Flowcytometrische analyse van biomarkers voor het detecteren van functionele defecten van menselijk sperma
Summary
Het huidige protocol biedt een praktische oplossing die het mogelijk maakt om apoptose, mitochondriaal membraanpotentiaal en DNA-schade in menselijk sperma te meten met een enkele cytometer.
Abstract
De conventionele spermaparameteranalyse wordt veel gebruikt om de mannelijke vruchtbaarheid te beoordelen. Studies hebben echter aangetoond dat ~15% van de onvruchtbare patiënten geen afwijkingen vertoont in conventionele spermaparameters. Er zijn aanvullende technologieën nodig om de idiopathische onvruchtbaarheid te verklaren en subtiele spermadefecten op te sporen. Momenteel onthullen biomarkers van de spermafunctie, waaronder apoptose van sperma, mitochondriaal membraanpotentiaal (MMP) en DNA-schade, de fysiologie van het sperma op moleculair niveau en zijn ze in staat om de mannelijke vruchtbaarheid te voorspellen.
Met flowcytometrie (FCM)-technieken kan elk van deze markers snel, nauwkeurig en nauwkeurig worden gemeten in menselijke spermamonsters, maar de tijdskosten nemen aanzienlijk toe en de resultaten kunnen worden belemmerd als alle biomarkers moeten worden getest met een enkele cytometer. In dit protocol werden, na verzameling en onmiddellijke incubatie bij 37 °C voor liqueficatie, spermamonsters verder geanalyseerd op sperma-apoptose met behulp van Annexine V-fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC)/propidiumjodide (PI)-kleuring. De MMP werd gelabeld met 5,5′,6,6′-tetrachloor-1,1′,3,3′-tetraethyl-benzimidazolylcarbocyaninejodide (JC-1) sonde, en DNA-schade werd beoordeeld met behulp van de spermachromatinestructuurtest (SCSA) met acridine oranje (AO) kleuring. Flowcytometrische analyse van markers voor de functie van sperma kan dus een praktische en betrouwbare toolkit zijn voor de diagnose van onvruchtbaarheid en de evaluatie van de spermafunctie op zowel de bank als in bed.
Introduction
Onvruchtbaarheid is een probleem voor de volksgezondheid geworden, waarbij mannelijke onvruchtbaarheid bijdraagt aan 40%-50% van alle gevallen 1,2. Hoewel conventionele spermakwaliteitsanalyse een belangrijke rol speelt bij het bepalen van het mannelijke vruchtbaarheidspotentieel, heeft ongeveer 15% van de patiënten met onvruchtbaarheid normale spermaparameters zoals het aantal zaadcellen, beweeglijkheid enmorfologie. Bovendien hebben routinematige sperma-onderzoeken een slechte herhaalbaarheid, geven ze beperkte informatie over de functie van het sperma en kunnen ze geen nauwkeurige evaluatie van de mannelijke vruchtbaarheid geven of de subtiele defecten van sperma weerspiegelen. Er zijn meerdere technieken ontwikkeld om de spermafunctie te testen, zoals de hemizona-test (HZA), de spermapenetratietest, de hypo-osmotische zwellingstest, de antisperma-antilichaamtest, maar deze methoden zijn tijdrovend en kwetsbaar voor subjectieve invloeden van de operators. Daarom is het noodzakelijk om snelle en nauwkeurige methoden te ontwikkelen voor de analyse van de spermafunctie.
