İnsan Sperm Fonksiyonel Kusurlarını Tespit Etmek için Biyobelirteçlerin Akış Sitometrik Analizi
Summary
Mevcut protokol, insan sperminde apoptozis, mitokondriyal membran potansiyeli ve DNA hasarının tek bir sitometre ile ölçülmesine olanak sağlayan pratik bir çözüm sunmaktadır.
Abstract
Konvansiyonel semen parametre analizi, erkek fertilitesini değerlendirmek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Bununla birlikte, çalışmalar infertil hastaların ~%15’inin konvansiyonel semen parametrelerinde anormallik göstermediğini bulmuştur. İdiyopatik infertiliteyi açıklamak ve ince sperm kusurlarını tespit etmek için ek teknolojilere ihtiyaç vardır. Şu anda, sperm apoptozu, mitokondriyal membran potansiyeli (MMP) ve DNA hasarı dahil olmak üzere sperm fonksiyonunun biyobelirteçleri, sperm fizyolojisini moleküler düzeyde ortaya koymakta ve erkek doğurganlığını tahmin etme yeteneğine sahiptir.
Akış sitometrisi (FCM) teknikleriyle, bu belirteçlerin her biri insan semen örneklerinde hızlı, doğru ve hassas bir şekilde ölçülebilir, ancak zaman maliyetleri önemli ölçüde artar ve tüm biyobelirteçlerin tek bir sitometre ile test edilmesi gerekiyorsa sonuçlar engellenebilir. Bu protokolde, sıvılaştırma için 37 ° C’de toplama ve hemen inkübasyondan sonra, semen örnekleri Annexin V-floresein izotiyosiyanat (FITC) / propidyum iyodür (PI) boyaması kullanılarak sperm apoptozu için daha fazla analiz edildi. MMP, 5,5′,6,6′-tetrakloro-1,1′,3,3′-tetraetil-benzimidazolilkarbosiyanin iyodür (JC-1) probu ile etiketlendi ve DNA hasarı, akridin turuncu (AO) boyama ile sperm kromatin yapı testi (SCSA) kullanılarak değerlendirildi. Bu nedenle, sperm fonksiyon belirteçlerinin akım sitometrik analizi, infertilite tanısı ve hem tezgahta hem de yatakta sperm fonksiyonunun değerlendirilmesi için pratik ve güvenilir bir araç seti olabilir.
Introduction
Kısırlık bir halk sağlığı sorunu haline gelmiştir ve erkek kısırlığı tüm vakaların %40-50’sine katkıda bulunmaktadır 1,2. Konvansiyonel semen kalitesi analizi erkek fertilite potansiyelinin belirlenmesinde önemli bir rol oynamasına rağmen, infertilitesi olan hastaların yaklaşık %15’inde sperm sayısı, motilite ve morfoloji gibi normal sperm parametreleri bulunmaktadır3. Ayrıca, rutin sperm muayenelerinin tekrarlanabilirliği zayıftır, sperm fonksiyonu hakkında sınırlı bilgi sağlar ve erkek doğurganlığının doğru bir değerlendirmesini yapamaz veya spermin ince kusurlarını yansıtamaz. Sperm fonksiyonunu test etmek için hemizona testi (HZA), sperm penetrasyon testi, hipo-ozmotik şişme testi, antisperm antikor testi gibi birçok teknik geliştirilmiştir, ancak bu yöntemler zaman alıcıdır ve operatörlerin öznel etkilerine karşı savunmasızdır. Bu nedenle sperm fonksiyon analizi için hızlı ve doğru yöntemler geliştirmek gerekir.
