エチレンジアミン四酢酸媒介接着消によるフィーダー細胞上のヒト多能性幹細胞の迅速で費用対効果の高い酵素フリー継代
Summary
フィーダー細胞で培養したヒト胚性幹細胞(hESC)およびヒト人工多能性幹細胞(iPS細胞)の酵素的または機械的継代に伴う制限を回避するため、EDTAを介した接着除去を使用して、ヒト包皮線維芽細胞のフィーダー細胞層上に維持されたヒトES細胞またはiPS細胞コロニーを採取するための迅速、効果的、費用対効果の高い、高収率の方法を確立しました。
Abstract
ヒト多能性幹細胞(ヒト胚性幹細胞(ヒトES細胞、ヒト人工多能性幹細胞、iPS細胞)は、もともと異なる種類のフィーダー細胞で培養し、長期培養で未分化な状態を維持していました。このアプローチは、フィーダーフリーの培養プロトコルに大きく取って代わられていますが、これらはより高価な試薬を必要とし、細胞の分化能力を制限するプライミング状態への移行を促進する可能性があります。フィーダーおよびフィーダーフリーのいずれの条件においても、継代のためのヒトES細胞またはヒトiPS細胞コロニーの採取は、培養を拡大するために必要な手順です。
フィーダー細胞で培養したヒトES細胞/iPS細胞を簡便かつ高収率で継代するために、カルシウムキレート剤であるエチレンジアミン四酢酸(EDTA)による接着除去を利用した回収法を確立しました。このアプローチを、顕微鏡下でメスでコロニーを単離する元の機械的採取アプローチと比較することにより、得られた継代細胞の収量と品質を評価しました(酵素回収に関連する試薬のばらつきを避けるために、比較対象として機械的採取を選択しました)。
1組の実験では、ヒト包皮線維芽細胞のフィーダー細胞層上に2つの異なるhESC株が維持されました。各系統は、EDTAベースまたは機械的収穫を使用して複数の継代にかけられ、コロニーのサイズと形態、細胞密度、幹細胞マーカーの発現、胚様体の3つの胚葉への分化、およびゲノム異常について評価されました。別の実験では、2つの異なるiPS細胞株でEDTAベースの採取を行い、同様の結果が得られました。EDTAによる接着除去は、機械的収穫と比較して、時間を節約し、より好ましいサイズとより均一な形態のコロニーのより高い収率をもたらしました。また、酵素による回収よりも迅速で、酵素バッチのばらつきが生じにくい。また、EDTAによる接着除去法は、ヒトESC/iPS細胞株をフィーダー細胞ベースの培養物からフィーダーフリー状態に移行し、下流での使用や分析に役立てることができます。
Introduction
ヒトES細胞およびヒトiPS細胞の in vitro での適切な維持は、ヒト細胞および発生生物学におけるいくつかの研究分野にとって基本的で便利な方法論です。ヒトES細胞やヒトiPS細胞には本来備わっている分化の原動力となるため、 in vitroで 未分化状態を維持することには、特別な注意と注意が必要です。したがって、方法論のばらつきをできるだけ少なくして、ヒトES細胞およびiPS細胞の維持と継代のための費用対効果の高いプロトコルを開発することは、一般的に非常に有用です。
もともと、ヒトES細胞とiPS細胞は、未分化状態の長期培養と維持を助けるために、異なる種類のフィーダー細胞で培養されていました1,2,3。最近では、フィーダーフリー条件下での培養が標準となり、フィーダー細胞の取り扱いを完全に回避しています4。しかし、一部の研究室や中核施設では、いまだにフィーダー細胞でヒトES細胞やiPS細胞を培養しています。フィーダーフリー培養は、特殊な組成の培地の使用と、コロニーの接着を確実にするために培養表面の何らかの形態のコーティング(主要な細胞外マトリックス[ECM]成分または市販のECM化合物、または市販のコーティングされたプレートの使用)を必要とするため、より高価です。この費用は些細なことではなく、ヒトES細胞やiPS細胞を用いた研究開発に関心のある一部の研究室にとっては、財政的な障害となる可能性があります。さらに、フィーダーフリー条件下での培養は、ヒトES細胞やヒトiPS細胞をフィーダー細胞よりもナイーブでない状態に追いやる傾向があり5、これがその後の分化を損ない、遺伝的変異につながる可能性がある6。
歴史的に、フィーダー細胞で培養されたヒトES細胞およびiPS細胞の継代には、メスを使用して顕微鏡下でコロニーを切除する機械的採取が含まれていましたが7、これは後に、コロニーまたは解離細胞を分離するための穏やかな掻き取りの有無にかかわらず、酵素消化に大きく取って代わられました。機械的な採取は面倒で、精密なマイクロサージェリーが必要です。酵素収穫は、バッチ間の酵素の違いにより効率が異なり、完全な解離を好む傾向があり、ROCK阻害剤によって打ち消されない限り細胞死を促進し8,9、異常な核型の発生率を増加させます9。
ヒトES細胞やヒトiPS細胞をフィーダー細胞で培養するコストの低さと分化の可能性を活かし、機械的・酵素的採取のデメリットを回避しつつ、EDTAを介した接着除去法を用いて、ヒト包皮線維芽細胞のフィーダー層上に維持されたヒトES細胞およびiPS細胞コロニーを、迅速、効果的、低コスト、高収率で採取する方法を確立しました。収量、ばらつき、幹細胞の品質を、機械的採取で得られたものと比較しました(このアプローチにはばらつきが伴うため、酵素消化とは比較しませんでした)。EDTAを介した接着除去は、下流での使用や分析に必要な場合、フィーダーベースの培養からフィーダーフリーの状態にコロニーを移すのにも適していることに留意します。この方法は、EDTAによる接着除去がフィーダーフリー培養に採用されている一般的なアプローチであるため、一貫した継代法によるトランジションを提供します。