FCM is een snelle, single-cell analysetechnologie ontwikkeld in de jaren 1970, die op grote schaal is gebruikt op verschillende gebieden van celbiologie en geneeskunde. FCM is een robuust hulpmiddel voor de evaluatie van de spermafunctie dat spermatozoa analyseert die zijn gelabeld met een specifieke fluorescentiesonde4. De spermatozoa passeren een- of meerkanaalslasers en verstrooid licht en uitgezonden fluorescentie worden geproduceerd door een laserstraal. Het verstrooid licht omvat voorwaarts verstrooid licht (FSC) en zijwaarts verstrooid licht (SSC), dat de grootte van de geteste cel en de celgranulariteit of interne structuur weerspiegelt. Deze signalen worden verzameld, weergegeven en geanalyseerd door het computersysteem, en bijgevolg wordt een reeks kenmerken van de spermatozoa snel en nauwkeurig gemeten. Daarom is FCM een snelle, objectieve, multidimensionale en high-throughput techniek die steeds meer aandacht heeft gekregen op het gebied van sperma-analyse. De toepassing van FCM kan tekortkomingen in traditionele methoden compenseren en biedt een nieuwe benadering voor de detectie van de interne structuur en functie van sperma.
Sperma-apoptose is nauw verwant aan mannelijke vruchtbaarheid5. Detectie van apoptose van sperma is een belangrijke index om de functie van sperma op moleculair niveau te evalueren. FCM wordt algemeen erkend als een betrouwbare en gevoelige methode om apoptose van sperma te detecteren met behulp van Annexin V-FITC/PI-kleuring. Het basisprincipe is dat fosfatidylserine (PS) in het vroege stadium van apoptose wordt overgebracht van de binnenste laag van het celmembraan naar de buitenste laag. Annexine V is een Ca2+-afhankelijk fosfolipide-eiwit (meestal gelabeld door FITC) dat een hoge affiniteit heeft voor PS en dus PS detecteert dat is blootgesteld aan het buitenoppervlak van het celmembraan6. Necrose en apoptose kunnen worden onderscheiden in combinatie met Pl-kleuring. Daarom wordt de methode van Annexine V-FITC/PI dubbele kleuring veel gebruikt, omdat het snel, eenvoudig en gemakkelijk is om verschillende apoptotische zaadcellen te detecteren.
Een volwassen zoogdiersperma bevat ongeveer 72-80 mitochondriën7, wat wijst op een biologische reden voor het vasthouden van spermamitochondriën8. Mitochondriën van sperma blijken een belangrijke rol te spelen bij het in stand houden van de beweeglijkheid en vruchtbaarheid van het sperma9. De JC-1-kleuring, die kan worden gebruikt als een indicator van MMP in verschillende celtypen, is een van de meest populaire fluorochromen voor de beoordeling van de mitochondriale activiteit van sperma10. JC-1 is een kationische kleurstof die zich potentiaalafhankelijk ophoopt in de mitochondriën. JC-1 heeft een maximale fluorescentie-emissie bij 525 nm (groen) en vormt J-aggregaten 11 bij binding aan membranen met een hoog potentiaal (ΔΨm, 80-100 mV), wat resulteert in een verschuiving in fluorescentie-emissie naar ~590 nm (oranjerood). Bijgevolg wordt mitochondriale depolarisatie van sperma aangegeven door een afname van de rood/groene fluorescentie-intensiteitsverhouding, en FCM kan worden gebruikt om MMP-niveaus in menselijke spermamonsters te detecteren.
De SCSA-methodologie is uitgevonden door Evenson et al.12 en wordt beschouwd als een nauwkeurige en herhaalbare test met unieke gegevens met twee parameters (rode versus groene fluorescentie) op een schaal van 1,024 × 1,024 kanalen13. In beschadigd sperma worden DNA en veranderde eiwitten in spermakernen gelabeld met AO, en breuken van de DNA-streng worden gemeten door rode fluorescentie, terwijl intacte dubbele strengen groene fluorescentie uitzenden in FCM14. Tegenwoordig zijn er veel methoden ontwikkeld om de integriteit van het sperma-DNA te schatten. In tegenstelling tot SCSA zijn deze tests echter vaak arbeidsintensief en missen ze de mogelijkheid om een diagnose van mannelijke onvruchtbaarheid te stellen. De SCSA-testresultaten hangen significant samen met menselijke DNA-zwangerschap en miskraam, leveren overtuigend bewijs dat SCSA nuttig kan zijn bij de analyse van menselijk sperma en kan dienen als een waardevol hulpmiddel voor onvruchtbaarheidsclinici15.