FCM, 1970’lerde geliştirilen, hücre biyolojisi ve tıbbın çeşitli alanlarında yaygın olarak kullanılan hızlı, tek hücreli bir analiz teknolojisidir. FCM, spesifik bir floresan probu4 ile etiketlenmiş spermatozoayı analiz eden sperm fonksiyonunun değerlendirilmesi için sağlam bir araçtır. Spermatozoa, tek veya çok kanallı lazerlerden geçer ve bir lazer ışını tarafından saçılan ışık ve yayılan floresan üretilir. Saçılan ışık, test edilen hücrenin boyutunu ve hücre tanecikliğini veya iç yapısını yansıtan öne doğru saçılan ışığı (FSC) ve yandan saçılan ışığı (SSC) içerir. Bu sinyaller bilgisayar sistemi tarafından toplanır, görüntülenir ve analiz edilir ve sonuç olarak spermatozoadan bir dizi özellik hızlı ve doğru bir şekilde ölçülür. Bu nedenle FCM, sperm analizi alanında giderek artan bir ilgi gören hızlı, objektif, çok boyutlu ve yüksek verimli bir tekniktir. FCM uygulaması, geleneksel yöntemlerdeki eksiklikleri giderebilir ve sperm iç yapısının ve fonksiyonunun tespiti için yeni bir yaklaşım sağlar.
Sperm apoptozu erkek doğurganlığı ile yakından ilişkilidir5. Sperm apoptozunun saptanması, sperm fonksiyonunu moleküler düzeyde değerlendirmek için önemli bir indekstir. FCM, Annexin V-FITC/PI boyaması kullanarak sperm apoptozunu tespit etmek için güvenilir ve hassas bir yöntem olarak kabul edilmektedir. Temel prensip, fosfatidilserin (PS) apoptozun erken evresinde hücre zarının iç tabakasından dış tabakasına aktarılmasıdır. Annexin V, PS için yüksek bir afiniteye sahip olan birCa2+ bağımlı fosfolipid proteinidir (genellikle FITC tarafından etiketlenir), bu nedenle hücre zarının6 dış yüzeyine maruz kalan PS’yi tespit eder. Nekroz ve apoptoz, Pl boyama ile kombinasyon halinde ayırt edilebilir. Bu nedenle, Annexin V-FITC/PI çift boyama yöntemi, hızlı, basit ve farklı apoptotik sperm hücrelerini tespit etmesi kolay olduğu için yaygın olarak kullanılmaktadır.
Olgun bir memeli spermi yaklaşık 72-80 mitokondri7 içerir, bu da sperm mitokondrisinintutulmasının biyolojik bir nedenini düşündürür 8. Sperm mitokondrilerinin sperm hareketliliğini ve doğurganlığını sürdürmede önemli roller oynadığı bulunmuştur9. Çeşitli hücre tiplerinde MMP’nin bir göstergesi olarak kullanılabilen JC-1 boyası, sperm mitokondriyal aktivite değerlendirmesi için en popüler florokromlardan biridir10. JC-1, mitokondride potansiyele bağlı olarak biriken katyonik bir boyadır. JC-1, 525 nm’de (yeşil) maksimum floresan emisyonuna sahiptir ve yüksek potansiyele (ΔΨm, 80-100 mV) sahip membranlara bağlandığında J-agregatları11 oluşturur, bu da floresan emisyonunda ~590 nm’ye (turuncu-kırmızı) bir kaymaya neden olur. Sonuç olarak, sperm mitokondriyal depolarizasyonu, kırmızı / yeşil floresan yoğunluk oranındaki bir azalma ile gösterilir ve FCM, insan semen örneklerinde MMP seviyelerini tespit etmek için kullanılabilir.
SCSA metodolojisi Evenson ve ark.12 tarafından icat edilmiştir ve 1.024 × 1.024 kanal ölçeğindebenzersiz çift parametreli verilerle (kırmızı ve yeşil floresan) kesin ve tekrarlanabilir bir test olarak kabul edilir 13. Hasarlı spermde, sperm çekirdeğindeki DNA ve değiştirilmiş proteinler AO ile etiketlenir ve DNA zincirinin kırılmaları kırmızı floresan ile ölçülürken, sağlam çift iplikçikler FCM14’te yeşil floresan yayar. Günümüzde sperm DNA bütünlüğünü tahmin etmek için birçok yöntem geliştirilmiştir. Bununla birlikte, SCSA’dan farklı olarak, bu tahliller genellikle emek yoğundur ve erkek kısırlığı tanısı koyma yeteneğinden yoksundur. SCSA test sonuçları, insan DNA’sı hamileliği ve düşüklüğü ile önemli ölçüde ilişkilidir, SCSA’nın insan semen analizinde yararlı olabileceğine dair ikna edici kanıtlar sağlar ve kısırlık klinisyenleri için değerli bir araç olarak hizmet edebilir15.
