK-1.1 | Fisher Scientific | Cat no: 12430112 | |
| Cell strainer (50 μm) | Fisher Scientific | Cat no: A3160702 | |
| Collagenase IV | Fisher Scientific | Cat no: 15140148 | |
| Diphteria toxinfl/fl | Fisher Scientific | Cat no: SH3057402 | |
| Dispase II | Fisher Scientific | Cat no: 13-678-20B | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Fisher Scientific | Cat no: 07-200-95 | |
| EasySep Mouse NK Cell Isolation Kit | Sigma | Cat no: CLS2595 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma | Cat no: C0130 | |
| FACSAria III | Sigma | Cat no: 04942078001 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma | Cat no: 806552 | |
| FITC anti-mouse NKp46 | Sigma | Cat no: L2020 | |
| Flat bottom 96-well plate | Sigma | Cat no: 03690 | |
| Glass Pasteur pipette | Sigma | Cat no: 470236-274 | |
| Glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) | VWR | Cat no: 02-0131 | |
| Laminin | Cedarlane | Cat no: 03-50/31 | |
| L-Glutamine | Gibco | Cat no: A14867-01 | |
| Mouse recombinant IL-15 | Gibco | Cat no: 22400-089 | |
| Mouse recombinant IL-2 | Gibco | Cat no: 21103-049 | |
| Nerve Growth Factor (NGF) | Life Technologies | Cat no: 13257-019 | |
| Neurobasal media | PeproTech | Cat no: 450-51-10 | |
| PE anti-mouse GM-CSF | PeproTech | Cat no: 212-12 | |
| Penicillin and Streptomycin | PeproTech | Cat no: 210-15 | |
| Pestles | Stem Cell Technology | Cat no: 19855 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Biolegend | Cat no: 108732 | Clone PK136 |
| RPMI 1640 media | Biolegend | Cat no: 137606 | Clone 29A1.4 |
| TRPV1Cre | Biolegend | Cat no: 505406 | Clone MP1-22E9 |
| Tweezers and dissection tools. | Biolegend | Cat no: 65-0865-14 | |
| U-Shaped-bottom 96-well plate | Biolegend | Cat no: 101319 | |
| Viability Dye eFlour-780 | Becton Dickinson |
References
- Berta, T., Qadri, Y., Tan, P. H., Ji, R. R. Targeting dorsal root ganglia and primary sensory neurons for the treatment of chronic pain. Expert Opinion on Therapeutic Targets. 21 (7), 695-703 (2017).
- Baral, P., et al. Nociceptor sensory neurons suppress neutrophil and gammadelta T cell responses in bacterial lung infections and lethal pneumonia. Nature Medicine. 24, 417-426 (2018).
- Binshtok, A. M., et al. Nociceptors are interleukin-1beta sensors. Journal of Neuroscience. 28 (52), 14062-14073 (2008).
- Chesne, J., Cardoso, V., Veiga-Fernandes, H. Neuro-immune regulation of mucosal physiology. Mucosal Immunology. 12 (1), 10-20 (2019).
- Samad, T. A., et al. Interleukin-1beta-mediated induction of Cox-2 in the CNS contributes to inflammatory pain hypersensitivity. Nature. 410 (6827), 471-475 (2001).
- Godinho-Silva, C., et al. Light-entrained and brain-tuned circadian circuits regulate ILC3s and gut homeostasis. Nature. 574, 254-258 (2019).
- Talbot, J., et al. Feeding-dependent VIP neuron-ILC3 circuit regulates the intestinal barrier. Nature. 579, 575-580 (2020).
- Raulet, D. H., Gasser, S., Gowen, B. G., Deng, W., Jung, H. Regulation of ligands for the NKG2D activating receptor. Annual Review of Immunology. 31, 413-441 (2013).
- Vivier, E., et al. Innate or adaptive immunity? The example of natural killer cells. Science. 331, 44-49 (2011).
- Davies, A. J., et al. Natural Killer Cells Degenerate Intact Sensory Afferents following Nerve Injury. Cell. 176, 716-728 (2019).
- Perner, C., Sokol, C. L. Protocol for dissection and culture of murine dorsal root ganglia neurons to study neuropeptide release. STAR Protocols. 2, 100333 (2021).
- Goswami, S. C., et al. Molecular signatures of mouse TRPV1-lineage neurons revealed by RNA-Seq transcriptome analysis. Journal of Pain. 15, 1338-1359 (2014).
- Mishra, S. K., Tisel, S. M., Orestes, P., Bhangoo, S. K., Hoon, M. A. TRPV1-lineage neurons are required for thermal sensation. EMBO J. 30, 582-593 (2011).
- Kim, H. S., et al. Attenuation of natural killer cell functions by capsaicin through a direct and TRPV1-independent mechanism. Carcinogenesis. 35, 1652-1660 (2014).