Chromatine-integriteit, MMP en apoptose weerspiegelen verschillende aspecten van de spermafunctie, en daarom kan de combinatie van deze biomarkers een uitgebreider inzicht geven in de spermastatus. FCM kan worden gebruikt voor afzonderlijke metingen van chromatine-integriteit, MMP of apoptose in menselijke spermamonsters. Hoewel de kosten van FCM en de kosten van kleurstoffen de brede toepassing van deze technieken in klinische laboratoria voor reproductieve gezondheid hebben beperkt, wordt hun waarde voor de schatting van de vruchtbaarheid geaccepteerd.
Aangezien echter voor elk van de experimenten voorbehandeling van spermamonsters vereist is en alle voorbehandelde monsters zo snel mogelijk moeten worden getest, kan gelijktijdige meting van alle drie de biomarkers voor een monster met een enkele FCM leiden tot een lange wachttijd voor sommige experimenten en de betrouwbaarheid van de resultaten belemmeren. Dit komt omdat de spermacellen extra schade oplopen tijdens het wachtproces, als het protocol niet goed is geregeld, rekening houdend met alle drie de experimenten. Dit artikel presenteert een protocol dat de vloeiende meting van alle drie de biomarkers in een enkele cytometrie realiseert zonder substantiële afbreuk te doen aan de kwaliteit van het experiment als gevolg van langere wachttijden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Chromatine-integriteit, MMP en apoptose van menselijke spermatozoa blijken waardevolle voorspellers te zijn van reproductieve uitkomsten. De laatst uitgebrachte WHO-laboratoriumhandleiding voor het onderzoek en de verwerking van menselijk sperma (zesde editie) benadrukte ook enkele van deze indicatoren (chromatine-integriteit en apoptose) als uitgebreide onderzoeken die verder gaan dan het basisonderzoek van routineparameters zoals het aantal zaadcellen18. Recente publicaties suggereren ook dat deze indicatoren gevoeligere markers kunnen zijn voor de reactie op externe gevaarlijke blootstellingen, wat aangeeft dat ze mogelijk zijn om reproductieve schade in een vroeger stadium te identificeren19,20. Het combineren van deze indicatoren met routineonderzoeken kan ook een uitgebreider inzicht geven in het profiel van spermadisfunctie en de complexiteit van mannelijke reproductieve schade in de populatie.
Er zijn verschillende belangrijke kwesties die in belangrijke mate het succes van sperma-analyse met FCM bepalen. Ten eerste vereist het meten van sperma MMP en apoptose onmiddellijk onderzoek nadat het sperma vloeibaar is gemaakt. Om de tijdskosten tot een minimum te beperken, kunnen twee technici afzonderlijk de voorbehandeling van MMP en apoptose-analyse van een monster voor hun rekening nemen. Omdat de voorbehandeling van apoptose eenvoudiger is, zou deze sneller overgaan op de flowcytometrische stap dan de MMP-analyse. Voor de SCSA-analyse moeten verse spermamonsters onmiddellijk na het vloeibaar maken worden ingevroren. De spermamonsters kunnen dan voor een relatief lange periode in vloeibare stikstof worden bewaard en hoeven niet onmiddellijk te worden onderzocht.
Dienovereenkomstig kunnen de tijdskosten ter plaatse van het experiment worden gecomprimeerd tot 40 minuten, wat de duur is van MMP-analyse plus de flowcytometrische stap van sperma-analyse. Ten tweede moet de opstelling van de gating in het flowcytometrische platform voor elke batch monsters afzonderlijk worden bepaald. De spermamonsters met duidelijke celsubgroepen in het spreidingsdiagram kunnen worden geselecteerd als referentie om het poortgebied te tekenen. Ten derde, aangezien er geen algemeen aanvaarde klinische referentiewaarden zijn voor de indicatoren van dit experiment, kunnen historische resultaten worden gebruikt als een belangrijk instrument voor kwaliteitscontrole. Positieve en negatieve controles worden ook aangemoedigd om in elke reeks metingen te worden ingesteld, met name voor SCSA en MMP.