Kromatin bütünlüğü, MMP ve apoptoz, sperm fonksiyonunun farklı yönlerini yansıtır ve bu nedenle, bu biyobelirteçlerin kombinasyonu, sperm durumu hakkında daha kapsamlı bir fikir verebilir. FCM, insan semen örneklerinde kromatin bütünlüğü, MMP veya apoptozun ayrı ölçümleri için kullanılabilir. FCM’nin maliyeti ve boyaların maliyeti, bu tekniklerin üreme sağlığı için klinik laboratuvarlarda geniş çapta uygulanmasını sınırlamış olsa da, doğurganlık tahmini için değerleri kabul edilmektedir.
Bununla birlikte, deneylerin her biri sperm örneklerinin ön işlemden geçirilmesini gerektirdiğinden ve ön işleme tabi tutulmuş tüm örneklerin mümkün olan en kısa sürede test edilmesi gerektiğinden, tek bir FCM ile bir örnek için üç biyobelirteçin tümünün aynı anda ölçülmesi, bazı deneyler için uzun bir bekleme süresine yol açabilir ve sonuçların güvenilirliğini engelleyebilir. Bunun nedeni, protokolün her üç deneyi de tamamen dikkate alarak uygun şekilde düzenlenmemesi durumunda, bekleme sürecinde spermlerin ek hasar almasıdır. Bu makale, uzun bekleme sürelerinin neden olduğu deney kalitesinden önemli ölçüde ödün vermeden tek bir sitometride üç biyobelirtecin tümünün akıcı ölçümünü gerçekleştiren bir protokol sunmaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kromatin bütünlüğü, MMP ve insan spermatozoasının apoptozu, üreme sonuçlarının değerli belirleyicileri olarak bulunmuştur. İnsan sperminin incelenmesi ve işlenmesi için en son yayınlanan DSÖ laboratuvar kılavuzu (altıncı baskı), bu göstergelerin bazılarını (kromatin bütünlüğü ve apoptoz) sperm sayısı18 gibi rutin parametrelerin temel incelemesinin ötesinde genişletilmiş incelemeler olarak vurguladı. Son yayınlar ayrıca, bu göstergelerin harici tehlikeli maruziyetlere verilen yanıtın daha hassas belirteçleri olabileceğini ve üreme hasarının daha erken bir aşamada tanımlanması için potansiyellerini gösterdiğini göstermektedir19,20. Bu göstergelerin rutin muayenelerle birleştirilmesi, sperm disfonksiyonunun profili ve popülasyondaki erkek üreme hasarının karmaşıklığı hakkında daha kapsamlı bir anlayış sağlayabilir.
FCM ile sperm analizinin başarısını önemli ölçüde belirleyen birkaç önemli konu vardır. İlk olarak, sperm MMP ve apoptoz ölçümü, meni sıvılaştırıldıktan sonra hemen muayene gerektirir. Zaman maliyetini en aza indirmek için, iki teknisyen MMP’nin ön işleminden ve bir numunenin apoptoz analizinden ayrı ayrı sorumlu olabilir. Apoptozun ön tedavisi daha basit olduğundan, MMP analizinden daha hızlı bir şekilde akış sitometrik basamağına geçecektir. SCSA analizi için, taze semen örnekleri, sıvılaştırmadan sonra mevcut olduğunda hemen dondurularak saklanmalıdır. Sperm örnekleri daha sonra nispeten uzun bir süre sıvı nitrojen içinde saklanabilir ve acil incelemeye ihtiyaç duymaz.