Protocol
Representative Results
Discussion
我々は、EDTAを介した接着除去を用いてフィーダー細胞上で培養したヒトES細胞およびヒトiPS細胞を迅速かつコスト効率よく回収する方法について説明し、これを主にメスを用いた従来の機械的採取方法と比較しました。また、EDTAベースの捕獲と酵素捕球を、方法の速度に関して比較したが、結果として得られるコロニーの品質の側面については比較しなかった。その理由は、酵素採取は本質的に変動が激しく、ゲノム異常の有病率が高いことと関連しており5、方法間の違いが不明瞭になる可能性があるためです。
EDTAベースの収穫は、他の方法のいずれよりも高速かつ効率的であり、機械的捕獲よりも小さく、形態学的により均質なコロニーを生成することを実証しました。この後者の特徴は、機械的採取で得られた大きな塊は中枢壊死を起こしやすく、酵素消化は単離されたヒトES細胞やiPS細胞を生成する傾向があり、アポトーシスを起こしやすく、生き残るためにROCK阻害剤などの追加の処理を必要とするため、細胞の生存に関して有益です。EDTAベースのハーベスティングは、少なくとも20継代に使用できます。コロニー細胞密度、幹細胞遺伝子のmRNAおよびタンパク質発現、胚様体の3つの胚葉層の分化、およびゲノム異常に関しては、EDTAベースのメカニカルハーベスティング法と機械的ハーベスティング法は同等です。ヒトES細胞およびiPS細胞の効率、収量の向上、変動の低減、およびより穏やかな取り扱いが目的であれば、EDTAベースの採取が望ましい。
また、フィーダー細胞で培養したヒトES細胞およびiPS細胞のEDTAベースの採取は、よりナイーブな状態を維持するための安価な方法であり、フィーダーベースの培養からフィーダーフリーの培養へのスムーズな移行が望ましいことにも注目しています。
プロトコル内の重要なステップ
EDTAを介した接着除去の最も重要なステップは、プロトコルセクション3(EDTA溶液中でのインキュベーション)とセクション4(トリチュレーション)です。EDTA溶液への曝露が1分を超えると、単一細胞への完全な解離のリスクが高まります。これは、トリチュレーションが長引いたり、過酷すぎたりする場合にも発生する可能性があります。後者はピペットチップのサイズの影響を受けます。ここで説明するように、1 mLの細胞培養ピペットを使用するのが理想的です。チップ径の小さい別のタイプのピペットを使用することは危険です。
トラブルシューティング
フィーダー細胞が増殖し続ける場合、有糸分裂停止は効果的ではなく、新しいバッチを採取して手順を再開する必要があります。コロニーがフィーダー細胞層から緩まない場合は、EDTAにCa2+ が含まれていないこと、およびコロニーを含む培養皿をPBSでよくすすぎ、EDTAを添加する前に残っている細胞培養培地を除去する必要があります。解離が多すぎると、孤立した細胞や小さすぎる細胞塊が生成され、過度の粉砕によって生じ、新しいコロニーの形成が損なわれる可能性があります。粉砕の程度は、結果として生じる細胞塊が直径が~60μmであることを確認するために、プロトコルの試運転で経験的に決定されるべきです。特にヒトES細胞/iPS細胞の採取準備が整う前に、フィーダー層が培養皿から自然に剥離する場合は、フィーダー細胞が調製後~7日以内に使用されていないことが原因である可能性があります。したがって、フィーダーセルの使用時間枠は注意深く監視する必要があります。EDTA曝露中にフィーダー層が解離した場合(ここで使用したフィーダー細胞では観察されたことがありません)、フィーダー細胞の種類または培養方法を変更する必要があります。
この手法の限界
この技術の主な制限は、成功した結果を得るために接着除去プロセスを目視検査する必要があることです。つまり、ユーザーは、フィーダーセル層からコロニーが放出され、フィーダーセル層が基質から緩むタイミングを識別する方法を学ぶ必要があります。ただし、これは難しいことではなく、私たちの経験では、この手法の新しいユーザーは、数回の試行で習得できます。
また、採取されたヒトES細胞やiPS細胞が、少数のフィーダー細胞によって汚染されている可能性も内在しています。非フィーダー条件に移したり、アッセイのためにヒトES細胞やiPS細胞を単離したりすることを意図している場合、そのような汚染は純度を損なうことになります。ここで用いるフィーダー細胞(ヒト包皮線維芽細胞)では、酵素消化(図示せず)を用いてもフィーダー細胞層を解離させることは極めて困難であることに留意する。 totoでは未解離のフィーダー細胞層が除去されるため、採取したヒトES細胞やiPS細胞の汚染は無視できる程度です。さらに、フィーダー細胞は有糸分裂的に停止しているため、ヒトES細胞やiPS細胞の継代が進むと、汚染は最終的にゼロに減少します。
既存の手法に対する意義
ヒトES細胞やiPS細胞の培養は、現在、フィーダーフリーの培養が主流であり、継代にEDTAを使用することが広く行われています。フィーダーフリー培養は、接着性を保証する特別に調合された培地と培養基質の使用に依存します。これらの試薬には、ラボの予算を超える可能性のある追加費用が伴います。さらに、フィーダーフリー条件下での培養は、フィーダーフリー培地に特定の因子がないこと、およびその結果としてナイーブ状態からプライミング状態への移行により、分化能が乱れることと関連しています。有糸分裂的に停止したフィーダー細胞での増殖は、この移行を回避し、全体的なコストを管理可能なレベルまで下げることができるため、実験室研究における多能性幹細胞のより広範な使用が促進されます。
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