De representatieve resultaten van sperma-analyse die hier worden verstrekt, zijn afgeleid met behulp van een Accuri C6. De techniek zou echter met kleine aanpassingen kunnen worden toegepast op andere commerciële platforms. Gewoonlijk zouden in totaal 5 × 106 zaadcellen nodig zijn om te voldoen aan de eis voor het meten van alle indicatoren. Als de spermaconcentratie van een monster veel lager is dan het gemiddelde niveau, zou de behoefte aan het volume sperma toenemen.
Net als bij routinematige spermaparameters, is er ook merkbare intra-individuele variatie in de chromatine-integriteit, MMP en apoptose van menselijke spermatozoa21. Dienovereenkomstig kunnen meerdere tests van monsters die op verschillende tijdstippen zijn verzameld, een nauwkeurigere schatting geven van het schadeniveau van de spermafunctie. Hoewel er geen aanbevolen periode van onthouding is vóór de bemonstering van sperma voor de flowcytometrische analyse, kan 2-7 dagen onthouding van ejaculatie, voorgesteld voor routinematige sperma-analyse door de WHO, worden aangenomen. Het kan bijdragen tot een betere vergelijkbaarheid van de resultaten tussen laboratoria en tussen verschillende monsters die bij dezelfde mannen zijn genomen.
Een belangrijke beperking van deze methode is dat twee van de drie geteste biomarkers – de apoptose en het mitochondriale membraanpotentiaal – verse spermamonsters vereisen. Dit kan hun toepassing beperken tot mannen die spermamonsters aan het laboratorium kunnen leveren. Voor de DNA-schadetest (SCSA) moeten vóór het experiment referentiemonsters worden bereid om de flowcytometer te kalibreren. Merk op dat de toepassing van het huidige protocol een FCM-instrument in het laboratorium vereist, wat voor veel klinische laboratoria nog steeds een aanzienlijke uitdaging is, hoewel samenwerking met een externe dienst in sommige regio’s een alternatieve keuze kan zijn.
Bovendien zijn de kosten van de kleurstoffen en andere reagentia ook een financiële factor voor mannen die het onderzoek mogelijk nodig hebben. Ten slotte kan het zijn dat het protocol moet worden aangepast als verschillende merken of versies van FCM worden gebruikt om de biomarkers te onderzoeken. Samenvattend presenteert dit artikel een praktische benadering om drie biomarkers van schade aan menselijke spermatozoa te schatten door een enkele flowcytometriemachine. Dit kan waardevolle informatie opleveren over de reproductieve gezondheid van mannen en een aanvulling vormen op het routinematige spermaonderzoek.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We danken alle veldwerkers voor hun hulp en de geïnterviewden voor hun medewerking.