Buna göre, deneyin saha içi zaman maliyeti, MMP analizinin süresi artı sperm analizinin akış-sitometrik adımı olan 40 dakikaya sıkıştırılabilir. İkinci olarak, akış sitometrik platformundaki geçitin kurulumuna her numune grubu için ayrı ayrı karar verilmelidir. Dağılım grafiğinde berrak hücre alt gruplarına sahip sperm örnekleri, geçit alanını çizmek için referans olarak seçilebilir. Üçüncüsü, bu deneyin göstergeleri için yaygın olarak kabul edilen klinik referans değerleri olmadığından, geçmiş sonuçlar kalite kontrol için önemli bir araç olarak kullanılabilir. Her ölçüm grubunda, özellikle SCSA ve MMP için pozitif ve negatif kontrollerin ayarlanması da teşvik edilir.
Burada verilen sperm analizinin temsili sonuçları bir Accuri C6 kullanılarak elde edilir. Bununla birlikte, teknik küçük değişikliklerle diğer ticari platformlara uygulanabilir. Genellikle, tüm göstergelerin ölçüm gereksinimini karşılamak için toplam 5 × 106 sperm hücresine ihtiyaç duyulur. Bir numunenin sperm konsantrasyonu ortalama seviyeden çok daha düşükse, meni hacmine olan ihtiyaç artacaktır.
Rutin sperm parametrelerine benzer şekilde, insan spermatozoasının kromatin bütünlüğünde, MMP’sinde ve apoptozunda da gözle görülür birey içi varyasyon vardır21. Buna göre, farklı zamanlarda toplanan örneklerin çoklu testleri, sperm fonksiyon hasar seviyesinin daha doğru bir şekilde tahmin edilmesini sağlayabilir. Flow sitometrik analiz için sperm örneklemesinden önce önerilen bir yoksunluk süresi olmamasına rağmen, DSÖ tarafından rutin sperm analizi için önerilen 2-7 günlük boşalma perhizi benimsenebilir. Sonuçların laboratuvarlar arasında ve aynı kişilerden toplanan farklı numuneler arasında karşılaştırılabilirliğini artırmaya yardımcı olabilir.
Bu yöntemin önemli bir sınırlaması, test edilen üç biyobelirteçten ikisinin – apoptoz ve mitokondriyal membran potansiyeli – taze semen örnekleri gerektirmesidir. Bu, uygulamalarını laboratuvara semen örnekleri sağlayabilecek erkeklerle sınırlayabilir. DNA hasarı testi (SCSA) için, akış sitometresini kalibre etmek için deneyden önce referans numuneler hazırlanmalıdır. Mevcut protokolün uygulanması, laboratuvarda bir FCM cihazı gerektirmektedir ve bu, birçok klinik laboratuvar için hala önemli bir zorluktur, ancak bazı bölgelerde üçüncü taraf bir hizmetle işbirliği alternatif bir seçim olabilir.
Ek olarak, boyaların ve diğer reaktiflerin masrafı da muayeneye ihtiyaç duyabilecek erkekler için finansal bir faktördür. Son olarak, biyobelirteçleri incelemek için FCM’nin farklı markaları veya versiyonları kullanılıyorsa, protokolün değiştirilmesi gerekebilir. Özetle, bu makale, tek bir akış sitometri makinesi ile insan spermatozoa hasarının üç biyobelirtecini tahmin etmek için pratik bir yaklaşım sunmaktadır. Bu, erkek üreme sağlığı hakkında değerli bilgiler sağlayabilir ve rutin sperm muayenesini tamamlayabilir.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Tüm saha çalışanlarına yardımları için ve görüşmecilere işbirlikleri için teşekkür ederiz.