予備実験中のLars Moen氏のご協力と、オスロ大学病院のNorwegian Center for Stem Cell ResearchのNorwegian Core Facility for Human Pluripotent Stem Cellsにご協力いただき、感謝いたします。H9 hESCラインはWiCellから入手し、HS429 hESCラインはカロリンスカ研究所のOuti Hovattaから入手した。どちらも材料移転契約に従って使用されました。NCS001およびNCS002 iPS細胞株は、ノルウェーのヒト多能性幹細胞コアファシリティによって作製されました。この再プログラミングとここで報告されたすべての作業は、ノルウェー南東部地域倫理委員会(承認REK 2017/110)の承認を得て実施されました。
Materials
| 0.5 M EDTA pH 8.0 | Invitrogen | 15575020 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Sarstedt | 62.554.502 | |
| 2-mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | |
| 50 mL centrifuge tubes | Sarstedt | 62.547.254 | |
| Basic fibroblast growth factor (bFGF) | PeproTech | AF-100-18B-250UG | |
| Brand Bürker Chamber | Fisher Scientific | 10628431 | |
| Disposable scalpels no.15 | Susann-Morton | 505 | |
| DPBS (1x) without Ca/Mg | Gibco | 14190-094 | |
| Easy Grip tissue culture dish, 35 x 10 mm | Falcon | 353001 | |
| Eppendorf pipette 1 mL | Eppendorf | ||
| Eppendorf pipette 200 μL | Eppendorf | ||
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Gibco | 10270-106 | |
| Filter tip 1,000 μL | Sarstedt | 70.1186.210 | |
| Filter tip 200 μL | Sarstedt | 70.760.211 | |
| Gamma Cell 3000 ELAN irradiation machine (alternatively, use Mitomycin C to arrest proliferation) | Best Theratronics | BT/MTS 8007 GC3000E | |
| Glutamax 100x | Gibco | 35050-038 | |
| Growth Factor Reduced Matrixgel | Corning | 734-0269 | |
| H9 hESC line | WiCell | WAe009-A | |
| hPSC Genetic Analysis Kit | Stem Cell Technologies | #07550 | |
| HS429 hESC line | ECACC | KIe024-A | |
| Human Foreskin Fibroblasts -CRL2429 line | ATTC | CRL2429 | |
| IMDM (1x) | Gibco | 21980-032 | |
| iPSC lines | Norwegian Core Facility for Human Pluripotent Stem Cells | NCS001 & NCS002 | |
| Knockout DMEM | Gibco | 10829-018 | |
| Laser Scanning Confocal Microscope or equivalent (we use the LSM 700 from Zeiss) | Zeiss | ||
| Microscope | CETI | ||
| Mitomycin C | Sigma Aldrich | M4287 | |
| Non-essential amino acids (NEAA) | Gibco | 11140.035 | |
| Pipettes, plastic 10 mL | Sarstedt | 86.1254.001 | |
| Pipettes, plastic, 5 mL | Sarstedt | 86.1253.001 | |
| Serum Replacement (SR) | Gibco | 10828-028 | |
| Sterile filters 0.22 um | Sarstedt | 83.1826.102 | |
| T-75 culture flask | ThermoScientific | 156499 | |
| Trypan Blue Stain (0.4 %) | Gibco | 15250-061 | |
| Trypsin-EDTA, 500 mL | Gibco | 25300062 |
References
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