Materials
| 0.1 M citric acid buffer | Sigma-Aldrich Chemical Co., USA | 251275-5G | Add 21.01 g/L citric acid monohydrate (FW = 210.14; 0.10 M) to 1.0 L H2O. Store up to several months at 4 °C. |
| 0.2 M Na2PO4 buffer | Sigma-Aldrich Chemical Co., USA | V900061-500G | Add 28.4 g sodium phosphate dibasic (FW = 141.96; 0.2 M) to 1.0 L H2O. Store up to several months at 4 °C. |
| 10 mM CCCP stock solution | Sigma-Aldrich Chemical Co., USA | C2759 | Add 20.46 mg CCCP to 10.0 mL DMSO,making up to the final of CCCP in a concentration of 10mM, aliquot and store at −80 °C. |
| 10 µM CCCP working solution | Add 10 mL of PBS to a 15 mL polypropylene centrifuge tube and add 10 μL CCCP stock solution, making up to the final of CCCP in a concentration of 10 µM. | ||
| 1 mM JC-1 stock solution | Sigma-Aldrich Chemical Co., USA | T4069 | JC-1 is purchased lyophilized. Add a small quantity of DMSO to the vial and vortex for several minutes until all the dye has dissolved. Transfer the solution to a light-tight tube and rinse the vial with appropriate volume of DMSO, making up to the final of JC-1 in a concentration of 1 mg/mL aliquot and store at −20 °C. |
| 37 °C incubator | Thermo Scientific, USA | ||
| 5 µM JC-1 working solution | Add 10 mL of PBS to a 15 mL polypropylene centrifuge tube and add 50 μL from a thawed JC-1 stock aliquot. Stir gently to assure a homogenous dilution. This solution must be stored in the dark and used promptly. | ||
| Accuri C6 Flow cytometer | BD Pharmingen, San Diego, CA, United States | ||
| Acid solution, pH 1.2 | Combine 20.0 mL of 2.0 N HCl (0.08 N), 4.39 g of NaCl (0.15 M), and 0.5 mL of Triton X-100 (0.1%) in H2O for a final volume of 500 mL. Adjust pH to 1.2 with 5 mol/L HCl. | ||
| Acridine Orange (AO) stock solution, 1.0 mg/mL | Polysciences, Inc, Warrington, Pa | 65-61-2 | Dissolve chromatographically purified AO in dd-H2O at 1.0 mg/mL. |
| AO staining solution (working solution) | Add 600 μL of AO stock solution to each 100 mL of staining buffer. | ||
| Biological safety hood | Airtech, USA | ||
| Computer-aided sperm analysis system (CASA ) | Microptic, Barcelona, Spain | Sperm Class Analyzer 5.3.00 | |
| Sperm Counting Chamber | Goldcyto, Spain | ||
| Equipments | |||
| FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I | BD Biosciences, San Jose, CA | 556547 | Included: (1) FITC Annexin V is bottled at 100 ng/µL; (2) Propidium Iodide (PI):The PI Staining Solution is composed of 50 µg PI/mL in PBS (pH 7.4) and is 0.2 µM sterile filtered; (3) 10x Binding Buffer: 0.1 M Hepes (pH 7.4), 1.4 M NaCl, 25 mM CaCl2. For a 1x working solution, dilute 1 part of the 10x Annexin V Binding Buffer to 9 parts of distilled water. Store at 4 °C and protected from prolonged exposure to light. Do not freeze. |
| FlowJo 10 | Tree Star, Inc., San Carlos, CA, USA | ||
| Horizontal centrifuge | Thermo Scientific, USA | ||
| liquid nitrogen tank | Thermolyne, USA | ||
| Materials | |||
| PBS | Beyotime, Shanghai, China | C0221A | Ready-to-use PBS buffers is purchased and stored at room temperature |
| Staining buffer, pH 6.0 | Combine 370 mL of 0.10 M citric acid buffer, 630 mL of 0.20 M Na2PO4 buffer, 372 mg of EDTA (disodium, FW = 372.24; 1 mM), and 8.77 g of NaC1 (0.15 M). Mix overnight on a stir plate to insure that the EDTA is entirely in solution. pH to 6.0 with saturated NaOH solution. | ||
| The reference sample for SCSA analysis | The reference sample was diluted with cold (4 °C) TNE buffer to a working concentration of 1–2 × 106 cells/mL, and used to set the green at 475/1,024 flow cytometry channels and set the red at 125/1,024 flow cytometry channels. | ||
| TNE buffer, 1x, pH 7.4 (working solution) | Combine 60 mL of 10x TNE and 540 mL of H2O. Check pH (7.4). | ||
| TNE buffer, 10x, pH 7.4 | Perfemiker, Shanghai, China | PM11733 | Ready-to-use buffers is purchased and stored at 4 °C. |
References
- Agarwal, A., Mulgund, A., Hamada, A., Chyatte, M. R. A unique view on male infertility around the globe. Reproductive Biology and Endocrinology. 13 (1), 1-9 (2015).