Materials
| 0.1 M citric acid buffer | Sigma-Aldrich Chemical Co., USA | 251275-5G | Add 21.01 g/L citric acid monohydrate (FW = 210.14; 0.10 M) to 1.0 L H2O. Store up to several months at 4 °C. |
| 0.2 M Na2PO4 buffer | Sigma-Aldrich Chemical Co., USA | V900061-500G | Add 28.4 g sodium phosphate dibasic (FW = 141.96; 0.2 M) to 1.0 L H2O. Store up to several months at 4 °C. |
| 10 mM CCCP stock solution | Sigma-Aldrich Chemical Co., USA | C2759 | Add 20.46 mg CCCP to 10.0 mL DMSO,making up to the final of CCCP in a concentration of 10mM, aliquot and store at −80 °C. |
| 10 µM CCCP working solution | Add 10 mL of PBS to a 15 mL polypropylene centrifuge tube and add 10 μL CCCP stock solution, making up to the final of CCCP in a concentration of 10 µM. | ||
| 1 mM JC-1 stock solution | Sigma-Aldrich Chemical Co., USA | T4069 | JC-1 is purchased lyophilized. Add a small quantity of DMSO to the vial and vortex for several minutes until all the dye has dissolved. Transfer the solution to a light-tight tube and rinse the vial with appropriate volume of DMSO, making up to the final of JC-1 in a concentration of 1 mg/mL aliquot and store at −20 °C. |
| 37 °C incubator | Thermo Scientific, USA | ||
| 5 µM JC-1 working solution | Add 10 mL of PBS to a 15 mL polypropylene centrifuge tube and add 50 μL from a thawed JC-1 stock aliquot. Stir gently to assure a homogenous dilution. This solution must be stored in the dark and used promptly. | ||
| Accuri C6 Flow cytometer | BD Pharmingen, San Diego, CA, United States | ||
| Acid solution, pH 1.2 | Combine 20.0 mL of 2.0 N HCl (0.08 N), 4.39 g of NaCl (0.15 M), and 0.5 mL of Triton X-100 (0.1%) in H2O for a final volume of 500 mL. Adjust pH to 1.2 with 5 mol/L HCl. | ||
| Acridine Orange (AO) stock solution, 1.0 mg/mL | Polysciences, Inc, Warrington, Pa | 65-61-2 | Dissolve chromatographically purified AO in dd-H2O at 1.0 mg/mL. |
| AO staining solution (working solution) | Add 600 μL of AO stock solution to each 100 mL of staining buffer. | ||
| Biological safety hood | Airtech, USA | ||
| Computer-aided sperm analysis system (CASA ) | Microptic, Barcelona, Spain | Sperm Class Analyzer 5.3.00 | |
| Sperm Counting Chamber | Goldcyto, Spain | ||
| Equipments | |||
| FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I | BD Biosciences, San Jose, CA | 556547 | Included: (1) FITC Annexin V is bottled at 100 ng/µL; (2) Propidium Iodide (PI):The PI Staining Solution is composed of 50 µg PI/mL in PBS (pH 7.4) and is 0.2 µM sterile filtered; (3) 10x Binding Buffer: 0.1 M Hepes (pH 7.4), 1.4 M NaCl, 25 mM CaCl2. For a 1x working solution, dilute 1 part of the 10x Annexin V Binding Buffer to 9 parts of distilled water. Store at 4 °C and protected from prolonged exposure to light. Do not freeze. |
| FlowJo 10 | Tree Star, Inc., San Carlos, CA, USA | ||
| Horizontal centrifuge | Thermo Scientific, USA | ||
| liquid nitrogen tank | Thermolyne, USA | ||
| Materials | |||
| PBS | Beyotime, Shanghai, China | C0221A | Ready-to-use PBS buffers is purchased and stored at room temperature |
| Staining buffer, pH 6.0 | Combine 370 mL of 0.10 M citric acid buffer, 630 mL of 0.20 M Na2PO4 buffer, 372 mg of EDTA (disodium, FW = 372.24; 1 mM), and 8.77 g of NaC1 (0.15 M). Mix overnight on a stir plate to insure that the EDTA is entirely in solution. pH to 6.0 with saturated NaOH solution. | ||
| The reference sample for SCSA analysis | The reference sample was diluted with cold (4 °C) TNE buffer to a working concentration of 1–2 × 106 cells/mL, and used to set the green at 475/1,024 flow cytometry channels and set the red at 125/1,024 flow cytometry channels. | ||
| TNE buffer, 1x, pH 7.4 (working solution) | Combine 60 mL of 10x TNE and 540 mL of H2O. Check pH (7.4). | ||
| TNE buffer, 10x, pH 7.4 | Perfemiker, Shanghai, China | PM11733 | Ready-to-use buffers is purchased and stored at 4 °C. |
References
- Agarwal, A., Mulgund, A., Hamada, A., Chyatte, M. R. A unique view on male infertility around the globe. Reproductive Biology and Endocrinology. 13 (1), 1-9 (2015).
- Nachtigall, R. D. International disparities in access to infertility services. Fertility and Sterility. 85 (4), 871-875 (2006).
- Agarwal, A., Allamaneni, S. S. R. Sperm DNA damage assessment: a test whose time has come. Fertility and Sterility. 84 (4), 850-853 (2005).
- Peña, F. J., Ortega Ferrusola, C., Martín Muñoz, P. New flow cytometry approaches in equine andrology. Theriogenology. 86 (1), 366-372 (2016).
- Oosterhuis, G. J., et al. Measuring apoptosis in human spermatozoa: a biological assay for semen quality. Fertility and Sterility. 74 (2), 245-250 (2000).
- Koopman, G., et al. Annexin V for flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on B cells undergoing apoptosis. Blood. 84 (5), 1415-1420 (1994).
- Freitas, M. J., Vijayaraghavan, S., Fardilha, M. Signaling mechanisms in mammalian sperm motility. Biology of Reproduction. 96 (1), 2-12 (2017).
- Lehti, M. S., Sironen, A. Formation and function of sperm tail structures in association with sperm motility defects. Biology of Reproduction. 97 (4), 522-536 (2017).
- Durairajanayagam, D., Singh, D., Agarwal, A., Henkel, R. Causes and consequences of sperm mitochondrial dysfunction. Andrologia. 53 (1), 13666 (2021).
- Agnihotri, S. K., et al. Mitochondrial membrane potential (MMP) regulates sperm motility. In Vitro Cellular and Developmental Biology. Animal. 52 (9), 953-960 (2016).
- Smiley, S. T., et al. Intracellular heterogeneity in mitochondrial membrane potentials revealed by a J-aggregate-forming lipophilic cation JC-1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (9), 3671-3675 (1991).
- Evenson, D. P., Darzynkiewicz, Z., Melamed, M. R. Relation of mammalian sperm chromatin heterogeneity to fertility. Science. 210 (4474), 1131-1133 (1980).
- Evenson, D. P., Djira, G., Kasperson, K., Christianson, J. Relationships between the age of 25,445 men attending infertility clinics and sperm chromatin structure assay (SCSA®) defined sperm DNA and chromatin integrity. Fertility and Sterility. 114 (2), 311-320 (2020).
- Evenson, D. P. Sperm chromatin structure assay (SCSA®). Methods in Molecular Biology. 927, 147-164 (2013).
- Agarwal, A., Said, T. M. Role of sperm chromatin abnormalities and DNA damage in male infertility. Human Reproduction Update. 9 (4), 331-345 (2003).
- Ricci, G. Apoptosis in human sperm: its correlation with semen quality and the presence of leukocytes. Human Reproduction. 17 (10), 2665-2672 (2002).
- Zhang, H. -. B., et al. Early apoptotic changes in human spermatozoa and their relationships with conventional semen parameters and sperm DNA fragmentation. Asian Journal of Andrology. 10 (2), 227-235 (2008).
- . WHO laboratory manual for the examination and processing of human semen Available from: https://www.who.int/publications/i/item/9789240030787 (2022)
- Evenson, D. P., Wixon, R. Environmental toxicants cause sperm DNA fragmentation as detected by the Sperm Chromatin Structure Assay (SCSA). Toxicology and Applied Pharmacology. 207 (2), 532-537 (2005).
- Wang, Y. X., et al. Phthalate exposure in association with serum hormone levels, sperm DNA damage and spermatozoa apoptosis: A cross-sectional study in China. Environmental Research. 150, 557-565 (2016).
- Ni, W., et al. Diurnal variation in sperm DNA fragmentation: analysis of 11,382 semen samples from two populations and in vivo animal experiments. Chronobiology International. 36 (11), 1455-1463 (2019).