- Nachtigall, R. D. International disparities in access to infertility services. Fertility and Sterility. 85 (4), 871-875 (2006).
- Agarwal, A., Allamaneni, S. S. R. Sperm DNA damage assessment: a test whose time has come. Fertility and Sterility. 84 (4), 850-853 (2005).
- Peña, F. J., Ortega Ferrusola, C., Martín Muñoz, P. New flow cytometry approaches in equine andrology. Theriogenology. 86 (1), 366-372 (2016).
- Oosterhuis, G. J., et al. Measuring apoptosis in human spermatozoa: a biological assay for semen quality. Fertility and Sterility. 74 (2), 245-250 (2000).
- Koopman, G., et al. Annexin V for flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on B cells undergoing apoptosis. Blood. 84 (5), 1415-1420 (1994).
- Freitas, M. J., Vijayaraghavan, S., Fardilha, M. Signaling mechanisms in mammalian sperm motility. Biology of Reproduction. 96 (1), 2-12 (2017).
- Lehti, M. S., Sironen, A. Formation and function of sperm tail structures in association with sperm motility defects. Biology of Reproduction. 97 (4), 522-536 (2017).
- Durairajanayagam, D., Singh, D., Agarwal, A., Henkel, R. Causes and consequences of sperm mitochondrial dysfunction. Andrologia. 53 (1), 13666 (2021).
- Agnihotri, S. K., et al. Mitochondrial membrane potential (MMP) regulates sperm motility. In Vitro Cellular and Developmental Biology. Animal. 52 (9), 953-960 (2016).
- Smiley, S. T., et al. Intracellular heterogeneity in mitochondrial membrane potentials revealed by a J-aggregate-forming lipophilic cation JC-1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (9), 3671-3675 (1991).
- Evenson, D. P., Darzynkiewicz, Z., Melamed, M. R. Relation of mammalian sperm chromatin heterogeneity to fertility. Science. 210 (4474), 1131-1133 (1980).
- Evenson, D. P., Djira, G., Kasperson, K., Christianson, J. Relationships between the age of 25,445 men attending infertility clinics and sperm chromatin structure assay (SCSA®) defined sperm DNA and chromatin integrity. Fertility and Sterility. 114 (2), 311-320 (2020).
- Evenson, D. P. Sperm chromatin structure assay (SCSA®). Methods in Molecular Biology. 927, 147-164 (2013).
- Agarwal, A., Said, T. M. Role of sperm chromatin abnormalities and DNA damage in male infertility. Human Reproduction Update. 9 (4), 331-345 (2003).
- Ricci, G. Apoptosis in human sperm: its correlation with semen quality and the presence of leukocytes. Human Reproduction. 17 (10), 2665-2672 (2002).
- Zhang, H. -. B., et al. Early apoptotic changes in human spermatozoa and their relationships with conventional semen parameters and sperm DNA fragmentation. Asian Journal of Andrology. 10 (2), 227-235 (2008).
- . WHO laboratory manual for the examination and processing of human semen Available from: https://www.who.int/publications/i/item/9789240030787 (2022)
- Evenson, D. P., Wixon, R. Environmental toxicants cause sperm DNA fragmentation as detected by the Sperm Chromatin Structure Assay (SCSA). Toxicology and Applied Pharmacology. 207 (2), 532-537 (2005).
- Wang, Y. X., et al. Phthalate exposure in association with serum hormone levels, sperm DNA damage and spermatozoa apoptosis: A cross-sectional study in China. Environmental Research. 150, 557-565 (2016).
- Ni, W., et al. Diurnal variation in sperm DNA fragmentation: analysis of 11,382 semen samples from two populations and in vivo animal experiments. Chronobiology International. 36 (11), 1455-1463 (2019).
